广西西瓜花叶病病原病毒鉴定

从广西各西瓜主产区采集到表现花叶症状的样品124份,经ELISA测定,所采样品均与西瓜花叶病毒二号(WMV-2)抗血清呈阳性反应,与黄瓜花叶病毒(CMV)、烟草花叶病毒(TMV)抗血清呈阴性反应.取典型样本摩擦接种西瓜、西葫芦、南瓜、黄瓜、毛节瓜、瓠瓜、罗汉果等葫芦科植物表现花叶症状;接种苋色藜产生局部坏死斑;接种番木瓜、普通烟、心叶烟、番茄、辣椒、豇豆等无任何症状反应.该病毒还可通过棉蚜和嫁接传染.病毒初提纯液经电子显微镜观察,发现许多大小为12nm×(600～800)nm的线状病毒.ELISA测定结果显示,该病毒与莴苣花叶病毒(LMV)、大豆花叶病毒(SMV)抗血清呈阳性反应,它们之间有密切的血清学关系.据此,广西西瓜花叶病的病原病毒应为西瓜花叶病毒二号(WMV-2).     

大豆单锌指蛋白基因GmSZFP的克隆及其在SMV与寄主互作中的功能

【目的】由大豆花叶病毒（soybean mosaic virus,SMV）引起的大豆花叶病是世界性大豆病害之一,利用病毒诱导的基因沉默（virus induced gene silencing,VIGS）技术研究GmSZFP在大豆与SMV互作过程中发挥的功能,为深入探讨其分子机制奠定基础。【方法】以大豆品种冀豆7号与SMV毒株SC-8、N3组成的亲和、不亲和组合为试验材料,运用生物信息学预测GmSZFP的分子结构特征;以酵母转录激活试验检测其转录因子活性;借助实时定量PCR（RT-qPCR）验证GmSZFP在大豆与SMV互作中转录水平的表达特征;结合VIGS技术探究GmSZFP在大豆与SMV互作过程中的功能。【结果】通过PCR克隆GmSZFP的CDS区,序列全长为1 071 bp;氨基酸序列分析和酵母转录激活试验发现GmSZFP为C₂H₂型锌指蛋白转录因子,且具有转录激活活性;RT-qPCR结果显示,GmSZFP受SMV的强烈诱导,在亲和组合与不亲和组合中的表达模式不同,在不亲和组合中,GmSZFP呈先上升后下降的表达趋势,其表达水平明显高于亲和组合,若在接种病毒前给叶片预注射咪唑,GmSZFP的表达水平降低,并与亲和组合相近,说明GmSZFP在转录水平响应SMV的侵染并受胞内H₂O₂信号调控;利用VIGS技术沉默GmSZFP后,发现接种部位胼胝质的积累水平较对照大大降低,RT-qPCR检测胼胝质合酶基因GmGSL7c和GmGSL12b的表达量较对照降低,胼胝质水解酶基因BG的表达量较对照增加;在基因沉默植株叶片上点接种SMV后72 h,病毒向外扩散至2 mm,在96 h时病毒扩散至3 mm,而对照组叶片在接种点外始终未能检测到SMV外壳蛋白CP的表达;摩擦接种SMV后10 d,在基因沉默植株的上位叶表现出花叶、失绿和卷曲等感病症状,并检测到CP的表达,说明沉默GmSZFP后,SMV在胞间扩散和长距离运输的能力均增强。【结论】大豆GmSZFP是典型的C₂H₂型单锌指蛋白,GmSZFP在大豆抵抗SMV侵染过程中发挥正调控作用。     

小豆种质资源对大豆花叶病毒病抗性的初步研究

大豆花叶病毒（SMV）病是危害大豆的最主要病毒病之一，在我国不同地区普遍发生且各地生理小种都有不同。小豆病毒病近年来在各地发生具有加重的趋势，但小豆病毒侵染来源等相关研究不甚清楚。利用大豆花叶病毒流行生理小种对来自国内不同地区的小豆品种进行接种侵染研究，接种SMV于137份小豆品种，调查发病情况发现50个品种发病，症状包括花叶、矮缩、坏死，说明大豆花叶病毒也可侵染小豆，且大多数症状为花叶，破坏寄主的叶绿体功能。2个SMV株系的发病品种数量无明显差异，说明病毒的侵染范围与病毒的致病力强弱无必然联系，只与寄主的“基因－基因”识别有关。该发现为国内首次相关报道，为小豆病毒病的研究打下了相关基础。     

