非致病性尖镰孢FO47的原生质体融合改良研究

【目的】改良非致病性尖镰孢FO47的综合性状,获得具有较好防效的生防菌株。【方法】利用原生质体融合技术,将非致病性尖镰孢FO47和生防放线菌153进行融合,通过形态特征和菌落直径生长情况对融合菌株进行初筛,并采用西瓜苗期生长发育、防病效果和抗药性试验对所获得的初筛菌株进行复筛。【结果】筛选出14株菌落直径较FO47生长快的再生菌株,其中菌株F1-35、F1-38、F1-1和F1-41能够促进幼苗生长,菌株F1-35处理西瓜幼苗后单株鲜质量较FO47提高了36.93%,根长较FO47增加了19.07%。菌株F1-35、F1-38和F1-4对西瓜枯萎病的防治效果超过50%,其中菌株F1-35的防治效果最好,达到59.04%。菌株F1-4对多菌灵表现出较高的抗性,说明菌株F1-4可以与低质量浓度多菌灵混合使用防治西瓜枯萎病。【结论】筛选出3株综合性状得到提高的再生菌株,说明原生质体融合是改良生防菌株的有效手段。     

不同生防放线菌组合防治枯、黄萎病研究

【目的】探讨优良放线菌及其组合对西瓜枯萎病和茄子黄萎病的生物防效,筛选出具有良好防效和促生作用的复合菌株。【方法】采用离体抑菌作用测定法和温室人工接菌法,研究不同生防放线菌及其组合对西瓜枯萎病和茄子黄萎病的防效和促生效果。【结果】离体抑菌作用测定结果表明,菌株SC11和SE2的菌体、发酵液和发酵滤液对大丽轮枝菌和西瓜枯萎菌均表现出显著的抑制作用,孢子萌发抑制率高;盆栽试验表明,菌株SC11和SC1复配的C2组合对西瓜枯萎病和茄子黄萎病防效显著,防效分别达到84.93%和71.48%,且高于各菌株单一使用的效果;C3组合的发酵液对西瓜的株高、叶面积和叶绿素含量等生理指标影响突出,经C3处理后的西瓜根系还原强度值最大,对茄子的促生作用仅次于菌株SF6。【结论】生防放线菌组合的防病促生作用优于单个菌株,组合菌株间通过协同作用可达到优势互补,只有全面考虑各菌株的习性并进行合适的组合,才能充分发挥其生防效果。     

西瓜枯萎病菌和哈茨木霉的GFP标记及根部动态定殖比较

为明确西瓜枯萎病菌和生防哈茨木霉在西瓜根部动态定殖的差异,采用PEG-CaCl₂介导的原生质体转化法,将携带绿色荧光蛋白基因的pCT74质粒分别与尖镰孢菌西瓜专化型和哈茨木霉M3菌株的基因组整合获得相应的转化子;将转化子接种于土壤,利用激光共聚焦显微镜示踪并比较两菌株转化子对西瓜幼苗根部的侵染动态过程。结果表明,转化子连续传代6次仍能发出绿色荧光且荧光强度稳定,能够稳定遗传,经PCR验证绿色荧光蛋白基因转入成功。盆栽试验中,两种转化子均能成功定殖于西瓜幼苗根部,在定殖初期,尖镰孢菌西瓜专化型在根内的扩散速度快于哈茨木霉M3菌株。     

黄瓜枯萎病拮抗菌株的防病促生性能鉴定

【目的】有效防治设施黄瓜枯萎病,促进我国黄瓜产业的持续健康发展。【方法】通过对筛选得到的枯萎病拮抗菌株的促生性能进行鉴定,并开展黄瓜幼苗栽培试验,验证所试拮抗菌株对黄瓜幼苗枯萎病的防效。【结果】所试8株拮抗细菌均具一定的促生性能,菌株固氮酶活性、有机磷溶磷量和分泌IAA浓度范围分别为133.97～876.83 nmol (C₂H₄)/(h·m L)、14.14～20.08μg/m L、3.43～17.78μg/m L,其中促生性能较好的有抗生素溶杆菌42-3、唐菖蒲伯克霍尔德菌L1-3、少动鞘氨醇单胞菌L5-4和蜡样芽孢杆菌L3-1。栽培试验结果显示,唐菖蒲伯克霍尔德菌L1-3和少动鞘氨醇单胞菌L5-4对黄瓜幼苗枯萎病的防治效果最好,发病率仅为24.83%,防治效果分别为36.67%和42.67%。唐菖蒲伯克霍尔德菌L1-3对幼苗的促生效果更优,有助于黄瓜抗氧化酶活性提高。【结论】相较其他菌株,唐菖蒲伯克霍尔德菌L1-3对黄瓜幼苗枯萎病的防效更优,促生效果显著,可用于在实际生产中防治黄瓜枯萎病及其他土传病害,具有很大的研究价值。     

