转CP基因线辣椒对CMV的抗病性组分研究

以转化 CMV外壳蛋白基因 ( CP基因 )的线辣椒 ( Capsicum annuum var. longunt)为试材 ,系统研究了 CP基因介导抗病性的组分和表达特点。摩擦接种黄瓜花叶病毒 ( CMV,浓度 2 0μg/ ml)后 ,转基因线辣椒显症延迟 4～ 1 0 d,显症率和严重度大幅减低 ,仅部分植株表现轻度花叶。接种叶片上 CMV侵入位点数目比未转化对照品种减少 6 7.0 %～ 86 .4 %。接种后第 9天 ,转基因株系接种叶中 CMV含量仅为未转化对照的32 .4 %～ 37.3%。病毒由接种叶向邻叶转出始期 ,比未转化对照晚 9～ 1 5h。接种后 3d,转基因株系 1 6— 1 3的未接种叶中未能检出 CMV,而同期未转化对照已有 4片邻叶检出了 CMV。接种后 6 d,1 6— 1 3仅上下位相邻叶检出了 CMV,此时对照已全株带毒。转基因株系接种后 6 d,整株 CMV含量为未转化对照的 4 2 .5%。这表明线辣椒 CP基因介导的抗病性是多组分的 ,包括对病毒的抗侵入、抗扩展和抗增殖     

CP基因遗传转化甘蔗品种Badila与福农91-4621的抗病性差异分析

利用含甘蔗花叶病病毒E株系外壳蛋白基因（CP）的质粒pUbi-SCMV-CP,用基因枪轰击法遗传转化不同甘蔗品种,所获得的转基因无性系经过3代的抗病性鉴定和H2O2代谢的分析.结果表明,Badila（TB1）转基因植株具有较强的抗花叶病能力,而福农91-4621在转基因无性系T1、T2中表现出较强的抗病性,但在T3中其抗病性开始退化,发病率高达68%;抗病生理分析表明,转基因无性系的抗病性与H2O2清除和积累有关.经RT-PCR克隆和测序分析,福农91-4621所感染的SrMV-H的CP基因氨基酸序列与转化的SCMV-E的同源性较低,仅为73.2%,福建Badila所感染的是SCMV-D,与SCMV-E同源性高达97.8%.说明CP基因对本身所来源的病毒或是与原病毒亲缘关系较近的病毒可能具有较强的抗性,而对同属于SCMV的其他病毒虽有抗性,但抗性较弱,且随着转基因世代数的增加而降低.     

辣椒CMV广州分离物的CP基因序列分析及亚组鉴定

从广州市呈现花叶病症的辣椒上分离纯化得到1个黄瓜花叶病毒的分离物(CMV-GZ)。利用RT-PCR技术克隆了该病毒分离物的外壳蛋白(CP)基因,其序列长度为657 bp,编码218个氨基酸。对CP基因序列进行同源性比较分析,结果表明该病毒分离物的CP基因与CMV亚组Ⅰ5个株系的同源性均在90%以上,而与亚组Ⅱ4个株系的同源性均低于80%。据此将该分离物归属于CMV亚组Ⅰ。     

CP基因遗传转化甘蔗品种Badila与福农91-4621的抗病性差异分析

利用含甘蔗花叶病病毒E株系外壳蛋白基因(CP)的质粒pUbi-SCMV-CP,用基因枪轰击法遗传转化不同甘蔗品种,所获得的转基因无性系经过3代的抗病性鉴定和H2O2代谢的分析.结果表明,Badila(TB1)转基因植株具有较强的抗花叶病能力,而福农91-4621在转基因无性系T1、T2中表现出较强的抗病性,但在T3中其抗病性开始退化,发病率高达68%;抗病生理分析表明,转基因无性系的抗病性与H2O2清除和积累有关.经RT-PCR克隆和测序分析,福农91-4621所感染的SrMV-H的CP基因氨基酸序列与转化的SCMV-E的同源性较低,仅为73.2%,福建Badila所感染的是SCMV-D,与SCMV-E同源性高达97.8%.说明CP基因对本身所来源的病毒或是与原病毒亲缘关系较近的病毒可能具有较强的抗性,而对同属于SCMV的其他病毒虽有抗性,但抗性较弱,且随着转基因世代数的增加而降低.     

