猪源奇异变形杆菌分离与鉴定及16S rRNA基因序列同源性分析

为了解奇异变形杆菌在猪群中感染情况,2016年9-12月从河南省规模化猪场采集病料,进行奇异变形杆菌的分离、鉴定及药敏试验;将分离菌株16SrRNA基因序列与GenBlank中其他不同来源且同源性匹配较高的奇异变形杆菌菌株构建系统发育树。结果表明:从河南省规模化猪场18起病例中,共分离3株奇异变形杆菌,分别命名为Ly、Ymh和Hbqx;与其他12株奇异变形杆菌的同源性分别为99.1%~99.4%、99.4%~99.8%和99.4%~99.9%,Ly、Ymh和HbqX间同源性为99.3%~99.4%。其中,Ly与KF051776(中国深圳株)、KC456539(中国云南株)同源性最高,为99.4%;Ymh与HQ259932(中国河北株)同源性最高,为99.8%;Hbqx与KC456539(中国云南株)同源性最高,为99.9%。3株奇异变形杆菌对青霉素、氨苄西林、卡那霉素、阿莫西林、多西环素、恩诺沙星、多粘菌素、氯霉素、萘啶酸和磺胺异恶唑均耐药,对其他药物耐药性不同。     

大鼠粪便中奇异变形杆菌的分离

以大鼠粪便样品为试材,经多次分离培养,获得了8个特异菌落,其直径为1～2 mm,革兰氏染色阴性。以分离菌株的基因组DNA为模板,利用细菌16S rRNA通用引物对菌株进行PCR扩增,并对扩增产物进行测序。结果表明,测序结果与GenBank中已报道的奇异变形杆菌(Proteus mirabikis)菌株的序列相似性为100%。结合形态学特征,初步鉴定菌株32N、36N、20A为奇异变形杆菌。奇异变形杆菌为条件致病菌,应注意避免动物粪便对水及食物的污染。     

淡腌黄鱼制品品质评价及细菌菌相分析

从生产企业和当地超市随机抽取5批真空包装淡腌黄鱼,对其感官、理化、微生物品质及残存细菌进行定性及定量研究。结果表明:各产品栅栏因子及其强度存在一定差异,水分含量为43.35%～71.50%,Aw为0.90～0.97,pH值为6.35～7.13,盐分含量为2.69%～3.13%。产品品质的差异由栅栏因子种类和强度的不同决定,感官评价均可接受。挥发性盐基氮为13.60～26.33 mg/100g。过氧化值为2.13～3.13 meq/kg,细菌总数为4.56～6.19 lgCFU/g,大肠菌群均低于30 MPN/100g。从5批淡腌黄鱼样品中总共分离得到293株细菌。菌相组成比较单一,主要存在3种菌落,分别为普通变形杆菌(Proteus vulgaris)、侵肺巴斯德菌(Pasteurellapneumotropica)、彭氏变形杆菌(Proteus penneri)。     

3种拮抗烟草疫霉及产IAA内生细菌的分离鉴定

为挖掘河南省洛阳地区烟株体内的内生细菌功能菌株,以期开发优良生防菌剂。采用稀释涂布平板法分离纯化烟株各生育时期内生细菌菌株,采用平板对峙法、生长速率法测定内生菌株对烟草疫霉的抑制作用,紫外分光光度计法测定菌株产生IAA的水平。对筛选出的功能内生菌株进行形态学、生理生化鉴定及16S rDNA、gyrB序列分析鉴定,并测定对种子萌发的促生作用。结果表明,筛选出的12株内生菌株的鉴定结果为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)7株,沙福芽孢杆菌(B.safensis)4株,奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)1株。芽孢杆菌属占菌株总数的91.67%,其中菌株LYYY63-1、LYRY39-1、LYSX141具有较强的抑制活性,对烟草疫霉的抑菌率分别为88.10%、84.55%和73.33%;沙福芽孢杆菌菌株LYYY61-2、LYYY117对烟草疫霉的抑菌率达62.10%、64.72%;奇异变形杆菌菌株LYRY45产IAA水平达11.06 mg/L,具有较高的产IAA水平。12株细菌对烟草7种病原真菌具有不同程度的抑制作用,抑菌谱广,对烟草种子根长和总长均有显著的促生...     

