甘蔗黄叶病毒复制酶基因的克隆及序列分析

甘蔗黄叶病是由甘蔗黄叶病毒(Sugarcane yellow leaf virus,SCYLV)引起的一种新发生的全球性流行病害,可导致甘蔗减产、品质变劣、糖产量降低,严重危害世界甘蔗的生产和甘蔗糖业的可持续发展.     

甘蔗EST序列的SSR信息分析

从NCBI公共数据库获得262 113条甘蔗EST,通过前处理和聚类拼接得到全长为50 058.89 kb的无冗余Unigene 62 565条.在这些序列中搜索出9482个SSRs,出现频率是15.15%;平均5.28 kb出现1个SSR.三核苷酸重复是主要的类型,占总SSRs的45.92%.CT和CGC是二、三核苷酸中的优势重复类型.分别占二、三核苷酸重复的21.22%和8.18%.此外还对筛选出的SSR进行多态性预测,得到了长度在20 bp 以上的低级基元一、二、三核苷酸EST-SSR共1 405条,占长度20 bp以上的SSR总数的59.16%.结果为甘蔗EST-SSR标记的开发和相关分子生物学研究提供资料和奠定基础.     

二温式PCR在特异短核酸探针合成中的应用

经基因库序列比对确定花生白藜芦醇合酶基因(RS)中的特异序列(长度约108 bp).以此为模板设计分别含有Sal I和Sac I酶切位点的一对上、下游引物,并应用二温式PCR扩增得到该特异短片段.将该特异片段正向连接到pBIueskriptIIKs( )的多克隆位点上,利用T7 RNA聚合酶在体外转录合成地高辛标记的反义特异短核酸探针.该特异短核酸探针的合成为后续RS基因在花生组织器官中表达的RNA原位杂交研究打下了基础.     

寒胁迫诱导灰木相思无性系差异蛋白的表达

本实验提取寒胁迫前后的灰木相思组培苗的水溶性蛋白进行双向电泳和质谱鉴定,分析在寒胁迫条件下蛋白质组的变化。利用ImageMaster 5.0软件分析比较,经基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱测定差异蛋白点的肽质量指纹图谱,通过Mascot软件查询Swiss-Prot等数据库,鉴定得到4个显著差异蛋白点,R7、R15、R20表现为上调表达,R17表现为下调表达。结果表明:在寒胁迫条件下灰木相思组培苗存在明显的蛋白质表达差异。     

甘蔗杂交后代主要荧光性状的遗传力及配合力分析

以6×3不完全双列杂交(NCⅡ)衍生的18个家系实生苗为材料,对主要荧光性状PSⅡ原初光能转换率(Fv/Fo)、PSⅡ潜在活性(Fv/Fm)、光合量子产额(Y)、光化学猝灭系数(qP)、非光化学猝灭系数(qN)的遗传力和配合力进行分析。结果表明Fv/Fo,Fv/Fm、Y、qN、qP的遗传主要受基因的非加性效应所制约,这些荧光性状的广义遗传力(h82)变幅为27.46%～44.38%;亲本赣75-65和崖84-153各荧光性状一般配合力为正值且较大,是配合力较好的高光效亲本;根据配合力总效应,综合表现较好的高光效组合有赣75-65×崖84-153,桂69-156×崖84-153、CP81-1254×崖84-153,CP65-357×崖82-96。     