SC11生防菌剂及其不同复配对西瓜和茄子防病促生作用

基于时间与空间动态概念探究生防菌SC11不同剂型对茄子防病促生效果,生防菌SC11与Fo47、153粉剂复配对西瓜枯萎病的防治效果。结果表明,菌株SC11不同剂型处理对茄子黄萎病具有明显的防效,其中以种衣剂处理防效最优(69.98%),接近药剂对照多菌灵。同时,SC11不同制剂能显著增加茄子叶面积、株高或鲜质量,与对照相比,SC11种衣剂处理的叶面积、株高分别提高129.64%、100.84%,粉剂处理的株高、鲜质量增幅分别为69.64%、116.29%。SC11施用后30d施用153(C2处理),对西瓜枯萎病的防效达89.47%,远高于其他处理。SC11和Fo47同时施用时,防效最低,低于单独施用的防效。初步确定SC11不同剂型对茄子的促生作用及其对茄子黄萎病的防治效果,明确基于动态时空防治西瓜枯萎病的生防菌复配组合,间隔施用能有效提高复配防效。     

生防菌肥对西瓜枯萎病的防治效果研究

以常规施肥为对照,探讨生防菌肥、石灰氮等对西瓜枯萎病的防治效果,结果表明:施用生防菌肥能有效降低西瓜枯萎病发生率,提高西瓜产量,而施用石灰氮对西瓜枯萎病的防治效果不明显。     

球毛壳菌与枯草芽孢杆菌组合对抗黄瓜枯萎病防御酶活性的影响

黄瓜枯萎病是一种毁灭性的土传真菌病害,其病原菌为尖孢镰刀菌黄瓜专化型(Fusarium oxysporum f. sp. cucumerinum),在黄瓜整个生长周期均可发生。本试验研究球毛壳菌(Chaetomium globosum)菌株ND35与枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)菌株J2组合对黄瓜苗期枯萎病的防治效果,并对生防菌处理条件下黄瓜的根系活力、防御酶活性及防御酶相关基因表达进行初步研究。结果显示,球毛壳菌ND35处理对黄瓜枯萎病的防效为25.36%,枯草芽孢杆菌J2处理对黄瓜枯萎病的防效为54.27%,菌株ND35与菌株J2组合处理对黄瓜枯萎病防效达到70.02%。病原菌胁迫下,生防菌组合处理的黄瓜叶片CAT、SOD、POD、PAL和PPO活性明显提高,峰值分别达91.60、3 239.15、165.80、201.03、256.38 U/gFW;与上述酶活力相关的酶活基因相对表达水平峰值分别为2.94、2.39、5.01、4.49和7.96,分别达到病原菌处理下酶活基因表达量的3.27倍、6.98倍、98%、5.27倍、 2.31倍。组合处理下黄瓜根系活力、平均防御酶活性和相关酶活基因表达水平总体高于单一生防菌处理。综之,生防菌组合对黄瓜枯萎病的防治效果高于单一生防菌防治效果。该结果可为复合微生物防治黄瓜苗期枯萎病提供理论支持。     

绿色荧光蛋白基因标记芒果畸形病病原菌研究

芒果畸形病是世界性的芒果重要病害。采用PEG介导的原生质体转化法用绿色荧光蛋白(GFP)表达载体(pCT74-sGFP)转化芒果畸形病病原菌(Fusarium proliferatum),获得了表达GFP的转化子。转化子经过单孢纯化后连续继代培养仍能发出稳定而强烈的荧光,通过GFP特异性引物PCR扩增转化子基因组获得预期片段,表明GFP基因已成功转入芒果畸形病病原菌基因组中且稳定遗传。GFP标记菌株生长正常,致病性和野生菌丝无差别。获得GFP标记的转化子,为应用发绿色荧光的芒果畸形病病原菌研究病原菌的侵染方式、扩展过程等奠定了基础。     

