秋水仙碱对猪卵母细胞成熟及MⅠ期纺锤体的影响

[目的]本试验旨在研究猪卵母细胞成熟过程中细胞骨架的动态变化以及秋水仙碱对卵母细胞成熟及MⅠ期纺锤体的影响。[方法]采用间接免疫荧光结合激光共聚焦显微成像技术,检测微管蛋白(α-tubulin)等细胞骨架蛋白的表达与亚细胞定位,之后采用秋水仙碱处理猪卵母细胞,研究秋水仙碱对卵母细胞成熟及MⅠ期纺锤体结构的影响。[结果]猪卵母细胞α-tubulin在生发泡破裂(GVBD)之后开始组装,第一次减数分裂中期(MⅠ)形成典型的纺锤体结构,第一次减数分裂后期至末期(ATⅠ)则分布于两组染色体之间,第二次减数分裂中期(MⅡ)在染色体附近重新组装形成典型的纺锤体;微丝蛋白(F-actin)在GVBD之后富集在细胞外周皮质下区域,并分别于MⅠ期和MⅡ期在纺锤体紧邻的皮质区富集形成微丝帽。在此基础上,通过秋水仙碱处理MⅠ期卵母细胞后,第一极体(pbⅠ)排出率显著下降,且绝大多数卵母细胞纺锤体解聚,染色体排列紊乱;但秋水仙碱撤除后,微管蛋白可重新组成MⅠ期纺锤体结构,延长培养时间后,pbⅠ排出率恢复。[结论]猪卵母细胞成熟过程中细胞骨架的动态变化具有阶段性分布特点,秋水仙碱可以使猪卵母细胞MⅠ期纺缍体发生解聚,成熟受到抑制,但秋水仙碱对MⅠ期卵母细胞纺缍体结构及功能的影响在一定程度上具有可逆性。     

小鼠卵母细胞减数分裂期间组蛋白乙酰化及其对卵母细胞成熟质量的影响

为了解卵母细胞减数分裂期间组蛋白乙酰化规律,以组蛋白H4K12的乙酰化为标记,利用免疫荧光技术,研究了小鼠卵母细胞减数分裂期间组蛋白乙酰化的变化规律及其对卵母细胞成熟质量的影响。结果表明:小鼠生发泡期卵母细胞中组蛋白高度乙酰化,在第1及第2次减数分裂中期则发生去乙酰化;II型组蛋白去乙酰基酶(HDACs)负责调控减数分裂过程中的组蛋白乙酰化;减数分裂过程中存在组蛋白乙酰化/去乙酰化的动态变化;特异性抑制II型HDACs不影响卵母细胞成熟、纺锤体形态和染色体排列,但广谱性抑制HDACs后会导致卵母细胞染色体排列发生改变。     

敲低TPX2对猪卵母细胞纺锤体组装及凋亡的影响

[目的]本研究旨在探究Xklp2靶蛋白(TPX2)在猪卵母细胞减数分裂过程中的表达定位及其潜在功能。[方法]采集猪卵丘-卵母细胞复合体(COC)并随机分组后进行体外成熟培养，通过间接免疫荧光染色与蛋白免疫印迹等方法检测TPX2在卵母细胞减数分裂过程中的亚细胞定位与动态表达情况；通过生发泡期(germinal vesicle, GV)显微注射特异性siRNA以敲低TPX2,研究其对卵母细胞减数分裂进程、纺锤体结构以及早期凋亡的影响。[结果]TPX2在第一次减数分裂中期(metaphaseⅠ,MⅠ)表达量显著上升，其亚细胞定位与α-微管蛋白(α-tubulin)的分布特点相似，并主要富集在纺锤体两极。TPX2被敲低后卵母细胞第一极体(PB1)排出率显著下降(P<0.05),且大多数细胞被阻滞在生发泡破裂期(GVBD)和第一次减数分裂后末期(ATⅠ),同时纺锤体结构异常比例显著升高(P<0.05),并伴随染色体排列紊乱。与对照组相比，敲低TPX2后卵母细胞早期凋亡率急剧增加(P<0.05),凋亡相关基因Caspase 3表达量以及Bax/Bcl2值显著升高(P<0.0...     