抗CMV转基因辣椒实时荧光PCR检测方法研究

针对辣椒中转基因成分建立快速、高效、准确的实时荧光PCR检测方法,以缩短检测周期,提高检出率。结果表明,针对转基因辣椒的内源基因CaATL1和外源基因CMV建立的检测方法,具有很好的特异性,二者检测灵敏度均可达0.01%。本研究建立的检测方法特异性、灵敏度和准确度高,也比较方便快速,同时使用的是全部闭管操作,大大降低了普通PCR带来的污染,为转基因辣椒的检测提供了新的检验方法。     

甜瓜抗CMV转基因植株的分子生物学研究

本研究建立了转目的基因植物基因整台及表达的分子生物学鉴定系统，并用报告基因检测、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、Ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ、ＰＣＲ特异扩增、Ｗｅｓｔｅｒｎ－Ｂｌｏｔ等方法，研究了用叶盘法经Ｔｉ质粒转化的甜瓜再生植株ＣＭＶ－ＣＰ基因的整合与表达。结果表明：再生植株基因组中整合了ＣＭＶ－ＣＰ基因，长度为１ｋｂ，并能有效表达。表达产物分子量为２４Ｋｄ，确为ＣＭＶ的外壳蛋白，其表达量占细胞总蛋白约５％。     

辣椒抗疫病的遗传与育种

辣椒疫病是在世界范围内严重危害辣椒的重要病害之一。几十年来 ,许多辣椒生产国开展了抗疫病育种和包括抗病性遗传分析在内的相关研究。笔者对近年来有关辣椒疫病病原、辣椒对疫病的抗性、抗病性的生理生化机制、抗病性的遗传、抗病基因的 QTL定位与克隆、抗病性鉴定和抗病育种方面的研究进展进行了综述 ,并对其发展做了展望     

抗CMV和ToMV RNAi载体的构建及加工番茄遗传转化

【目的】利用农杆菌介导法将抗CMV和ToMV的RNAi表达载体pBi35STC12转入红番3号加工番茄,获得抗CMV和ToMV的加工番茄植株,为加工番茄病毒病的防治奠定基础。【方法】采用RT-PCR扩增,选取新疆加工番茄CMV分离物NS0-4 1a复制酶第1 051-1 350bp序列和ToMV分离物SCS-2 130/180ku复制酶第1 920-2 200bp序列,作为干扰片段CR12和To12。通过T克隆载体将CR12和To12连接成拼接片段TC12,构建成含反向重复结构拼接片段的RNAi表达载体pBi35STC12。通过农杆菌介导法,用其转化红番3号加工番茄,经过筛选、PCR检测得到转基因植株。【结果】成功构建了抗CMV和ToMV的RNAi表达载体pBi35STC12,并用其转化番茄植株,从转化的1 500个愈伤组织中获得33株再生植株,利用PCR对再生植株进行检测,显示从33株再生植株中获得了19株转基因植株,转化率为1.26%。【结论】构建了抗CMV和ToMV的RNAi表达载体pBi35STC12,用其转化红番3号加工番茄,获得了转基因植株。     

抗菌肽基因转化产辣椒的研究

以“雪峰”为转基因材料,建立了以子叶为外殖体,直接分化成苗的离体再生体系,其各阶段的培养基分别为：（1）芽分化培养基：MS＋BA3－5mg/L IAA2mg/L;（2）芽伸长培养基：MS＋BA1－2mg/L;(3)生根培养基：1／2MS＋IAA0.5-1mg/L。利用农杆菌介导的三亲交配法将抗菌肽基因CecropinB,CecropinD导入辣椒,获得了再生植株,经PCR和Southern杂交检测,表明目的基因已整合到辣椒核基因中,获得了转基因植株。     