中华鳖腐皮病的病原鉴定与药敏研究

对浙江某养殖场患腐皮病的中华鳖进行了病原菌分离,分离到2株细菌(编号为040908-1和040908-2)。经人工感染试验证明,这2株细菌都是该病的致病菌。分别采取传统细菌生理生化鉴定方法以及全自动细菌鉴定仪VITEK-32对这2株细菌进行了鉴定,结果均表明菌株040908-1为普通变形杆菌(Proteus vulgaris),而菌株040908-2为维罗纳气单胞菌温和生物变种(Aeromonas veronii biovar sobria)。研究了27种药物对这2株细菌的药敏试验,结果显示,妥布霉素、新霉素、奥复星、先锋必素、庆大霉素、卡那霉素等6种药物对这2株细菌均有良好的抑制作用,氟哌酸、吡哌酸、链霉素、四环素4种药物仅能有效抑制菌株040908-1的生长,而复方新诺明仅对菌株040908-2有显著的抑制作用。     

水产品中8株特殊生化型奇异变形杆菌的分离鉴定

[目的]探讨水产品中8株特殊生化型奇异变形杆菌的分离与鉴定。[方法]从8个批次的鱼粉和冻黄鳍金枪鱼样品中分离到8个菌株,通过表型观察、生化鉴定和16s rDNA及rpoB系统进化分析对其进行了鉴定,并对细菌鉴定的方法选择、减少变形杆菌检测鉴定偏差进行了探讨。[结果]从水产样品中分离的8个菌株经鉴定确认为奇异变形杆菌,且它们的生化特征与典型菌株均存在差异。其中,64285等6个菌株鉴定为KCN阴性的奇异变形杆菌,64284菌株鉴定为KCN阴性、木糖阴性的奇异变形杆菌,20932菌株鉴定为鸟氨酸脱羧酶阴性、KCN阴性的奇异变形杆菌,它与典型的奇异变形杆菌相差较大,是一种非常罕见的生化型。[结论]该研究为变形杆菌的准确鉴定以及预防因其引起的疾病提供科学依据。     

肉雏鸡腹泻病原的分离与鉴定

通过对发生腹泻肉雏鸡进行剖解和临床观察,采用VITEK-32全自动微生物鉴定系统对分离到的两株细菌进行生化鉴定和药物敏感性试验,确定两株分离株为奇异变形杆菌和阴沟肠杆菌。发病鸡使用庆大霉素、头孢噻肟后,治疗效果显著。     

腹泻仔猪肠道菌群的ERIC-PCR指纹图谱分析

【目的】分析腹泻仔猪周围环境菌群变化规律,为仔猪腹泻的诊断和治疗提供支持。【方法】采集健康对照和腹泻仔猪粪便、口腔以及产床和母猪乳头等样品,采用ERIC-PCR技术分析其菌群结构特征,并对粪便样品中的细菌进行分离和鉴定。【结果】对照组4类样品细菌ERIC-PCR指纹图谱十分相似,腹泻组各类样品之间电泳条带差异较大,出现了异常亮度的电泳条带,与对照组优势条带位置不同,其中口腔和母猪乳头部位电泳条带数显著低于对照组(P0.05),菌群多样性指数降低,优势度指数升高。从粪便样品中分离出2株可疑菌株b1和b2,细菌染色和生化试验初步证明分离株b1和b2分别符合大肠杆菌和奇异变形杆菌的特征;利用ERIC-PCR技术分析分离株b1和b2的指纹图谱,发现分离优势细菌的ERIC-PCR指纹图谱包含于粪便样品的ERIC-PCR图谱中,证明样品的ERIC-PCR指纹图谱能够反映出优势菌群的特征;测序结果显示,分离株b1与大肠杆菌基因组同源性为99%,分离株b2与奇异变形杆菌基因组同源性为98%。【结论】腹泻仔猪周围环境菌群发生明显变化,ERIC-PCR技术可以快速、准确地监测和诊断菌群结构的变化,有助于细菌性仔猪腹泻的诊断和治疗。     

