利用GFP标记研究秸秆还田对假单胞菌PW9土壤定殖能力的影响

【目的】本文利用GFP标记系统研究秸秆还田对假单胞菌PW9土壤定殖能力的影响。【方法】将可产生绿色荧光蛋白(GFP)的质粒pBBR1MCS2-Tac-EGFP电转化至假单胞菌PW9中,通过抗生素鉴定及质粒检测,获得了能够产生稳定的强烈绿色荧光且具有较高解磷能力的标记菌株PW9-gfp,并以此为试验菌株进行土壤定殖能力研究。【结果】标记菌株PW9-GFP施入土壤0～60 d时间内,两种处理方式的土壤样品中有效菌落数量均由109 CFU/g降至10 CFU/g;在植株同一生长时间时,标记菌株PW9-gfp单独施入的土壤样品中有效菌落数量均略低于与秸秆同时施入的土壤样品。【结论】秸秆还田对菌株PW9的土壤定殖能力具有一定的促进作用,其作用机理有待进一步研究,这一研究结果为解磷菌合理施用及微生物菌肥与秸秆还田协同作用深入研究奠定了一定的理论基础。     

根际益生菌解淀粉芽孢杆菌SQR9在香蕉根表的定殖行为研究

在水培和土培条件下利用激光共聚焦扫描显微镜(confocal laser scanning microscopy,CLSM)和扫描电子显微镜(scanning electron microscopy,SEM)研究绿色荧光蛋白(green fluorescence protein,GFP)标记的解淀粉芽孢杆菌SQR9(SQR9-gfp)菌株在香蕉根表的定殖情况。结果表明:在接种后2~8 d,SQR9-gfp可在香蕉根表有效定殖并形成微菌落,定殖主要发生在主根的分生区和伸长区、侧根、主根与侧根的交界处以及根毛区,而附着于根尖的细菌数量很少。2种系统下SQR9-gfp的定殖表型相似,表明水培等限制系统可在短期内模拟真实的土培条件。对SQR9-gfp的定量计数结果表明:接种4 d后其在香蕉根表的密度保持在105~106CFU·g-1,以及在根际土中密度为106~107CFU·g-1,接种15 d后细菌密度略有下降。结论:SQR9能在香蕉根表有效定殖并在根际保持一定浓度,可为进一步利用该PGPR菌株防控香蕉枯萎病提供理论基础。     

根际益生菌解淀粉芽孢杆菌SQR9在香蕉根表的定殖行为研究

在水培和土培条件下利用激光共聚焦扫描显微镜(confocal laser scanning microscopy,CLSM)和扫描电子显微镜(scanning electron microscopy,SEM)研究绿色荧光蛋白(green fluorescence protein,GFP)标记的解淀粉芽孢杆菌SQR9(SQR9-gfp)菌株在香蕉根表的定殖情况。结果表明:在接种后2~8 d,SQR9-gfp可在香蕉根表有效定殖并形成微菌落,定殖主要发生在主根的分生区和伸长区、侧根、主根与侧根的交界处以及根毛区,而附着于根尖的细菌数量很少。2种系统下SQR9-gfp的定殖表型相似,表明水培等限制系统可在短期内模拟真实的土培条件。对SQR9-gfp的定量计数结果表明:接种4 d后其在香蕉根表的密度保持在105~106CFU·g-1,以及在根际土中密度为106~107CFU·g-1,接种15 d后细菌密度略有下降。结论:SQR9能在香蕉根表有效定殖并在根际保持一定浓度,可为进一步利用该PGPR菌株防控香蕉枯萎病提供理论基础。     

解磷菌在复垦土壤中的定殖及促生效果研究

为探讨解磷菌在复垦土壤中定殖及促生效果,利用绿色荧光蛋白(GFP)对解磷假单胞菌w134和w137作GFP标记,分析不同施肥条件下两株标记菌(w134GFP和w137GFP)在复垦土壤中定殖情况以及对土壤磷素活化和玉米生长的影响.结果表明,在玉米生长35 d采集土样,可从复垦土壤中检测到标记菌,w134GFP和w137GFP在玉米根际土壤中数量约104 cfu·g-1,在非根际土壤中数量约103 cfu·g-1.单施解磷菌增加玉米株高、株粗、玉米的氮磷含量及土壤有效磷含量;而解磷菌+肥料(有机肥+化肥)则大幅提高玉米生长及复垦土壤中有效磷含量,与对照差异显著.其中添加有机肥处理,在标记菌的定殖数量、玉米生长和土壤有效磷含量上均表现最佳.研究结果表明,解磷菌w134和w137可在复垦土壤中有效定殖,活化土壤磷素,促生玉米生长,可作为矿区微生物复垦的备选功能菌.     