细胞松弛素B诱导虾夷扇贝多倍体的受精卵染色体分离状况

报道了采用细胞松弛素B (CB)处理虾夷扇贝 (Patinopectenyessoensis)受精卵抑制第一极体 (PB1 )释放的处理组与对照组的细胞染色体分离状况。结果表明 ,对照组中的受精卵具有 1 9条四分体染色体 ,经过减数分裂Ⅰ期和减数分裂Ⅱ期 ,放出PB1和PB2 ,受精卵的发育具有不同步性。处理组受精卵在第二次减数分裂中出现了特殊的分离类型 ,即“三级分离”、“联合二级分离”和“独立二级分离”。初步分析了细胞松弛素B抑制第一极体放出的机理     

小胡杨小孢子发生及微管骨架变化

利用间接免疫荧光结合DAPI(4′,6-diamidino-2-phenylindole)染色方法,进行了小胡杨小孢子母细胞减数分裂过程中微管骨架变化和染色体行为的研究。结果表明:①小胡杨小孢子发生过程中细胞内微管骨架呈动态变化过程,中期Ⅱ形成平行纺锤体和垂直纺锤体;末期Ⅱ未观察到典型的成膜体结构,同时型胞质分裂由子核间微管系统的相对界面发生,胞质分裂后形成四边形和四面体型四分体。②小胡杨小孢子母细胞减数分裂过程中还存在各种异常细胞学现象,中期Ⅰ和中期Ⅱ存在落后染色体;中期Ⅱ相互平行纺锤体发生联合;中期Ⅱ和后期Ⅱ孢母细胞两个纺锤体间的胞质会出现裂沟;四分体时期存在三分体和二分体等,说明由于远缘杂交而造成小胡杨染色体的异质性,并在减数分裂过程中得到体现。      

细胞松驰素B诱导虾夷扇贝多倍体的受精卵染色体分离状况

报道了采用细胞松驰素B（CB）处理虾夷扇贝（Patinopecten yessoensis）受精卵抑制第一极体（PBI）释放的处理组与对照组的细胞染色体分离状况。结果表明，对照组中的受精卵具有19条四分体染色体，经过减数分裂Ⅰ期和减数分裂Ⅱ期，放出PB1和PB2，受精卵的发育具有不同步性。处理组受精卵在第二次减数分裂中出现了特殊的分离类型，即“三级分离”、“联合二级分离”和“独立二级分离”。初步分析了细胞松驰素B抑制第一极体放出的机理。     

甘蔗茎尖细胞有丝分裂过程中微管骨架的变化

[目的]研究单子叶植物茎尖有丝分裂细胞的微管动态变化情况。[方法]采用冰冻切片法结合间接免疫荧光技术及DAPI染色,利用荧光显微镜观察甘蔗茎尖细胞有丝分裂时微管列阵的排列、转换及与染色体运动的关系。[结果]当周质微管形成时,细胞核保持完整;有丝分裂前期,周质微管转变为早前期微管带;当纺锤体微管形成时,细胞核膜破裂,染色体排列在细胞板位置;之后纺锤体微管向成膜体微管转换,纺锤体微管逐渐缩短而细胞板两侧微管逐渐增加,在这个过程中姊妹染色体被微管从细胞板处分离并牵引至两极,从而形成成膜体微管;之后两个子细胞的细胞核形成,并最终分裂,细胞数量增加。[结论]从细胞微管各时期的排列就可以判断出细胞分裂方向,了解其生长情况,为甘蔗增粗机理的研究提供例证。     

银灰杨花粉母细胞减数分裂与微管骨架变化

减数分裂是植物有性生殖过程中配子形成的必要阶段,是生殖生物学研究领域的热点。本文以银灰杨雄花枝为研究材料,运用醋酸洋红染色法和间接免疫荧光技术,开展银灰杨花粉母细胞减数分裂及其微管骨架动态变化研究。结果表明:1)银灰杨花药颜色变化可作为初步判别其花粉母细胞减数分裂时期的形态学标记,花粉母细胞从减数分裂细线期发育至四分体时期,花药颜色从嫩绿色,经由黄绿色、微红色、浅红色、鲜红色转为深红色。2)银灰杨花粉母细胞减数分裂末期Ⅰ可观察到与着丝粒微管紧密相连的落后染色体,由于染色体两侧着丝粒微管的均衡牵引而致使其停滞于细胞板中央,不移向两极而被遗弃,造成配子染色体的不平衡,可能是导致银灰杨花粉部分败育的机制。3)银灰杨的胞质分裂属于典型的连续型胞质分裂类型,受辐射状微管系统的调节,从细胞周沿向心扩展,直至细胞质完全分离。4)银灰杨花粉中存在天然2n花粉,其发生可能与减数分裂中期Ⅱ的平行纺锤体和三极纺锤体有关。本研究首次报道了银灰杨花药颜色变化与其花粉母细胞减数分裂进程的关系,从新的角度阐释了银灰杨落后染色体的形成原因及其花粉败育机制,并探索了银灰杨天然2n花粉的发生机理,为银灰杨遗传改良策略的制定奠定了基础。      