铁载体产生菌Paenibacillus illinoisensis YZ29在花生根际定殖能力研究

利用绿色荧光蛋白(GFP)标记靶微生物是目前研究微生物和宿主相互作用的重要手段。在本研究中,研究者用电击转化的方法将穿梭载体p GFP4412导入铁载体产生菌伊利诺伊类芽孢杆菌(P.illinoisensis)YZ29中,并得到成功表达GFP的YZ29-gfp菌株。利用双抗平板筛选并结合荧光显微镜观察的方法检测了铁载体产生菌YZ29在花生根部及土壤中定殖情况。结果表明:标记菌株在激发光波长为488 nm的蓝光下可观察到绿色荧光;盆栽情况下YZ29-gfp可以在花生根际土和非根际土中定殖;实验室培养条件下其在花生根表定殖,在根内部没有定殖。说明,YZ29能在花生根际有效定殖,为其促生和生防作用奠定了基础。     

苦瓜枯萎病生防细菌ZB36的分离鉴定及其定殖特性研究

【目的】筛选并鉴定对苦瓜枯萎病具有稳定拮抗活性的生防菌株,明确其在苦瓜植株上的定殖特性。【方法】从山东省淄博市耕作地采集土壤样品,以苦瓜枯萎病菌为靶标,通过梯度稀释涂布平板法分离、纯化,获得1株具有稳定拮抗活性的纯培养细菌,命名为ZB36。根据菌株形态学特征、生理生化特性,以及16S rRNA基因和gyrA保守基因序列分析进行菌株鉴定。通过抗生素抗性标记法获得遗传特性和拮抗活性稳定的利福平标记菌株ZB36^R,并对其在苦瓜上的定殖特性进行探究。【结果】菌株鉴定结果表明,ZB36为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)。盆栽试验结果表明,ZB36不仅对苦瓜枯萎病具有显著的防治效果,防效高达74.76%,而且对苦瓜植株也具有显著促生作用,接种ZB36后苦瓜地上部鲜重和株高分别提高了28.65%和22.48%。定殖试验结果表明,ZB36在苦瓜根、茎和叶中均能定殖,且在接种后28 d仍能在这些组织中稳定定殖。【结论】贝莱斯芽孢杆菌ZB36不仅对苦瓜枯萎病具有良好的防治和促生效果,同时也具有较强的定殖能力,具备作为苦瓜枯萎病生防细菌资源开发利用的潜力。     

生防菌枯草芽孢杆菌CQBS03的绿色荧光蛋白基因标记及其在柑橘叶片上的定殖

【目的】利用绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein,GFP)基因标记枯草芽孢杆菌生防菌株CQBS03,以研究其在柑橘叶片上的定殖规律。【方法】采用重叠PCR方法将p43启动子和gfp进行融合,并与大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭载体pHY300PLK连接构建重组质粒pHY43G,以重组质粒电脉冲转化生防菌株CQBS03,培养后于荧光显微镜下观察并通过SDS-PAGE分析工程菌株GFP的表达情况,然后进行工程菌株对柑橘溃疡病菌的抑菌试验、生长动力学分析、稳定性测试。采用叶片喷雾方法接种,平皿稀释分离培养方法测定CQBS03-pHY43G在柑橘叶片上的定殖情况。【结果】重组菌CQBS03-pHY43G高效表达GFP,电泳后出现约29kDa的特异蛋白条带,外源质粒对宿主菌的生长未带来明显不利影响,质粒稳定性实验表明重组质粒pHY43G经30次传代后的稳定性为55%,室内平板抑菌实验结果显示CQBS03-pHY43G对柑橘溃疡病菌生防效果与出发菌株没有明显差异(P0.01),CQBS03-pHY43G菌株在叶片喷雾接种后的0—15d,在柑橘叶片上的数量呈现急剧下降趋势,15d后下降速度稍缓,最后保持相对稳定的较低水平(1.73×103cfu·g-1)。【结论】成功地将gfp转入野生型枯草芽孢杆菌生防菌CQBS03中,构建了荧光标记菌株,初步明确了生防菌的定殖规律。     