短小芽孢杆菌转座突变株的GFP标记及在水稻上的定殖

【目的】研究GFP标记的短小芽孢杆菌在水稻植株上的定殖规律,为其生物防治应用提供科学依据。【方法】从短小芽孢杆菌GFP标记的转座突变株库中筛选强表达GFP且遗传稳定的突变株,用作水稻植株的定殖示踪。【结果】采用荧光酶标仪、流式细胞术检测及荧光显微镜观察等手段,对1 467株Tn5-egfp随机插入突变株的GFP表达作了定量和定性分析,最终获得8株荧光表达较强的突变株,并对突变株作了T-DNA插入拷贝数鉴定。在开放和封闭系统中,标记菌在水稻幼苗根际土壤中均可以存活15 d以上,且前者标记菌的数量下降相对更慢。【结论】短小芽孢杆菌在根毛区及侧根分生处的数量最多,并在根表面形成菌膜。该菌可通过水稻幼苗根部的伤口或幼嫩根毛等部位侵入根系,主要分布在皮层细胞及其间隙,在植物的维管束内亦可观察到荧光标记菌。研究结果表明该菌在水稻幼苗根际土壤中有着良好的定殖能力。     

绿色荧光蛋白在微生物与植物互作研究中的应用研究进展

对绿色荧光蛋白的结构、发光机制、荧光检测方法以及在微生物与植物互作研究中的应用进行了详细的阐释,重点对其在根际微生物定殖及其与宿主植物的相互作用、内生菌定殖及其对植物生长促进作用、微生物与植物共生关系、病原微生物与植物的相互作用、微生物中蛋白在宿主植物中的定位、转基因安全与标记等方面的应用进行了综述,并对其应用进行了展望.     

枯草芽孢杆菌生防菌株SEM-9根际定植及对根际土壤微生物多样性的影响

【目的】研究枯草芽孢杆菌生防菌株SEM-9在作物根际的定植规律及对根际土壤微生物多样性的影响。【方法】通过自然转化法对SEM-9菌株进行绿色荧光蛋白标记，利用倒置荧光显微镜观察该菌株在作物根际土壤、根表面及根系内组织的定植情况；并以土传病害土壤为试验对象，通过高通量测序初步分析SEM-9菌株处理后根际土壤中微生物多样性的变化。【结果】构建了稳定表达绿色荧光蛋白的重组菌株SEM-9-pGFP₂₂。荧光显微镜观察结果表明，SEM-9-pGFP₂₂重组菌株可以在根际土壤和根表面定植，但是无法在根内组织或细胞内定植。SEM-9菌液处理显著降低了黄瓜土传病害的发病率，提高了根际土壤真菌微生物的多样性。【结论】成功建立了SEM-9菌株的GFP标记方法，明确了该菌株的根际定植规律及对黄瓜土传病害的防治效果，为后期开发替代型微生物肥料奠定了基础。     

GFP标记短小芽孢杆菌LYMC-3在马尾松体内的定殖

为研究松材线虫拮抗细菌短小芽孢杆菌LYMC-3的内生性及其在马尾松体内的定殖规律,采用扫描电子显微镜(SEM)观察菌株在马尾松组培苗体内的定殖,并采用高渗透法将质粒pGFP78转入菌株LYMC-3,对其进行绿色荧光蛋白(GFP)标记,同时测定标记菌株的遗传稳定性.在此基础上,以GFP标记和抗性标记作为示踪手段,将标记菌株接种到2年生马尾松盆栽实生苗的根部,借助激光扫描共聚焦显微镜(LSCM)和稀释涂板的方法,对马尾松根部、茎部的标记菌株进行定期回收检测.结果显示,通过SEM成功观察到菌株LYMC-3在马尾松体内的定殖,并成功获得LYMC-3菌株荧光表达强烈且遗传稳定的转化子,经过连续8次的稀释培养,其遗传稳定性为96.8％.GFP标记菌株在接种马尾松根部后的第4天,根部、茎部都能回收到大量标记菌株的存在,随后呈持续下降的趋势,且根部的下降速度快于茎部.接种40 d后,根部回收标记菌株数量为0.3×102cfu/g,茎部回收标记菌株数量为0.8×102 cfu/g.以上结果表明短小芽孢杆菌LYMC-3具有内生性,能在马尾松体内良好地定殖和传导.     