毛新杨×银灰杨杂种花粉母细胞减数分裂及花粉形态

利用醋酸洋红压片法观测毛新杨×银灰杨杂种雄株的减数分裂进程及花粉形态,为其基因资源的有效利用奠定基础。结果表明:室温20~25℃条件下,整个花期为7 d,减数分裂所需时间为39 h;在花粉母细胞减数分裂过程中,出现了融合纺锤体、平行纺锤体、垂直纺锤体、落后染色体、染色体桥等特异分裂相,且减数分裂产物中出现了单分体、二分体、三分体以及含微核的分体,说明毛新杨×银灰杨杂种在减数分裂过程中存在染色体不平衡现象;花粉粒的直径变化范围为15.07~54.61μm,平均直径为30.20μm,呈高斯分布,其中败育花粉率为9.47%,2n花粉率为1.41%。     

异源三倍体百合减数分裂染色体行为的研究

采用细胞遗传学方法,对Longiflorum×Asiatic系列异源三倍体百合 ‘Bonsoir’（2n=3x=36）小孢子母细胞减数分裂进行了研究和分析。结果显示,有64.31% 的花粉具有活力,且有活力的花粉大小范围在986.33~3 491.68 μm2之间,并呈双峰分布。形成败育花粉的主要原因如下:高度不规则的染色体配对、落后染色体、染色体桥、不均等分离、微核等现象。另外,减数分裂中期Ⅱ纺锤体的异常定向导致了末期Ⅱ二分体和三分体的形成,产生未减数的配子,如融合纺锤体和三极纺锤体;但平行纺锤体和垂直纺锤体不参与未减数配子的形成。一些小孢子母细胞在胞质分裂过程中未形成细胞板,导致单分体的形成以及二分体和三分体的增加,提高了未减数配子的频率。通过对小孢子发生过程中各种现象的观察,对异源三倍体百合在育种中的应用进行讨论。      

伏马毒素B1对猪体外成熟卵母细胞凋亡与自噬的影响

[目的]探究伏马毒素B,(fumonisin B1,FB1)对猪卵母细胞体外成熟的影响及其潜在的作用机制,为临床有效防治FB1所致的生殖毒性损伤提供理论参考.[方法]采集猪卵丘-卵母细胞复合体(cumulus oocyte complexes,COCs)进行随机分组,在体外成熟培养过程中分别用不同浓度FB1(0、10、...     

不同因素对小鼠MⅡ期卵母细胞纺锤体的影响

[目的]研究在不同条件下小鼠MⅡ期卵母细胞纺锤体的变化,为卵母细胞纺锤体的研究提供参考依据。[方法]在不同条件下处理小鼠MⅡ期卵母细胞,通过免疫细胞化学方法和激光共聚焦扫描显微镜观察其纺锤体变化。[结果]卵母细胞在25℃、20 min时纺锤体异常,25℃、30 min或4℃、10 min时纺锤体缺失;5、10、20和40μg/ml细胞松弛素B(CB)作用2 h未对纺锤体产生影响;卵母细胞在20μmol/L秋水仙素中作用1 h纺锤体异常,40μmol/L时作用1 h纺锤体缺失;在4%多聚甲醛中4℃条件下,卵母细胞纺锤体结构以固定时间为1~12 h效果较好。[结论]小鼠MⅡ期卵母细胞纺锤体对外界环境变化敏感,体外操作时控制外部环境是保持卵母细胞纺锤体正常生理功能的关键。     

Chromosome alignment and segregation regulated by ubiquitination of survivin

Proper chromosome segregation requires the attachment of sister kinetochores to microtubules from opposite spindle poles to form bi-oriented chromosomes on the metaphase spindle. The chromosome passenger complex containing Survivin and the kinase Aurora B regulates this process from the centromeres. We report that a de-ubiquitinating enzyme, hFAM, regulates chromosome alignment and segregation by controlling both the dynamic association of Survivin with centromeres and the proper targeting of Survivin and Aurora B to centromeres. Survivin is ubiquitinated in mitosis through both Lys(48) and Lys(63) ubiquitin linkages. Lys(63) de-ubiquitination mediated by hFAM is required for the dissociation of Survivin from centromeres, whereas Lys(63) ubiquitination mediated by the ubiquitin binding protein Ufd1 is required for the association of Survivin with centromeres. Thus, ubiquitinaton regulates dynamic protein-protein interactions and chromosome segregation independently of protein degradation.     