盐穗木HcGKR基因亚细胞定位表达载体的构建及定位分析

[目的]以GFP基因为报告基因,构建HcGKR基因的亚细胞定位表达载体.[方法]采用PCR方法和基因枪法.[结果]用PCR法,以pGEM- T- HcGKR质粒为模板,获得HcGKR基因的目的片段.然后将其克隆到亚细胞定位表达载体35S:GFP中,获得由CaMV35S启动子调控目的基因的35S - GFP - HcGKR融合表达载体,使目的基因能够和GFP融合同时表达.采用基因枪法将35S - GFP - HcGKR转化到洋葱表皮细胞中,暗培养24 h后,经共聚焦显微镜观察确定发出绿色荧光的位置,对HcGKR基因进行亚细胞定位.[结论]构建的亚细胞定位表达载体可在植物细胞中表达,通过洋葱细胞中绿色荧光的位置确定目的基因定位在细胞膜上,为进一步盐穗木HcGKR基因的功能奠定了理论基础.     

几株尖孢镰刀菌的绿色荧光蛋白基因转化

利用PEG介导的原生质体转化方法,将绿色荧光蛋白基因转入到6株香蕉枯萎病菌和1株棉花枯萎病菌中。结果表明:转化子连续转接5代能够稳定遗传,荧光强度良好,PCR验证gfp基因已转入到菌株中,为后续研究香蕉枯萎病菌和棉花枯萎病菌的侵染、防治等提供可视化的检测和分析手段。     

枯草芽孢杆菌生防菌株SEM-9根际定植及对根际土壤微生物多样性的影响

【目的】研究枯草芽孢杆菌生防菌株SEM-9在作物根际的定植规律及对根际土壤微生物多样性的影响。【方法】通过自然转化法对SEM-9菌株进行绿色荧光蛋白标记，利用倒置荧光显微镜观察该菌株在作物根际土壤、根表面及根系内组织的定植情况；并以土传病害土壤为试验对象，通过高通量测序初步分析SEM-9菌株处理后根际土壤中微生物多样性的变化。【结果】构建了稳定表达绿色荧光蛋白的重组菌株SEM-9-pGFP₂₂。荧光显微镜观察结果表明，SEM-9-pGFP₂₂重组菌株可以在根际土壤和根表面定植，但是无法在根内组织或细胞内定植。SEM-9菌液处理显著降低了黄瓜土传病害的发病率，提高了根际土壤真菌微生物的多样性。【结论】成功建立了SEM-9菌株的GFP标记方法，明确了该菌株的根际定植规律及对黄瓜土传病害的防治效果，为后期开发替代型微生物肥料奠定了基础。     

苎麻生长素结合蛋白BnABP1与GFP融合在烟草中的表达

运用已克隆的苎麻生长素结合蛋白BnABP1基因cDNA及植物表达载体pCAMBIA1300 GFP,构建了35S启动子控制的苎麻BnABP1基因编码区段与绿色荧光蛋白(GFP)基因融合表达重组体(pCAMBIA1300 GFP BnABP1)。通过根癌农杆菌介导法将其转化烟草WS38,经抗性筛选和PCR检测获得了转基因烟草。对转基因烟草细胞进行荧光显微镜观察,发现在细胞质膜和内膜系统上都有较强烈的荧光信号,进一步证明苎麻生长素结合蛋白ABP1已结合在细胞的膜系统上。     

广谱拮抗菌B96-II启动子的克隆研究

[目的]构建拮抗菌B96-Ⅱ的启动子文库,为B96-Ⅱ的绿色荧光蛋白标记提供试验基础。[方法]提取拮抗菌B96-Ⅱ的基因组DNA,以绿色荧光蛋白基因（gfp）为报告基因,以启动子探针pNW33N-gfp为载体,通过鸟枪法在E.coliDH5α中构建B96-Ⅱ的启动子文库。[结果]通过筛选获得了21个阳性克隆,编号为P1~P21,这些阳性克隆在荧光显微镜下发出明亮的绿色荧光。研究表明,在热激时间为90 s、用4μl酶连产物原液进行转化时,所得转化子数量最多,平均每平皿可得到167个转化子。[结论]表达绿色荧光蛋白的B96-Ⅱ启动子文库的成功构建为拮抗菌B96-Ⅱ的绿色荧光蛋白标记和环境行为研究奠定了良好的基础。     