10株镰刀菌rDNA内转录间隔区(ITS)序列分析

[目的]探索镰刀菌菌株间的系统发育关系。[方法]采用氯化苄法从分离的10株镰刀菌菌株中提取基因组DNA,对其内转录间隔区(ITS)序列进行PCR扩增和序列测定。采用Blast方法将测序结果在GenBank中进行同源搜索,采用邻接法构建其与相关菌株的ITS序列系统发育树。[结果]供试菌株分别位于系统发育树的3个分支上,7株与腐皮镰刀菌为一个分支,序列相似性为98.61%~100%。菌株F94与尖孢镰刀菌为另一个分支,序列相似性为100%。菌株F83和F97与Fusarium incarnatum为另一个分支。各分枝内序列相似性均较高,为97.61%~100%,而不同分枝间菌株序列相似性较低。[结论]ITS序列系统发育分析可为镰刀菌属种的鉴定提供参考依据。     

鸡杆菌河南分离株的分子进化分析

【目的】确定鸡杆菌河南分离株的具体种属和进化地位。【方法】以9株鸡杆菌河南分离株为研究对象,根据GenBank上登录的相关序列,针对鸡杆菌3个管家基因rpoB、infB和atpD设计引物,并进行PCR扩增、克隆和序列测定分析;将9株鸡杆菌的3个管家基因部分核苷酸序列,与已知的鸡杆菌属和巴氏杆菌科其他属相关参考株的相应基因序列进行比较分析并构建进化树。【结果】扩增出rpoBi、nfB和atpD3个管家基因部分序列,长度分别为566,531和1 441 bp,将测序结果登陆到GenBank。鸡杆菌分离株间的同源性分别为98.3%~100%(rpoB)、90.5%~100%(infB)和98.3%~100%(atpD);分离株与国外鸭源鸡杆菌分离株间的同源性分别为97.1%~98.5%(rpoB)8、5.2%~93.2%(infB)和98.3%~98.8%(atpD);分离株与国外鸡杆菌属其他种的同源性分别为84.3%~86.8%(rpoB),83.1%~86.7%(infB);鸡杆菌分离株与巴氏杆菌科其他代表属的同源性分别为77.4%~79.3%(rpoB)、78.2%~79.7%(infB)和83.5%~84.1%(atpD)。遗传进化分析显示,9株鸡杆菌河南分离株与鸭源鸡杆菌处于同一大分支之中。【结论】9株鸡杆菌河南分离株均为鸭源鸡杆菌。     

拮抗杉木致害菌Fusarium oxysporum海洋细菌3728的生物学特征及其鉴定

从南海红树林木榄(Bruguiera gymnorrhizo)根际土壤中分离到一株具有拮抗杉木致害菌尖孢镰刀菌萎蔫专化型SF2(Fusariumoxysporum f.sp.vasinfectum)活性的海洋细菌3728菌株,对分离菌株的形态特征、培养特征、生理生化特征和16S rRNA基因序列进行了系统的研究。发现细菌3728与枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)序列相似性最高,达到100%,在系统进化树中与枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis AJ276351)处于同一分支上,结合形态和生理生化分析结果,将其鉴定为枯草芽孢杆菌。     

鸡大肠杆菌和奇异变形杆菌的分离、鉴定及药敏分析

采用全自动微生物鉴定系统(VITEK-32)鉴定了一例临床分离鸡致病菌,并进行了超广谱β-内酰胺酶(ES-BLs)的检测和用肉汤微量稀释法测定12种药物和4种复方药物对分离菌的抗菌活性。结果显示,分离的4株菌中鉴定为大肠埃希氏菌3株、奇异变形杆菌1株,在分离的4株菌中均产ESBLs。药敏试验结果表明4株菌对氨苄西林、头孢噻肟、头孢噻呋、头孢曲松除一株中介外其它均耐药,对阿米卡星均敏感,尤其1株奇异变形杆菌和1株大肠杆菌耐药严重,对12种药物中有10种耐药,显示出严重的多重耐药性。β-内酰胺类药物与酶抑制剂联用能使药物对细菌的最低抑菌浓度(M ICs)降低4~64倍,因此复方β-内酰胺类药物仍是防治鸡致病菌感染的有效措施之一。     