小麦生理型雄性不育系微丝骨架和胼胝质的变化与其相关基因的表达分析

【目的】研究生理型雄性不育小麦花粉细胞内微丝和胼胝质的结构及其相关基因的表达,并揭示其与生理型雄性不育的关系,为进一步研究化学杂交剂SQ-1诱导小麦生理型雄性不育的机理提供一定的理论依据。【方法】以化学杂交剂SQ-1诱导的生理型雄性不育系ms(A)-西农1376及对应正常可育系(A)-西农1376为试材,用TRITC-phalloidin标记细胞内微丝,苯胺蓝标记胼胝质,qRT-PCR技术分别对肌动蛋白解聚因子TaADF（Actin depolymerizing factor）、类葡聚糖合成酶TaGSL（Glucan synthase-like）进行差异表达分析。【结果】(1)在减数分裂前期Ⅰ、中期Ⅰ、后期Ⅰ这三个时期,生理型雄性不育系花粉细胞的微丝结构与可育系没有显著差异：前期Ⅰ,微丝分布于整个细胞质中,细胞核区域也可见少量微丝环绕细胞核;中期Ⅰ,微丝分布在细胞质中,在形成纺锤体部位染色更深,形成纺锤体微丝,由细胞两极发出的纺锤体微丝伸向赤道板;后期Ⅰ,在向两极移动的染色体的中间部位染色较深,微丝分布较多。(2)在早末期Ⅰ,与可育系相比,不育系花粉细胞没有形成清晰且明显可见的中国灯笼状成膜体微丝结构,且在细胞中线部位亦没有清晰可见的微丝累积。(3)晚末期Ⅰ,可育系花粉细胞在形成细胞板的部位是线性的、平滑的,成膜体微丝消失,而不育系花粉细胞在形成细胞板的部位形成了很大的缝隙,同时,可育系胼胝质在细胞板处的沉积比较平滑,而不育系胼胝质在细胞板处的沉积较可育系相比缺乏,并且是褶皱的、有裂纹的。(4)四分体时期,可育系花粉可见围绕细胞核的辐射状微丝,不育系花粉细胞中微丝呈模糊状态,并且不育系中胼胝质染色的整体荧光强度较可育系减弱。利用实时荧光定量PCR技术分析肌动蛋白解聚因子TaADF和类葡聚糖合成酶TaGSL在减数分裂期的相对表达量,结果发现,不育系中TaADF的相对表达量是可育系的4.28倍,由于TaADF表达量上调,加剧了细胞内微丝解聚,微丝结构受到破坏,同时不育系中TaGSL表达量下降,只有可育系的0.83倍,胼胝质的沉积也受到影响。【结论】TaADF在不育系中上调表达,破坏了细胞内微丝的正常结构,使微丝不能正常行使其功能,进而可能导致花药发育中与育性相关的某些代谢通路等受到影响。与此同时,微丝结构的破坏导致细胞板形成出现异常也可能是引起胼胝质在细胞板处沉积受到影响的一个重要原因。因此,微丝和胼胝质的异常变化与化学杂交剂SQ-1诱导的生理型雄性不育密切相关。     

Chromosome choreography: the meiotic ballet

The separation of homologous chromosomes during meiosis in eukaryotes is the physical basis of Mendelian inheritance. The core of the meiotic process is a specialized nuclear division (meiosis I) in which homologs pair with each other, recombine, and then segregate from each other. The processes of chromosome alignment and pairing allow for homolog recognition. Reciprocal meiotic recombination ensures meiotic chromosome segregation by converting sister chromatid cohesion into mechanisms that hold homologous chromosomes together. Finally, the ability of sister kinetochores to orient to a single pole at metaphase I allows the separation of homologs to two different daughter cells. Failures to properly accomplish this elegant chromosome dance result in aneuploidy, a major cause of miscarriage and birth defects in human beings.     