四价抗病虫除草剂RNAi植物表达载体构建与转化甘蔗研究

甘蔗是重要的能源作物和糖料作物,面临病虫害日益严重问题。由于甘蔗遗传背景非常复杂,且缺乏必要种质,难以通过杂交培育抗病虫、除草剂聚合品种。基因工程技术提供了新方法。本研究利用BLAST比对获得甘蔗花叶病毒ScMV-CP基因和黄叶病毒ScYLV-CP基因的保守序列作为干扰序列,通过设计内切酶位点、生物合成和连接,获得全长687 bp的两个保守序列融合片段（MYCP）。并将其正向和反向插入中间载体pHANNIBAL上,形成双价病毒干扰结构。再通过在pHANNIBAL上添加SmaⅠ内切酶位点,将双价病毒干扰结构表达框和Cry1AC基因表达框结合;利用NotⅠ酶切,回收双价病毒干扰结构和Cry1AC基因表达框片段,连接到添加Bar基因表达框的表达载体pART27-Z上,构建了抗病虫及除草剂四价植物表达载体（pART27-MYCP-Cry1AC）。采用基因枪法将构建好的四价植物表达载体转入甘蔗品种FN15的胚性愈伤组织中,通过PPT（草丁膦）筛选获得了抗性再生甘蔗植株,经过PCR、定量以及Bt蛋白试纸检测,获得同时整合四种目的基因并表达的四价转基因甘蔗植株,为培育多抗甘蔗新品种提供了材料。     

甘蔗SPS基因家族成员表达与糖分积累关系解析

以甘蔗高糖品种福农95-1702和低糖品种ROC-5为材料，分析SPS I、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ在高、低糖这两个品种的幼叶、第三功能叶和不同蔗茎的表达，测定甘蔗糖分积累早期、中期和后期的糖分含量。结果显示，在功能叶和茎第二节中，三个阶段SPS家族成员在高糖品种的含量整体趋势高于低糖品种，结合蔗糖积累特点分析表明其可能在蔗糖合成中扮演着重要的角色。与正三叶相反，在幼叶中，三个阶段SPS家族成员在高糖品种的表达量整体趋势低于低糖品种，表明其可能与嫩叶的生长等其他生理性状相关，在成熟茎中，随着蔗糖积累时间的增加，高糖品种中的优势表达基因减少，而低糖品种中的优势表达基因增加，这可能与低糖品种中、后期大量积累蔗糖相关。     

利用MPCR技术快速检测进口大豆转基因背景

利用改良的CATB方法提取大豆(Glycine max)种子基因组DNA。以大豆内源ScII基因做对照，采用MPCR(Multiplex Polymerase Chain Reaction，MPCR)技术从进口大豆中检测出35S启动子、NOS终止子和EPSPS耐除草剂基因3种转基因成分。     

CP基因遗传转化甘蔗品种Badila与福农91-4621的抗病性差异分析

利用含甘蔗花叶病病毒E株系外壳蛋白基因(CP)的质粒pUbi-SCMV-CP,用基因枪轰击法遗传转化不同甘蔗品种,所获得的转基因无性系经过3代的抗病性鉴定和H2O2代谢的分析.结果表明,Badila(TB1)转基因植株具有较强的抗花叶病能力,而福农91-4621在转基因无性系T1、T2中表现出较强的抗病性,但在T3中其抗病性开始退化,发病率高达68%;抗病生理分析表明,转基因无性系的抗病性与H2O2清除和积累有关.经RT-PCR克隆和测序分析,福农91-4621所感染的SrMV-H的CP基因氨基酸序列与转化的SCMV-E的同源性较低,仅为73.2%,福建Badila所感染的是SCMV-D,与SCMV-E同源性高达97.8%.说明CP基因对本身所来源的病毒或是与原病毒亲缘关系较近的病毒可能具有较强的抗性,而对同属于SCMV的其他病毒虽有抗性,但抗性较弱,且随着转基因世代数的增加而降低.     

甘露糖对甘蔗外植体再生的影响

在甘蔗外植体再生体系的基础上,在甘蔗愈伤组织继代、胚性愈伤组织芽分化以及幼芽生根阶段的培养基中附加甘露糖,研究甘露糖对甘蔗外植体再生的影响,以确定用于甘蔗遗传转化筛选的最适浓度.结果表明,甘露糖对甘蔗茎尖愈伤组织诱导、愈伤分化和幼芽根形成均产生抑制作用.愈伤组织生长、分化、生根3个阶段的抗性筛选浓度分别为3-5、4-5和3 g.L-1.