油菜病毒病汁液摩擦接种方法

油菜病毒病的病毒有三种类型,即蕪菁花叶病毒、烟草花叶病毒和黄瓜花叶病毒,但主要为害的是蕪菁花叶病毒。传病的方式是:当油菜收获后,通过蚜虫这个媒介把病毒传至夏季生长的十字花科植物上;到了秋季油菜出苗后,又借蚜虫把病毒从越夏寄主传回油菜。种子不传病;新鮮病体在土壤中虽能引起植株发病,但发病率很低。因此,研究油菜病毒病常用的蚜虫接种和汁液摩擦接种,这两种方法均能誘致油菜的高度发病。由于汁液摩擦接种方法比較簡便,应用广泛。故将有关这一方法的接种技术和个人工作体会綜述如下,供参考。     

TRV介导的大豆基因瞬时沉默体系的建立

【目的】病毒诱导的基因沉默（virus-induced gene silencing,VIGS）技术已在植物基因功能研究领域得到广泛应用。建立以TRV为载体介导的大豆基因瞬时沉默体系,为将烟草脆裂病毒（Tobacco rattle virus,TRV）介导的基因沉默技术在大豆与大豆花叶病毒（Soybean mosaic virus,SMV）互作体系中对大豆基因功能进行研究提供基础。【方法】从大豆品种冀豆7号（J7）叶片中特异性扩增八氢番茄红素脱氢酶基因（GmPDS）的部分片段,并将该基因片段插入质粒pTRV﹕RNA2中;向J7的第一位真叶注射携带有TRV或TRV﹕GmPDS的农杆菌,注射后对上部未接种病毒的叶片进行表型观察,并通过半定量RT-PCR检测GmPDS的表达量。为探讨接种TRV是否影响大豆对SMV的抗性表现,在大豆第一片真叶上预接种TRV病毒后10 d,再分别接种SMV株系N3和SC-8,以单独接种N3或SC-8作为对照。待接种SMV后第5天观察未接种的上位叶表型并检测SMV的外壳蛋白基因CP。【结果】大豆叶片注射携带有TRV﹕GmPDS的农杆菌后25 d,上部未接种病毒的叶片出现了白化现象,通过半定量RT-PCR分析,发生白化的植株中GmPDS的表达量明显降低。在此基础上,向大豆叶片预注射携带有TRV的农杆菌后再接种SMV,SMV株系N3和SC-8与J7分别组成不亲和与亲和组合。 发现J7第一片真叶上预接种TRV后再接种SMV株系N3,与单独接种N3对上位叶的影响在表型上表现一致,对未接种的上位叶片进行病毒外壳蛋白基因CP检测,发现J7单独接种N3以及预接种TRV后再接种N3的上位叶片上均未能检测到CP表达。而J7单独接种SMV株系SC-8,以及预接种TRV后再接种SC-8均在上位叶上能够检测到CP。说明在J7上预接种TRV不影响J7对SMV的抗性。在感病品种南农1138-2上也获得了相似结果。【结论】建立了以TRV为载体介导的大豆基因瞬时沉默体系,并证明在大豆上先接种TRV不改变大豆对SMV的抗性表现。     

菜心BcSVP基因mRNA在异源嫁接体中的运输分析

为研究菜心BcSVP基因mRNA的长距离运输,本研究将结球甘蓝茎尖作为接穗嫁接到砧木菜心的花序轴上,构建结球甘蓝/菜心异源嫁接体。基于菜心和结球甘蓝的转录组测序的read文库,拼接获得了菜心的BcSVP和结球甘蓝BoSVP基因编码序列和3’UTR序列。利用菜心BcSVP在3’UTR的种间差异序列(CF和CR),分别在异源嫁接(结球甘蓝/菜心嫁接)的接穗结球甘蓝茎尖的转录组测序read文库T01和T02中筛选到2条和1条来自砧木菜心的BcSVP的read。利用结球甘蓝BoSVP在3’UTR的种间差异序列(GF和GR),计算了结球甘蓝内源BoSVP基因的转录表达量,显示异源嫁接和同源嫁接的接穗结球甘蓝茎尖中BoSVP基因的表达量差异不明显。本研究鉴定了菜心BcSVP基因的mRNA在异源嫁接体中的长距离运输,对进一步研究菜心BcSVP基因的mRNA长距离运输机制及其生物学功能奠定了基础。     