生防菌枯草芽孢杆菌CQBS03的绿色荧光蛋白基因标记及其在柑橘叶片上的定殖

【目的】利用绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein,GFP)基因标记枯草芽孢杆菌生防菌株CQBS03,以研究其在柑橘叶片上的定殖规律。【方法】采用重叠PCR方法将p43启动子和gfp进行融合,并与大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭载体pHY300PLK连接构建重组质粒pHY43G,以重组质粒电脉冲转化生防菌株CQBS03,培养后于荧光显微镜下观察并通过SDS-PAGE分析工程菌株GFP的表达情况,然后进行工程菌株对柑橘溃疡病菌的抑菌试验、生长动力学分析、稳定性测试。采用叶片喷雾方法接种,平皿稀释分离培养方法测定CQBS03-pHY43G在柑橘叶片上的定殖情况。【结果】重组菌CQBS03-pHY43G高效表达GFP,电泳后出现约29kDa的特异蛋白条带,外源质粒对宿主菌的生长未带来明显不利影响,质粒稳定性实验表明重组质粒pHY43G经30次传代后的稳定性为55%,室内平板抑菌实验结果显示CQBS03-pHY43G对柑橘溃疡病菌生防效果与出发菌株没有明显差异(P0.01),CQBS03-pHY43G菌株在叶片喷雾接种后的0—15d,在柑橘叶片上的数量呈现急剧下降趋势,15d后下降速度稍缓,最后保持相对稳定的较低水平(1.73×103cfu·g-1)。【结论】成功地将gfp转入野生型枯草芽孢杆菌生防菌CQBS03中,构建了荧光标记菌株,初步明确了生防菌的定殖规律。     

枸杞内生真菌NQ8GⅡ4定殖促生作用研究

为进一步明确内生生防菌NQ8GⅡ4在宿主和非宿主植物中的定殖能力和促生作用,采用生物学方法测定野生型NQ8GⅡ4菌株的促生潜力;利用绿色荧光蛋白(GFP)标记的NQ8GⅡ4-GFP菌株,对枸杞、番茄、小麦、西葫芦、生菜和芹菜等6种植物进行灌根处理,利用激光扫描共聚焦显微镜观测NQ8GⅡ4-GFP菌株在宿主和非宿主植物中的定殖情况,同时检测不同接种浓度对枸杞苗生长的影响。结果表明,野生型NQ8GⅡ4菌株在5 d时赤霉素浓度可达16.6μg/mL,并具有一定解磷、产铁载体、纤维素酶和蛋白酶的能力。NQ8GⅡ4-GFP菌株能定殖于枸杞、番茄和小麦的根部,不能定殖于芹菜、生菜和西葫芦。不同植物定殖率有明显差异,在宿主植物枸杞根部定殖率最高,为93.9%,在非宿主植物番茄根部定殖率为91.84%,而在小麦根部定殖率仅为21.43%。不同接种浓度下对枸杞苗生长指标影响不同,其中以10⁵～10⁶ CFU/mL孢子液灌根,对枸杞苗促生作用显著,在农业上具有良好的应用前景。     

棉花内生芽孢杆菌LH-L3定殖能力研究

为更好地利用优良内生生防菌株,通过自然转化法将携带绿色荧光蛋白基因的质粒p HT01-P43GFPmut3a成功导入生防菌株LH-L3中,获得了标记菌株LH-L3-GFP,用标记菌液浇灌棉株24 h后,在棉株的各个器官中都能检测到标记菌,其定殖量分布由大到小依次为根、茎、花朵和叶。采用涂叶和灌根接种标记菌株的方法,结果发现菌株在蚕豆、玉米、小麦、甘蓝上均可定殖,定殖能力由大到小依次为蚕豆、甘蓝、小麦和玉米。     