线辣椒种质资源遗传多样性分析

中国线辣椒(C.annuumvar.annuum)是一种特有的辣椒类型,具有丰富的种质资源,但目前对其遗传多样性的研究甚少.本研究采用RAPD和SSR分子标记,对20份辣椒种质资源(其中线辣椒13份,其他辣椒资源7份)的遗传多样性进行鉴定分析,并比较分析了形态特征.结果表明:2种标记均能有效鉴定材料间遗传多样性,其中SSR标记优于RAPD标记.RAPD标记共扩增出218条DNA片段,每个引物平均可扩增出3~10条DNA片段,多态性比率(PPB)为77.1%;材料间遗传相似系数(GS)为0.615~0.905.SSR标记共扩增出153条DNA片段,每对引物平均扩增出2~8条DNA片段,多态性比率(PPB)为82.3%;材料间遗传相似系数(GS)为0.632~0.886.相关性分析表明,RAPD和SSR标记与形态标记的相关系数分别为0.743和0.710,2种标记与形态标记的相关系数为0.658,均达到了显著水平.聚类分析结果显示,大部分具有亲缘关系的资源及形态学、生物学特征相近的资源聚在一类,说明分子标记的聚类分析结果与形态学分类结果具有较好的相符性.     

辣椒叶片花青素含量的遗传分析

选用3个紫色辣椒和2个绿色辣椒品种配制杂交组合,并构建3个杂交组合的6世代群体(P1、P2、F1、B1、B2和F2),用分光光度法测定辣椒叶片花青素相对含量,研究其遗传规律.结果表明:3个杂交组合的分离群体叶片花青素含量呈现出多峰或单峰偏态分布,表现为主基因+多基因的数量遗传特征;通过多世代联合分析表明,辣椒叶片花青素含量遗传模式符合2对加性-显性-上位性主基因+加性-显性-上位性多基因模型(E-0模型);F2群体主基因遗传率较高,为78.89%～91.47%,多基因遗传率较低,为5.19%～17.00%.建议:对辣椒紫叶性状的遗传选择可在分离早期世代进行.     

线辣椒花芽分化过程的形态观察及部分代谢产物和酶活性的变化

【目的】研究4个线辣椒品种(系)的花芽分化过程及其与外部形态、部分生理生化指标的关系,为提高线辣椒花芽分化指数、获得高产提供依据和参考。【方法】以M5-21、M34-1、2011-9和陕椒2006 4个线辣椒品种(系)为供试材料,从第3片真叶出现开始,每隔3d从生长点取样,采用常规石蜡切片法制片,观察线辣椒的花芽分化过程;从第4片真叶出现时开始,每隔5d取第3、4片真叶,测定可溶性糖、淀粉、可溶性蛋白和叶绿素含量;同时测定POD、PAL和PPO活性。【结果】线辣椒花芽分化过程包括生理分化期、分化初期、萼片分化期、花瓣分化期、雄蕊分化期和雌蕊分化期,分化开始时茎秆上有6片展开真叶,顶端花芽(即门椒花芽)分化全过程需28d左右,分化完成时茎秆上有14片展开真叶。叶片中可溶性糖及淀粉含量在花芽分化开始前积累至最大值,在花芽分化开始后,二者含量逐渐降低,说明可溶性糖和淀粉的积累有利于花芽分化。叶片内可溶性蛋白含量在生理分化期达到峰值,此后逐渐下降,从萼片分化期到花芽分化结束保持平稳状态。叶绿素含量在生理分化期至花芽分化初期呈略微上升趋势,之后逐渐下降,花芽分化进入后期时有较大幅度的上升。线辣椒花芽分化期POD和PAL活性的变化趋势基本一致,在生理分化期均达到一个相对较高的酶活水平,进入花芽分化期均下降,POD活性在萼片分化期下降至最低点,PAL活性在花瓣分化期下降至最低点,此后均又逐渐升高。PPO活性呈现双峰变化趋势,2个峰值分别出现在萼片分化期和雄蕊分化期,最低点出现在雌蕊分化期。4个线辣椒品种(系)的上述指标变化趋势一致,只是具体数值有所差异。【结论】较高的可溶性糖、淀粉、蛋白质和叶绿素含量,及相对较高的POD、PAL、PPO活性,有利于线辣椒花芽分化。     