基于系统获得性沉默的果树砧木分子育种

在果树栽培生产中嫁接是主要的繁殖方式,砧木育种是果树育种的重要内容。近些年来的研究表明,一些mRNA和小RNA能够在植物细胞间移动,并且能够穿过嫁接口在植物体内长距离运输传递。总结了能够通过嫁接长距离传递的植物内源RNA分子的种类,介绍了基因沉默原理和技术,提出了基于系统获得性沉默原理的果树砧木分子育种策略,并分析了其可能存在的问题,为进一步开展果树砧木分子育种提供思路和参考。     

植物源病毒抑制物WCT-Ⅱ防治烟草花叶病毒的机理初探

植物源病毒抑制物WCT—Ⅱ喷施于接种烟草花叶病毒(TW)的烟草上，与仅接种TWV未经WCT—Ⅱ处理的发病对照相比，烟草叶片中叶绿素含量提高了58．0％，碱溶性胞内几丁质酶和碱溶性胞间几丁质酶活性分别提高27．0％和40．7％，碱溶性胞内和酸溶性胞间 β-1，3-葡聚糖酶活性分别提高22．1％和140．0％。上述研究结果表明，WCT—Ⅱ能启动植物的一系列抗病防御反应，诱导植物产生抗病性。     

大豆花叶病毒超低温保存对毒力的影响

大豆花叶病毒叶片分5个不同时期,冰冻于-86℃超低温冰箱中,次年取出接种于感病品种上。经测定,在-86℃超低温保存状态下,1个月以内能保持较强的病毒毒力,可以直接作为大豆花叶病毒毒源用于抗性鉴定接种。8～9个月毒力明显降低。在用于抗性鉴定之前,应先增加一次活体繁毒程序。     

苹果病毒病发生与防治

正目前,苹果病毒病有6种,分别为褪绿叶斑病毒、茎痘病毒、茎沟病毒、锈果类病毒、花叶病毒和绿皱果病毒,其中前3种为潜隐性病毒,后3种属显性病毒。1发生与传播1.1褪绿叶斑病毒通过机械接种和嫁接传播。一般栽培品种感染褪绿叶斑病毒后无明显症状,叶片上产生黄色斑驳,或呈环斑或线纹斑。苹果褪绿叶斑病毒在木本寄主上可经嫁接传染。苹果花瓣中的病毒比叶片多,病毒在不同枝条上的分     

大豆资源对大豆花叶病毒病(SMV)东北3号及黄淮7号株系的抗性研究

大豆花叶病毒(Soybean Mosaic Virus,SMV)是危害大豆的世界性病害之一,不同的大豆花叶病毒株系致病力不同,不同大豆品种对不同株系的抗病性反应也存在很大的差异。本试验对237份大豆种质资源,采用人工汁液摩擦法接种大豆花叶病毒东北3号株系和黄淮7号株系进行抗性鉴定。结果表明,3份材料对东北3号株系表现出高抗,5份材料对黄淮7号株系表现出高抗。高抗材料主要来自于河北、山东、北京。野生大豆品种中,4份材料对东北3号株系表现出高抗,2份材料对黄淮7号株系表现出高抗。高抗材料主要来自于山西、甘肃、河南。     

不同省份大豆新品种(系)对东北大豆强弱花叶病毒株系的抗性鉴定

利用网室内人工接种法对103份不同省份大豆新品种(系)进行了弱毒株系SMV1和强毒株系SMV3的抗性鉴定.结果表明,抗SMV1株系的大豆新品种(系)有95份,占参试材料的92.2％,抗SMV3株系的品种(系)有53份,占参试材料的51.5％;兼抗SMV1和SMV3的有51份,占参试材料的49.5％,其中高抗SMV1和S...     