GFPuv标记猕猴桃溃疡病菌的生物学特性 及其在土壤、根系中的定殖

【目的】获得具有荧光标记的猕猴桃溃疡病菌（Pseudomonas syringae pv. actinidiae）菌株,为进一步揭示其侵染致病过程奠定基础。【方法】电击法对病菌进行GFPuv基因标记,应用荧光显微镜和平板稀释法研究标记菌株在土壤和根部的定殖情况。【结果】GFPuv标记的猕猴桃溃疡病菌菌株在荧光显微镜下发出强烈的绿色荧光,8株标记菌基因组DNA中均扩增出约700 bp的目的片段。标记菌株PSAmx7-GFPuv1的菌体形态、生长曲线、最适温度、最适pH、致病性均与野生型无显著差异,其绿色荧光可稳定遗传。标记菌在灭菌土壤中可存活3个月左右,在未灭菌土壤中也能存活3周;灌根1 d检测,根表、根内组织中可分离到目标菌落,随后标记菌株数量呈现“先增后降”的趋势。【结论】电击法成功地将GFPuv基因转入猕猴桃溃疡病菌;导入的GFPuv 基因对宿主菌的生物学特性没有影响;标记菌可在灭菌土壤中长期存活,并在根部定殖和增殖。     

玉米根际促生菌的筛选及其对玉米生长发育的影响

[目的]研究玉米根际微生物的种类及其生长情况,为玉米根际促生菌对玉米生长发育影响的研究提供有价值的参考。[方法]通过对已分离的微生物进行离体拮抗试验,检测菌株产生铁载体的情况,并以普通基质土壤为对照,研究产铁载体细菌对玉米种子发芽率和株高的影响。[结果]从玉米根际优势微生物中筛选出6株拮抗菌和5株产生铁载体的细菌,发现菌株KM2、KM19具有较广的抗菌谱,且KM19能够产生铁载体,它们能够大大地提高玉米种子的萌发率和增加玉米的生物量。[结论]筛选到的菌株KM2、KM19是玉米根际促生菌,能够有效地促进玉米的生长发育,并提高玉米的产量。     

生防内生枯草芽孢杆菌Jaas ed1在西瓜植株内的定殖能力检测

分别对枯草芽孢杆菌Jaas ed1进行利福平(Rif)抗性标记和绿色荧光蛋白(GFP)标记,获得Rif抗性标记的菌株Jaas ed1R及GFP标记的菌株Jaas ed1-GFP,并初步研究Jaas ed1在西瓜植株中的定殖能力。定殖结果表明,在灌根接种Jaas ed1R后的35 d内能在西瓜苗根部检测到Jaas ed1R,20 d内能在茎部检测到Jaas ed1R;并且在根部定殖的数量显著大于茎部,接种后3 d根部Jaas ed1R的数量为1.62×104cfu·g-1鲜重,茎部为2.95×102cfu·g-1鲜重。灌根接种Jaas ed1-GFP后的第3天,在荧光显微镜下观察到西瓜苗根部存在大量的Jaas ed1-GFP,在激光共聚焦显微镜观察到西瓜苗茎内的Jaas ed1-GFP分布集中在维管束中。说明内生枯草芽孢杆菌Jaas ed1能够在西瓜植株体内定殖,能够从土壤中进入西瓜根部组织,并且能够侵入到茎部微管束组织中,从而在整个植株体内转移。     

羽毛针禾根部内生假单胞菌XG11在小麦上的定殖动态及促生效应

为探究荒漠植物羽毛针禾根部内生菌假单胞菌XG11的促生作用及其定殖动态,将菌株XG11灌于沙土种植的小麦根部,通过四环素标记,观察定殖动态;测定接种菌株XG11菌悬液后的小麦株高、丙二醛含量、过氧化物酶活性等指标,评估菌株XG11对小麦植株生长发育的促生作用.抗性标记假单胞菌(XG11TC)能在根际土壤和小麦根内定殖2...     

棘孢木霉M45a的定殖能力及其对水稻促生作用研究

为研究棘孢木霉M45a在水稻体内的定殖规律及促生作用,利用其绿色荧光标记菌株M45a-GFP实时动态观测标记菌的定殖情况,并探究其对大田水稻的促生作用.结果 表明,M45a浸种处理对水稻苗期促生效果最好,其标记菌株M45a-GFP能有效定殖于水稻根系组织.大田促生试验表明,与清水对照相比,M45a浸种处理的水稻在生长50 d时其株高、地上部干重、根际土壤总氮和硝态氮含量显著增加,分别为8.1％、10.0％、14.92％和22.34％.因此,棘孢木霉M45a具有很好的开发潜力,为木霉菌肥部分替代化肥提供了一定的理论基础.     