CaCl2和水杨酸对昼间亚高温胁迫下番茄叶片光合作用的影响

以"辽园多丽"番茄品种(Lycopersicon esculentum Mill.)为试材,在第1花序第1花开花当天进行昼间亚高温(35℃)胁迫处理,并喷施10 mmol/L CaCl2和0.2 mmol/L水杨酸(SA)水溶液.以25℃喷施清水为对照,研究叶片净光合速率,叶绿素荧光参数和保护酶活性(SOD和POD)的变化情况,探讨CaCI2和水杨酸对番茄耐哑高温特性的调控作用.结果表明,亚高温胁迫处理使叶片净光合速率下降,气孔导度和胞间CO2浓度略有升高,PSII最大光化学效率(Fv/Fm)和电子传递速率(ETR)降低,说明不是气孔因素导致光合速率的下降.而亚高温条件下喷施10 mmol/L的CaCI2和0.2 mrnol/L的SA可以显著提高净光合速率、保护酶活性和PSII最大光化学效率.在处理结束时,使这些指标达到或超过对照水平.CaCI2主要是通过提高气孔的开放程度和防止光合机构的破坏来提高光合速率的,而水杨酸主要是通过改善光合机构的性能提高光合速率的.     

农杆菌介导瞬时沉默小麦HCP1的研究

【目的】建立农杆菌介导的瞬时沉默小麦HCP1的方法,为简便、快速、高效地研究小麦基因功能提供一种可靠的技术支持。研究HCP1在叶锈菌侵染过程中对H₂O₂的清除作用,为阐明小麦抗叶锈菌侵染中信号转导机制奠定理论基础。【方法】采用农杆菌注射法,将携带有peGFP载体的农杆菌注射到小麦叶片中,观察叶片中荧光强度及分布,分析外源质粒在小麦叶片中的表达情况。通过注射EHA105、LBA4404和C58C1 3种不同的农杆菌菌株,将HCP1的RNAi载体导入小麦叶片细胞中,利用半定量RT-PCR和实时荧光定量PCR检测HCP1瞬时沉默效率,并结合Rohringer染色分析,明确不同农杆菌对寄主叶片侵染能力的强弱,从而筛选出最适的试验菌株。在瞬时沉默的小麦叶片上,接种不亲和叶锈菌小种260,利用DAB染色,观察接种叶锈菌后叶片中H2O2的变化,分析HCP1在小麦与叶锈菌互作过程中的功能。【结果】叶片GFP荧光观察结果说明,在注射农杆菌48 h后GFP开始出现较高表达。RT-PCR和qRT-PCR结果表明,注射C58C1菌株的叶片12 h后,HCP1的表达量开始降低,并持续保持较低的表达量。注射EHA105菌株的叶片,在注射后72-96 h,HCP1的表达量迅速降低。而注射LBA4404菌株的叶片中HCP1的表达量基本没有变化。所以在3种不同农杆菌菌株介导的HCP1 RNAi转化中,沉默效率依次为：C58C1≥EHA105＞LBA4404。注射不同农杆菌菌株叶片的Rohringer染色结果发现,EHA105侵染后引起的HR反应较其他两种菌株明显,说明EHA105对小麦叶片具有较高毒性,会引起叶片产生防卫反应,C58C1菌株在具有较高的沉默效率同时,对叶片的毒性较小,因此选取C58C1作为最适的试验菌株;沉默HCP1的小麦叶片接种叶锈菌小种260后,通过DAB染色发现,接种24 h和48 h后叶锈菌侵染诱发的小麦叶片H₂O₂的分布及积累量均多于对照组。【结论】建立了农杆菌介导的瞬时基因沉默体系,选用C58C1农杆菌菌株作为试验菌株,在处理后72 h可达到沉默目的基因的效果。确定HCP1参与了小麦与叶锈菌互作过程中H₂O₂的清除途径。     