过表达酵母PAC1增强转基因大豆对大豆花叶病毒的抗性

【目的】大豆花叶病毒（soybean mosaic virus,SMV)病是中国大豆产区最主要的病害之一,严重影响大豆产量和籽粒品质。核糖核酸酶PAC1能够识别和降解植物RNA病毒或类病毒复制过程中产生的dsRNAs,从而有效抑制病毒在寄主中的复制与积累。PAC1的这一特点为广谱抗RNA病毒及类病毒转基因作物的创制和培育提供了有效的靶标基因。本研究利用转基因技术,将来源于粟酒裂殖酵母菌(Schizosaccharomyces pombe)的PAC1导入栽培大豆,研究过表达PAC1对大豆SMV抗性的影响,为抗SMV转基因大豆新品种选育提供依据。【方法】采用酶切连接技术,将PAC1连接到双元表达载体pCAMBIA3300中,构建植物表达载体pCAMBIA3300-PAC1。目的基因启动子为组成型强启动子CaMV 35S,终止子为NOS,筛选标记为草铵膦抗性基因BAR。采用农杆菌介导转化法,将PAC1导入栽培大豆品种Williams82。在利用PAT/BAR试纸、PCR及除草剂（500 mg·L^-1 Basta）喷施检测基础上,通过Southern杂交技术进一步分析外源基因在转基因大豆中的整合情况和拷贝数。采用人工摩擦接种法,对T₂和T₃代转基因大豆株系进行田间抗SMV鉴定农艺性状调查,分析转基因大豆对SMV抗性及遗传稳定性。并利用qRT-PCR技术分析接种SMV 28 d后转基因大豆中SMV积累水平。【结果】共转化2 600多个外植体,获得耐草铵膦（5 mg·L^-1）大豆再生植株76株。PCR检测结果表明,其中65株能够扩增出目的条带,大豆遗传转化效率为2.48%。对T₁-T₃代转基因大豆株系喷施除草剂表明,在500 mg·L^-1 Basta处理7 d后,转基因植株表型没有明显变化,而对照（非转基因大豆）植株叶片则黄化枯死。Southern杂交结果表明,外源基因以低拷贝的方式(1-2个)整合至大豆基因组中。摩擦接种SMV SC-3鉴定表明,在接种35 d后,对照出现严重花叶、皱缩等典型SMV发病症状,而转基因大豆仅部分叶片表现出轻微的花叶症状,其病情指数降低至11.11-22.22,较对照（病情指数36.81-46.24）显著降低,且SMV抗性在转基因大豆不同代际间能够稳定遗传。qRT-PCR分析表明,在接种SMV SC-3株系28 d后,转基因大豆中SMV CP表达水平较对照极显著下降。农艺性状调查表明,在未接种SMV条件下,转基因大豆在叶形、花色、种皮色、种脐色、株高、节数、结荚高度、生育期及百粒重等方面与对照没有显著差异。【结论】PAC1过表达显著抑制了SMV的积累及症状发展,增强了转基因大豆对SMV的抗性水平。     

两个不同株系大豆花叶病毒侵染大豆细胞的超微病变比较研究

以大豆品种冀豆7号和大豆花叶病毒(SMV)株系SC-8、N3分别组成感病和抗病组合,运用电子显微镜比较观察了不同组合中大豆叶片细胞的超微结构变化。结果显示:在抗病组合的叶肉细胞中,侵染早期(接种8～12h),叶绿体膨胀,叶绿体片层结构轻微零乱,核染色质发生凝集现象;接种后24h,叶绿体继续膨胀变形,线粒体结构清晰完整,核变形严重;侵染后期(接种后72 h),细胞核近乎衰败,双层核膜已基本辨认不清,叶绿体结构基本解体。此时线粒体嵴突已发生退化,只有双层膜结构,内部出现空虚状态。细胞中的病毒粒子很少,也没发现柱状内含体结构。在此过程中,叶绿体和细胞核是最早做出反应的细胞器,而线粒体是最后解体的细胞器。感病组合中叶肉细胞超微结构的变化比抗病组合晚了10 h以上,细胞器的结构变化特征与抗病组合相似,但在所观察的整个互作过程中,核、叶绿体和线粒体的衰退是同步的,显示出了细胞被动死亡的特征;且在细胞死亡的整个过程中叶绿体上均有淀粉粒的积累,另外还观察到线粒体的异常增加现象,这可能是为了病毒粒子的增殖和柱状内含体的产生提供能量所致。     