青黑杨杂种三倍体花粉母细胞减数分裂染色体行为及其花粉变异研究

目的本研究通过分析青黑杨杂种三倍体的花粉母细胞减数分裂特征和配子变异规律,为进一步利用三倍体种质作为中介材料进行杨树染色体工程育种奠定基础。方法本研究以雌配子染色体加倍来源的‘哲引3号杨’ × ‘北京杨’杂种三倍体WT-21及杂种二倍体WD-2雄株为材料,基于醋酸洋红染色压片观察,比较分析了两者花粉母细胞减数分裂染色体行为及花粉形态变异。结果（1）无论是三倍体杂种WT-21还是二倍体杂种WD-2,其花粉母细胞减数分裂染色体行为均非常丰富,存在高频率的染色体提前分离、落后染色体、微核等异常现象,反映了亲本基因组间较强的异质性。（2）WT-21和WD-2花粉母细胞减数第二次分裂过程均存在平行纺锤体、融合纺锤体、三极纺锤体等异常定向,而且在WT-21中还发生胞质提前分裂,共同导致减数分裂产物中二分体、三分体等的产生。（3）三倍体WT-21的花粉空瘪率达44.55%,高于二倍体WD-2;WT-21饱满花粉的直径显著大于WD-2,从花粉直径分布可推测出WT-21能产生少量未减数花粉;WT-21的花粉生活力为（1.08 ± 0.44）%,显著低于二倍体WD-2（28.67% ± 2.04%）。结论由于倍性效应和杂合性的双重影响,青黑杨杂种三倍体的花粉母细胞减数分裂存在复杂的染色体行为,并对配子发育造成影响;利用三倍体的花粉进行授粉,可能获得非整倍体和四倍体后代,为杨树染色体操作奠定基础。      

Anaphase inactivation of the spindle checkpoint

The spindle checkpoint delays cell cycle progression until microtubules attach each pair of sister chromosomes to opposite poles of the mitotic spindle. Following sister chromatid separation, however, the checkpoint ignores chromosomes whose kinetochores are attached to only one spindle pole, a state that activates the checkpoint prior to metaphase. We demonstrate that, in budding yeast, mutual inhibition between the anaphase-promoting complex (APC) and Mps1, an essential component of the checkpoint, leads to sustained inactivation of the spindle checkpoint. Mps1 protein abundance decreases in anaphase, and Mps1 is a target of the APC. Furthermore, expression of Mps1 in anaphase, or repression of the APC in anaphase, reactivates the spindle checkpoint. This APC-Mps1 feedback circuit allows cells to irreversibly inactivate the checkpoint during anaphase.     

Vinblastine and griseofulvin reversibly disrupt the living mitotic spindle

Using polarized light we have studied the effects of various mitotic poisons on mitotic spindles of living Pectinaria oocytes; we have studied fixed specimens with phase and electron microscopy. Vinblastine caused attrition and eventual disappearance of spindle structure as rapidly as did colcemid, and subsequent recovery from this treatment was at least as fast as that from colcemid. Griseofulvin, however, was easily the best agent for rapid, reversible, and repeated dissolution of the spindle. Agents that arrest metaphase may act on nondividing cells by interfering with the organization of other gelated structures.     

Female germ cell aneuploidy and embryo death in mice lacking the meiosis-specific protein SCP3

Aneuploidy (trisomy or monosomy) is the leading genetic cause of pregnancy loss in humans and results from errors in meiotic chromosome segregation. Here, we show that the absence of synaptonemal complex protein 3 (SCP3) promotes aneuploidy in murine oocytes by inducing defective meiotic chromosome segregation. The abnormal oocyte karyotype is inherited by embryos, which die in utero at an early stage of development. In addition, embryo death in SCP3-deficient females increases with advancing maternal age. We found that SCP3 is required for chiasmata formation and for the structural integrity of meiotic chromosomes, suggesting that altered chromosomal structure triggers nondisjunction. SCP3 is thus linked to inherited aneuploidy in female germ cells and provides a model system for studying age-dependent degeneration in oocytes.     

The mitotic spindle: a self-made machine

The mitotic spindle is a highly dynamic molecular machine composed of tubulin, motors, and other molecules. It assembles around the chromosomes and distributes the duplicated genome to the daughter cells during mitosis. The biochemical and physical principles that govern the assembly of this machine are still unclear. However, accumulated discoveries indicate that chromosomes play a key role. Apparently, they generate a local cytoplasmic state that supports the nucleation and growth of microtubules. Then soluble and chromosome-associated molecular motors sort them into a bipolar array. The emerging picture is that spindle assembly is governed by a combination of modular principles and that their relative contribution may vary in different cell types and in various organisms.