不同砧木嫁接对线辣椒果实产量及品质的影响

为了研究不同砧木对线辣椒品种果实产量和品质的影响,以‘野立姆’‘格拉夫特’‘部野丁’‘富根卫士’4个半野生辣椒品种作砧木,选用线辣椒品种‘辛香8号’和‘多娇’为接穗,以‘辛香8号’和‘多娇’的自根苗作为对照,进行嫁接试验。结果表明:(1)‘辛香8号’与‘格拉夫特’‘部野丁’的嫁接处理(TX2、TX3)显著地提高了线辣椒果实产量,‘多娇’与‘格拉夫特’的嫁接处理(TD2)表现出比较明显的增产趋势,但未达到显著水平。(2)在果形方面,除砧木‘富根卫士’外,其他砧木嫁接在2个品种上均表现出辣椒果实变大的趋势,砧木‘部野丁’处理(TX3)的果长、果径显著高于对照,分别比对照增加21.73%和14.81%,砧木‘野立姆’与‘多娇’处理(TD1)和‘格拉夫特’与‘多娇’处理(TD2)的果长、果径、果形指数、果肉厚及胎座宽均高于对照(CK2),其中果形指数、果肉厚与对照差异达到显著水平。(3)在营养品质方面,以‘辛香8号’为接穗的4个处理中,果实干物质质量分数均高于对照(CK1),且TX1、TX2、TX3与对照的差异均达到显著水平,以‘多娇’为接穗的4个处理中,TD1、TD2和TD3的果实干物质高于对照(CK2),且TD3与CK2的差异达到显著水平;在可溶性糖质量分数方面,TX1、TX2、TX3处理均显著高于CK1,以‘多娇’为接穗的4个处理中,TD1、TD2、TD3的果实可溶性糖质量分数高于CK2,且TD3与CK2的差异达到显著水平;在果实可溶性蛋白质量分数方面,TX2、TX3显著高于CK1,以‘多娇’为接穗的4个处理中,TD3的质量分数显著高于CK2;在以‘辛香8号’为接穗的各处理中,唯有TX4处理显著降低维生素C质量分数,其他处理与对照之间差异不显著,在以‘多娇’为接穗的各处理中,TD1、TD2、TD4质量分数均显著地低于CK2。(4)在所选择的4个嫁接砧木中,‘野立姆’在2个品种上均表现出提高辣椒素类物质质量分数的趋势,但未达到显著水平,其他砧木均表现出降低辣椒素类物质质量分数的趋势,且TX3、TX4,TD2、TD3、TD4的下降达到显著水平。     

黄瓜花叶病毒辣椒分离株抗性遗传规律的研究

采用4×4完全双列杂交方法研究了辣椒对黄瓜花叶病毒辣椒分离株(CMV-P)抗性的遗传规律,研究结果表 明,辣椒对CMV-P的抗性至少受4对以上核基因控制,具有数量性状遗传特点;抗性的回交效应显著而正反交效应不显著;辣椒对CMV-P的抗性遗传经检验符合“加性——显性”模型,主要受基因的加性效应影响。群体中抗病基因频率高于感病基因频率。通过自交、回交、系统选择可获得抗病性超亲的系统。抗×感组合的F1代很难获得超亲组合,要获得高抗杂交组合需选双亲都高抗的亲本。     