北方春大豆品系大豆花叶病的鉴定与抗原筛选

为了详细了解我国近几年来育成的北方春大豆品系对花叶病毒病的抗性表现,本研究通过分析2003～2007年的国家北方春大豆品种区域试验和生产试验病毒病2个流行株系(SMV1和SMV3)抗性鉴定数据,筛选兼抗SMV1号和SMV3号株系的抗原有19份,专抗SMV1号株系的抗原55份,专抗SMV3号株系的抗原20份,并发现辽宁省的新品系对2个株系的抗性表现都是最好的,尤其是表现抗病级别(R)的品系较多;而黑龙江省对2个株系的抗性表现都是最差的,尤其是对3号株系,大部分表现感病。建议黑龙江省今后要重视花叶病毒与抗性育种,可以考虑从辽宁和吉林两省引入抗原,进行品种选育和抗性改良。     

对大豆花叶病毒不同抗性类型品种的细胞超微结构特征

对质量抗性、数量抗性以及感病 3类品种接种大豆花叶病毒 (SMV) 后的叶肉细胞超微结构观察表明: 在未感染的对照品种南农 1138 2以及接种Sa株系的质量抗性品种科丰一号的细胞中没有病毒粒体和病毒内含体, 细胞超微结构正常。在接种Sa株系后的感病品种南农 1138 2的叶肉细胞中出现大量成簇的线状病毒粒子聚集体和柱状内含体, 柱状内含体横切面呈风轮状, 许多细胞出现核固缩、核膜降解、异染色质边聚、核仁融解、叶绿体被膜破碎甚至瓦解消失、基质及基粒片层解体或肿胀扭曲。数量抗性品种接种Sa株系后, 个别细胞中发现线状病毒粒子和风轮状内含体, 少数叶绿体的片层结构肿胀扭曲, 细胞核、线粒体的被膜以及形状和结构轻度受损。上述结果表明, 数量抗性品种的受害程度明显小于感病品种, SMV引起的超微病变特征在 3类抗性品种间是显著不同的。     

大豆品种接种SMV叶片POD同工酶的研究

研究采用成株感 SMV1号、 3号株系大豆品种合丰 2 5、丰收 12 ,抗 SMV1号而感 SMV3号株系品种东农 81- 4 3、铁 6 915(东农 ) ,抗 SMV1号、 3号株系品种东农 93- 0 4 6、东农 92 - 0 70 ,在隔离网室内采用盆载试验 ,于对生真叶期采用人工汁液摩擦法分别接种 SMV1号、3号株系 ,以未接种健株为对照 ,在大豆鼓粒初期测定分析叶片 POD同工酶。结果表明 ,抗感品种未接种健株叶片 POD同工酶谱带没有明显差异 ,POD活性品种间略有差别 ,但 POD活性与抗性没有相关。分别接种 SMV二个株系后 ,各品种 POD同工酶谱带数目不变 ,一些酶带活性发生变化。合丰 2 5、丰收 12接种 SMV后 ,叶片 POD同工酶活性增强 ,且接种 3号株系增加得大。说明 SMV毒性越强 ,植株感病越严重 ,POD活性变化越大。因此 ,叶片 POD活性的增强是植株感病的生化症状。东农 81- 4 3、铁 6 915接种 SMV1号株系后 ,叶片 POD同工酶和活性没有明显变化 ,接种 SMV3号株系后 ,叶片 POD同工酶活性增强。说明同一品种对二个株系的抗性不同 ,POD的变化也不同。东农 93- 0 4 6和东农 92 - 0 70接种二个株系后 ,POD同工酶没有明显变化 ,接种 SMV3号株系后 ,POD活性略降低     