腹泻仔猪肠道菌群的ERIC-PCR指纹图谱分析

【目的】分析腹泻仔猪周围环境菌群变化规律，为仔猪腹泻的诊断和治疗提供支持。【方法】采集健康对照和腹泻仔猪粪便、口腔以及产床和母猪乳头等样品，采用ERIC-PCR技术分析其菌群结构特征，并对粪便样品中的细菌进行分离和鉴定。【结果】对照组4类样品细菌ERIC-PCR指纹图谱十分相似，腹泻组各类样品之间电泳条带差异较大，出现了异常亮度的电泳条带，与对照组优势条带位置不同，其中口腔和母猪乳头部位电泳条带数显著低于对照组（P＜0.05），菌群多样性指数降低，优势度指数升高。从粪便样品中分离出2株可疑菌株b1和b2，细菌染色和生化试验初步证明分离株b1和b2分别符合大肠杆菌和奇异变形杆菌的特征；利用ERIC-PCR技术分析分离株b1和b2的指纹图谱，发现分离优势细菌的ERIC-PCR指纹图谱包含于粪便样品的ERIC-PCR图谱中，证明样品的ERIC-PCR指纹图谱能够反映出优势菌群的特征；测序结果显示，分离株b1与大肠杆菌基因组同源性为99%，分离株b2与奇异变形杆菌基因组同源性为98%。【结论】腹泻仔猪周围环境菌群发生明显变化，ERIC-PCR技术可以快速、准确地监测和诊断菌群结构的变化，有助于细菌性仔猪腹泻的诊断和治疗。     

禽源奇异变形杆菌超广谱β-内酰胺酶基因的分子特征

【目的】研究禽源奇异变形杆菌携带超广谱β-内胺酰酶基因的亚型和blaCTX-M基因的上下游环境。【方法】对分离、鉴定的奇异变形杆菌进行药物敏感性试验、ESBLs产酶确证试验、耐药基因检测和接合试验;利用PCR定位技术（PCR mapping）分析blaCTX-M的基因环境。【结果】ESBLs确证试验表明,21株禽源奇异变形杆菌有10株是阳性表型。PCR扩增和测序结果表明,最常见的ESBL基因是blaCTX-M-14 (n=6) , blaOXA-1 (n=6), 其次是blaCTX-M-65 (n=4),同时也检测到了blaOXA-10 (n=1),没有检测到blaSHV。序列分析表明,禽源奇异变形杆菌携带blaCTX-M的上游普遍存在ISEcp1B,下游均为IS903D。【结论】首次在禽源奇异变形杆菌中检测到了blaCTX-M-65,CTX-M型超广谱β-内酰胺酶基因在禽源奇异变形杆菌中已不在少见。     

南四湖底泥耐铅菌株的分离鉴定及吸附特性

重金属污染土壤中的微生物对重金属有较强的耐受能力并能起到富集作用,是进行土壤净化的重要力量。分离鉴定南四湖底泥中的抗铅菌株,并且对其吸附特性进行研究。从南四湖底泥中采集土样,经过分离、培养,最终筛选出2株抗铅菌株。对所得菌株进行16S rDNA测序和序列相似性分析,鉴定其种属后对其Pb~(2+)质量吸附特性进行研究。结果:菌株1D、8A最大耐Pb~(2+)浓度分别为700 mg/L和600 mg/L。16S rDNA序列相似性分析表明,菌株1D、8A分别与蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)、彭氏变形杆菌(Proteus penneri)亲缘关系最近。经过吸附性能测试,菌株1D在35℃、pH值=5、Pb~(2+)质量浓度为100 mg/L、菌体投放量为30 g/L、转速为180 r/min、吸附时间为15 min时吸附效率最高;菌株8A在20℃、pH值=7、Pb~(2+)质量浓度为300 mg/L、菌体投放量为20 g/L、转速为180 r/min、吸附时间为5 min时吸附效率最高。此外,2株菌株对Zn~(2+)、Cu~(2+)、Co~(2+)和Fe~(2+)等重金属也有一定的耐受性。筛选到的菌株抗铅性能高、吸附性好,丰富了微生物修复的生物资源库,同时对于吸附特性的研究又可以为抗重金属菌株筛选提供参考。     