植物枯萎病拮抗细菌KL-1菌株的分离及鉴定

[目的]筛选、鉴定植物枯萎病菌拮抗细菌,为植物枯萎病生防制剂的研究奠定基础。[方法]采用对峙培养法筛选对植物枯萎病菌具有良好抑制作用的生防细菌,通过Biolog细菌自动鉴定系统和16SrDNA序列分析法鉴定其分类地位,并研究该菌株对棉花和小鼠的安全性。[结果]从棉花根际土壤中分离出的12株细菌中,有5株对多隔镰刀菌、香石竹尖孢镰刀菌、棉花枯萎病菌具有拮抗活性;其中,KL-1菌株对3株目标病原菌的抑菌活性分别达69.09%、80.78%、78.89%。Biolog细菌自动鉴定系统和16SrDNA序列分析法鉴定结果表明,KL-1菌株为解淀粉芽孢杆菌;生物安全性初步测定结果表明,KL-1菌株对棉花和小鼠安全无毒。[结论]解淀粉芽孢杆菌KL-1菌株具有对多种植物枯萎病菌的抑菌活性,且对棉花和小鼠安全无毒,是一株具有研究和开发潜能的生防菌株。     

链格孢菌苹果致病型的ATMT转化体系的建立

【目的】链格孢菌（Alternaria alternate）苹果致病型是苹果上的重要致病菌,可以侵染苹果叶片和果实。论文旨在建立农杆菌介导的链格孢菌苹果致病型高效稳定的分子转化体系,为在分子水平上研究链格孢苹果致病型病菌的致病机制提供技术支持。【方法】质粒pKO1-HPH是以pCAMBIA1300骨架为基础构建的穿梭质粒,含有潮霉素抗性基因,并在其多克隆位点上插入了绿色荧光蛋白基因,这个质粒在大肠杆菌和农杆菌细胞中都能够稳定地复制繁殖。将质粒pKO1-HPH采用冻融法转化到农杆菌菌株AGL1中,然后与链格孢苹果致病型菌株XP-1的分生孢子在诱导培养基上共培养进行基因转化,转化子在含有潮霉素的马铃薯-葡萄糖-琼脂培养基上进行筛选;在含有50 μg·mL^-1潮霉素的马铃薯-葡萄糖-琼脂培养基上检测转化子细胞中抗性基因在转化子中的表达情况;用荧光显微镜检测绿色荧光蛋白基因在转化子细胞中的表达情况。在初步确认可以将绿色荧光蛋白和潮霉素B磷酸转移酶基因转入链格孢苹果致病型菌株中后,对菌落培养时间、转化前分生孢子的预处理方法对转化效率的影响进一步优化。转化子的稳定性采用分生孢子5次继代培养后,能否在含有潮霉素的马铃薯-葡萄糖-琼脂培养基上稳定生长来检测;采用PCR方法检测绿色荧光蛋白外源基因和潮霉素B磷酸转移酶基因是否存在于转化子基因组中;用Southern杂交检测外源基因在转化子基因组中插入的拷贝数;在苹果果实和叶片上接种检测转化子致病性的变化。【结果】将100 μL孢子悬浮液（含10⁵孢子）涂布于马铃薯-胡萝卜-琼脂平板上菌落培养36-48 h后,链格孢苹果致病型菌株XP-1可以产生足量的孢子用于农杆菌介导的分子转化。将分生孢子用无菌水洗下,在4℃处理6 h,再与含质粒pKO1-HPH的农杆菌进行诱导共培养,转化子在含有50 μg·mL^-1潮霉素的马铃薯-葡萄糖-琼脂培养基上进行筛选,转化效率较好,10⁷个分生孢子转化可获得约200个转化子。转化子经过5次继代培养,对潮霉素B的抗性没有改变。特异性引物PCR检测表明外源基因能够成功地整合到供试菌株的基因组中;Southern杂交表明外源基因多以单拷贝形式随机插入到链格孢苹果致病型菌株XP-1细胞的基因组中;转化子的菌丝和分生孢子在荧光显微镜下可以观察到明显的绿色荧光,说明荧光蛋白基因在菌丝及孢子中均能够成功表达。通过部分转化子的致病性试验,筛选获得数个在苹果果实和叶片上致病性都显著降低的菌株。【结论】建立了农杆菌介导的链格孢菌苹果致病型稳定高效的分子转化体系,为进一步开展此病菌与其寄主的分子互作研究打下基础。