大豆叶片及种子内大豆花叶病毒(SMV)的生物与免疫测定方法的比較

用生物测定(局部枯斑反应)、免疫吸附电镜(ISEM)、酶联免疫吸附试验(ELISA)三种方法对大豆叶片及种子内的SMV进行了定性定量测定。结果表明,三种方法均可用来检测叶片及种胚和子叶内的SMV,并可对其定量,结果高度吻合,相关系数达0.97以上。ELISA能测出稀释2430—7290倍病叶中的SMV,测提纯病毒的下限为70ng—20ng/ml,生物测定可测出稀释640—1280倍病叶中的SMV。种皮内含有非侵染性SMV,不能用生物方法测出,而需用免疫方法检测。     

大豆抗大豆花叶病毒病基因研究进展

大豆花叶病毒(soybean mosaic virus,SMV)病是严重危害世界大豆(Glycine max(L.)Merr.)生产的主要病害之一。近十年来,国内外关于大豆对SMV抗病基因的遗传标记定位、候选抗病基因的分析及大豆抗SMV的调控网络等研究取得许多新进展。大豆对SMV的抗性遗传主要分为数量抗性和质量抗性,其中数量抗性的遗传主要由1对加性主基因+加性-显性多基因共同控制;对不同SMV株系的质量抗性遗传分别由1对不同的显性基因控制。标记定位研究发现,大豆对SMV数量抗性位点主要分布在大豆的第6、10和13等染色体上。22个对SMV具有单显性质量抗性的基因位点已被标记定位在大豆的第2、6、13和14染色体上,且定位的多数抗病基因位点两侧标记间的物理距离都在1 Mb以内。其中第13染色体上的基因位点数最多,有Rsv1、Rsv5、RSC3Q、RSC11和RSC12等10个,定位在第2染色体上的基因位点有8个,如Rsv4、RSC5、RSC6、RSC7和RSC8等,第6和14染色体上各有2个基因位点,分别为RSC15、RSC18和Rsv3、RSC4。参考大豆全基因组序列(http://www.phytozome.net/soybean),利用生物信息学方法、表达谱分析及克隆测序技术等进一步缩小了大豆抗SMV候选基因的筛选范围。目前,在大豆第2染色体上确定的抗SMV候选基因主要有8个:Glyma.02G121400、Glyma.02G121500、Glyma.02G121600、Glyma.02G121800、Glyma.02G121900、Glyma.02G122000、Glyma.02G122100和Glyma.02G122200,在第6染色体上的是Glyma.06G182600,在第13和14染色体上的抗SMV候选基因分别有9个和6个:Glyma.13G184800、Glyma.13G184900、Glyma.13G187900、Glyma.13G190000、Glyma.13G190300、Glyma.13G190400、Glyma.13G190800、Glyma.13G194700、Glyma.13G195100和Glyma.14G204500、Glyma.14G204600、Glyma.14G204700、Glyma.14G205000、Glyma.14G205200、Glyma.14G205300。基于病毒诱导的基因沉默VIGS(virus induced gene silencing,VIGS)和转基因操作等技术,研究发现抗SMV相关基因Gm HSP40、Gm PP2C3a、Gm AKT2、Gm Cnx1、Gm SN1、Glyma.14G204500、Glyma.14G204600、Glyma.14G204700等参与大豆对SMV的抗性,属于正调控因子;而Gm EF1A和Gme IF5A等则增加大豆对SMV的易感性,为负调控因子。在综合SMV抗病基因的相关研究基础上,构建了基于Rsv1和Rsv3介导对SMV极端抗性的调控网络模型。Rsv1介导的大豆对SMV极端抗性调控模型的建立为大豆抗SMV信号网络的研究提供了新的方向。Rsv3介导的大豆对SMV极端抗性的主要机制是通过ABA信号的传导,从而使胞间连丝处的胼胝质沉积以抑制病毒从最初侵染的细胞向健康细胞的转移。本文系统综述了SMV抗病基因方面的最新研究成果并对该领域未来的研究方向进行了展望,以期为大豆抗SMV分子设计育种和抗病基因的机理研究提供参考。