广西伪狂犬病毒流行株的分离鉴定及遗传变异分析

为了更好防控广西伪狂犬病,本研究采集广西北海发生疑似伪狂犬病疫情(AD)猪场的犬和猪样品进行病毒分离,通过动物接种试验、电镜观察及核酸检测,证实分离到2株PRV毒株。2毒株与GenBank上登录的参考毒株gE和gC基因核苷酸序列同源性为97.4%~100.0%和91.3%~99.8%;氨基酸序列同源性为95.1%~100.0%和86.6%~99.5%。基于gE基因和gC基因的进化分析显示,2株分离毒与国内不同时期的毒株在进化树上共同构成一个进化分支,与欧洲和美洲的毒株亲缘关系较远。对氨基酸序列的分析结果显示,2株分离毒的gE基因决定毒力的关键位点未发生突变。基于gE蛋白质与gC蛋白质的分析结果显示,虽然与国外毒株(Rice和Bartha)相比存在多个氨基酸位点的变异,但与国内的分离毒,尤其是2011年后的流行毒株,变异情况基本一致。     

20株土壤粘细菌系统发育研究

对从不同采集地土壤样本中分离的20株粘细菌菌株进行了系统发育分析及G+C mol%测定,以确定其系统发育地位。结果表明:供试菌株分属粘球菌属(Myxococcus)和珊瑚球菌属(Corallococcus)2个属的6个种,其中18株属于粘球菌属(Myxococcus),2株属于珊瑚球菌属(Corallococcus)。各供试菌株与已知相关菌株16SrDNA序列相似性在98.9%~100%之间。各供试菌株G+C mol%在63.12%~73.78%之间,除菌株93357的G+C mol%为63.12%,较其最近相关菌株黄色粘球菌(Myxococcus xanthus)DSM16526低5.26%外,其余同种内菌株的DNA的G+C mol%差异未超过5%,可作为粘细菌16S rDNA序列分析结果的验证性指征。     

犬瘟热病毒甘肃株的分离和N蛋白基因遗传进化分析

采用Vero细胞从甘肃2008-2009年疑似犬瘟热感染病犬体内分离到8株病毒,通过RT-PCR方法扩增M蛋白基因初步鉴定所获得毒株均为犬瘟热病毒(CDV)。进一步通过RT-PCR方法扩增分离株的N蛋白基因,并进行序列分析。结果表明,8株分离株均为CDV,它们之间N蛋白基因的核苷酸同源性和推定的氨基酸同源性分别为98.4%~99.7%、98.3%~99.6%;8株CDV分离株的N蛋白基因和TN、A75/17相应序列的核苷酸同源性分别为98.5%~99.5%、97.0%~98.0%,推定的氨基酸同源性分别为98.3%~99.2%、98.7%~99.8%;8株CDV分离株N蛋白基因和疫苗株(Onderstepoort和Snyder Hill)的相应序列的核苷酸同源性和推定的氨基酸同源性分别为93.0%~94.0%、96.8%~98.3%。根据N蛋白基因所建立的遗传系统发育树可知这8株CDV分离株与TN的亲缘关系较近,而与疫苗株处于不同的分支上。说明从甘肃分离的CDV野毒株和TN由同一毒株演化而来,与疫苗株亲缘关系较远。     

郑州市售畜禽肉中分离菌对β-内酰胺类的耐药及毒力特征

采用微量肉汤稀释等方法分离鉴定了郑州市市售83份猪肉样和56份鸡肉样中的细菌,并研究了这些细菌对β-内酰胺类药物的耐药性及所携带的毒力基因。分别从47.0%的猪肉样和66.1%的鸡肉样中检出大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌或奇异变形杆菌。这4种分离菌对氨苄西林、头孢噻呋、头孢噻肟和头孢他啶均呈现出一定的耐药性,其中奇异变形杆菌的耐药性最强。PCR检测及序列分析结果表明:大肠杆菌主要携带TEM和CTX-M基因。毒力基因的检测结果显示:5株产CTX-M大肠杆菌携带的毒力基因种类均在5种以上。     

郑州市售畜禽肉中分离菌对β-内酰胺类的耐药及毒力特征

采用微量肉汤稀释等方法分离鉴定了郑州市市售83份猪肉样和56份鸡肉样中的细菌,并研究了这些细菌对β-内酰胺类药物的耐药性及所携带的毒力基因。分别从47.0%的猪肉样和66.1%的鸡肉样中检出大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌或奇异变形杆菌。这4种分离菌对氨苄西林、头孢噻呋、头孢噻肟和头孢他啶均呈现出一定的耐药性,其中奇异变形杆菌的耐药性最强。PCR检测及序列分析结果表明:大肠杆菌主要携带TEM和CTX-M基因。毒力基因的检测结果显示:5株产CTX-M大肠杆菌携带的毒力基因种类均在5种以上。