不同砧木嫁接对线辣椒生长发育及光合特性的影响

【目的】研究不同砧木对线辣椒嫁接植株生长状况的影响,为筛选适宜陕西关中地区线辣椒嫁接的砧木品种提供理论依据。【方法】以线辣椒品种辛香8号和多娇为接穗,分别与半野生砧木野立姆、格拉夫特、部野丁和富根卫士进行嫁接,并分别以辛香8号和多娇自根苗为对照,研究嫁接植株的生长势、光合特性和根系特性的变化。【结果】嫁接植株(除辛香8号和多娇与富根卫士嫁接外)的茎粗、最大叶面积和株幅无明显变化,始花节位降低。以野立姆作砧木,2个线辣椒品种株高显著增加;到生长后期叶片叶绿素含量和净光合速率高于对照,根系与地上部鲜干质量、根长、根体积、根表面积、根尖数、根分枝数和根交叉数显著增加;辛香8号嫁接苗根直径显著降低,多娇嫁接苗稍有降低。以格拉夫特作砧木,到生长后期2个线辣椒品种的株高显著增加,仅次于野立姆,两处理间差异不显著;叶片叶绿素含量和净光合速率达到最高,根系鲜质量、地上部鲜干质量显著增加,但低于野立姆;根系干质量变化不显著,根长、根体积显著增加,根直径增加但未达显著性差异;辛香8号嫁接苗的根表面积、根尖数、根分枝数和根交叉数稍有增加,多娇嫁接苗根表面积、根尖数和根交叉数稍有降低,根分枝数显著降低。以部野丁作砧木,到生长后期2个线辣椒品种的株高、根系与地上部鲜干质量、根长和根体积均有增加,但低于格拉夫特;根表面积、根尖数、根分枝数和根交叉数均有增加,但低于野立姆;叶片叶绿素含量和净光合速率增幅高于对照;以富根卫士作砧木,多项指标显著降低,影响线辣椒的正常生长发育。【结论】对于所选用的2个接穗品种而言,以野立姆和格拉夫特为砧木的嫁接效果较好,可以提高线辣椒品种的光合作用,促进根系生长,增强植株长势。     

Anti-trxs和Bar基因共转化小麦后代植株的遗传及表型分析

经对基因枪转化小麦品种皖麦48获得的7株再生苗的PCR、PCR-Southern杂交和除草剂涂抹叶片检测,得到了4株转基因植株,证实了硫氧还蛋白反义基因(Anti-trxs)和抗除草剂Bar基因已经整合到小麦基因组中且能够正常表达。经对T1、T2植株分析表明:Anti-trxs、Bar基因能够稳定的遗传给后代,且普遍呈3∶1的分离,其遗传符合单基因控制的孟德尔遗传规律,部分株系表现1∶1的不正常分离(阳性个体较预期的少),推测这是由于雌或雄配子之一方丢失或外源基因的结构、排列等方面发生了变化的结果。转基因植株的农艺性状与对照相比,T0代有较大变异,但在T2代已得到了回复。     

油菜抗除草剂性状的遗传及利用

以抗草甘膦油菜“Q3”和MICMS保持系“宁B6”、“宁B7”及恢复系“宁R1”、“宁R3”为亲本材料,配制杂交组合,研究抗性遗传。结果表明,油菜对草甘膦的抗性为显性性状,由1对基因控制,抗草甘膦基因在F_2和BC_1群体遵循孟德尔分离规律。因此,应用杂交、回交育种方法将CP_4 gox双价基因转育到油菜推广品种中是可行的。     

转基因植物中的标记基因及其消除

随着转基因植物的商业化，植物遗传转化技术将为农业生产带来一场新的革命。新的转化程序要求把基因导入农艺性状优良的品种中，呈单拷贝、不带有辅助序列，并在不同的转化体中表达一致，稳定遗传。本文主要讨论标记基因的安全性及标记基因消除的方法等问题。     

番茄双抗TMV和CMV基因工程的研究

在ＴＭＶ外壳蛋白（ＣＰ）基因的５′和３′端分别合成寡聚核苷酸引物Ｐ１和Ｐ２，并分别引入ＣｌａＩ和ＢａｍＨＩ位点，采用ＰＣＲ技术扩增ＴＭＶＣＰ基因，用ＣｌａＩＢａｍＨＩ消化后重组到ｐＢｌｕｅ ｓｃｒｉｐｔＫＳ＋中，并将该基因与ＣＭＶＣＰ基因重组在同一个表达载体ｐＥ３上获得双价ＣＰ基因表达载体ｐＥＴＣ２，转化番茄，获得再生植株。通过点杂交、ＰＣＲ检测和Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交，证实２、１２和１３号为转ＴＭＶ和ＣＭＶＣＰ基因的工程植株。工程植株在温室中表现正常，比对照植株表现出明显的抗性。