内生细菌B69定殖能力及其对人参根腐病防效研究

研究人参内生菌B69菌株在人参根、茎、叶及其根际土壤中的定殖规律,以及B69菌株对人参根腐病的防效,以期为新型人参根腐病生防制剂的开发提供理论依据。采用抗生素标记法,筛选出最佳标记菌株;采用盆栽和田间试验测定自然土与无菌土处理下B69菌株在人参植株内和根际土壤中的定殖能力。结果表明,标记菌株与未标记菌株在形态特征、拮抗能力、防病效果等方面无显著差异;B69菌株能够高效定殖在人参根部;B69菌株对人参根腐病有较好的防治效果,田间试验结果表明该菌处理后的病情指数为25.41,对根腐病的相对防效为58.56%。说明B69菌株是有防治人参根腐病潜力的生防菌。     

枯草芽孢杆菌X-4对土壤青枯菌消长变化及防病效果的影响

为研究枯草芽孢杆菌X-4在土壤中的定殖动态对青枯菌消长变化的影响,以及对番茄青枯病的防治效果,采用绿色荧光蛋白基因标记法,通过番茄盆栽试验直接测定了其在土壤中的定殖效果及对青枯病病原菌数量、土壤微生物功能多样性及生物量的影响。结果表明,通过绿色荧光蛋白基因标记法能成功跟踪菌株X-4在土壤中的定殖状况,其定殖曲线表现为一非对称抛物线,前期缓慢上升,24 d达到高峰,当接种量为5.0×105、1.0×106CFU/(g土)时,其定殖峰值分别为2.98×107CFU/(g土)和5.03×107CFU/(g土),而青枯菌数量则呈现出与X-4相应的消长变化,处理土壤青枯菌数量在12～30 d时段内呈现下降的趋势,而对照病菌数量处于较高水平并且还有上升趋势,因此未接种菌株X-4处理发病早,病指高;接种微生物菌剂X-4对土壤微生物功能多样性无不利影响,并能有效地抑制病菌,对番茄青枯病表现出明显的防治效果,接种量为1.0×106CFU/(g土)时,35、45、55 d对青枯病的防效分别为100%、83.3%和57.2%;接种X-4还能促进番茄植株生长,增加生物量,促进结果。绿色荧光蛋白标记法可为枯草芽孢杆菌X-4在土壤中的动态变化提供直接的菌量数据,其数量与土壤中青枯菌数量的消长动态对番茄青枯病的防治效果有重要影响。     

不同交配型拟轮枝镰孢菌荧光蛋白标记菌株的构建

【目的】构建不同交配型的拟轮枝镰孢菌(Fusarium verticillioides)荧光蛋白标记菌株,为研究拟轮枝镰孢菌的侵染、定殖、有性生殖等提供基础材料。【方法】通过聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)介导的原生质体转化法分别将荧光蛋白基因eGFP和mCherry导入不同交配型的拟轮枝镰孢菌FvLNF15-11和FvSHF19-37菌株,并比较荧光标记菌株与野生型菌株间的生长特性、有性生殖和致病力差异。【结果】经PCR检测获得了带有荧光标记的菌株,激光共聚焦显微镜观察表明eGFP基因和m Cherry基因分别在FvLNF15-11和FvSHF19-37菌株的分生孢子和菌丝中成功表达。与野生型菌株相比,荧光标记菌株的生长发育、子囊壳形成和致病力均无明显差异。【结论】构建了拟轮枝镰孢菌不同交配型eGFP和m Cherry荧光标记菌株,不仅为研究拟轮枝镰孢菌在寄主体内的侵染、定殖等提供了材料,也为研究该菌的有性生殖过程积累了基础。     

亲和性促生菌DW12-L的定殖及其对大豆生长的影响

为了研究大豆亲和性根际促生菌(PGPR)菌株在大豆根际的定殖及其对大豆生长发育的影响,采用电转化法将luxAB基因转入对大豆凝集素(SBA)具有亲和性的PGPR菌株DW12中。将标记菌株DW12-L接种于大豆品种中黄606根际,以SBA非亲和的PGPR菌株P34-L作对照,考察DW12-L在大豆根际定殖的时空特征,检测菌株的定殖对大豆生长以及根系发育的影响。结果表明,DW12-L可长期定居于大豆根际,并随根系的生长在新的根段根际吸附定殖,而P34-L在大豆根际不能稳定存活;DW12-L显著促进大豆地上部和地下部生物量的积累以及根系的发育,P34-L在大豆生长30 d时由于不能定殖于根际而无显著促生效果。与大豆凝集素具有亲和性的PGPR菌株DW12-L可定殖于大豆根际并促进大豆生长,定殖能力的强弱是决定菌株能否发挥促生功能的关键。