桉树枝瘿姬小蜂雌成虫体内可培养细菌分离鉴定及多样性分析

[目的]明确桉树枝瘿姬小蜂(Leptocybe invasa Fisher&La Salle)体内可培养细菌多样性,为利用微生物防治该害虫打下基础.[方法]利用传统的细菌分离培养与鉴定方法,结合16S rDNA测序和系统发育分析,对刚羽化的桉树枝瘿姬小蜂雌成虫体内可培养细菌进行多样性分析.[结果]从桉树枝瘿姬小蜂体内分离出11株细菌,经鉴定归类于3个门(厚壁菌门、放线菌门和变形菌门)3个纲(芽孢杆菌纲、放线菌纲和γ-变形菌纲)4个目(芽孢杆菌目、微球菌目、乳酸杆菌目和肠杆菌目)8个科(芽孢杆菌科、微杆菌科、葡萄球菌科、乳酸杆菌科、纤维单胞菌科、微球菌科、肠杆菌科和类芽孢杆菌科)8个属(芽孢杆菌属、微杆菌属、葡萄球菌属、片球菌属、纤维单胞菌属、微球菌属、埃希氏杆菌属和类芽孢杆菌属),其中,厚壁菌门(Firmicutes)6株,为优势类群;芽孢杆菌属(Bacillus)3株,为优势菌属.[结论]桉树枝瘿姬小蜂体内可培养细菌具有丰富的多样性.     

青藏高原矮火绒草内生细菌多样性及生物功能分析

[目的]探究矮火绒草(Leontopodium nanum)内生细菌的群落结构多样性及其生物学功能,为开发相应功能的生物菌剂提供参考,并为青藏高原生态农牧业生产提供有价值的内生细菌资源.[方法]采用组织分离法对矮火绒草植株内生细菌进行分离纯化,基于16S rDNA序列分析确定分离菌株的系统发育地位;通过平板对峙法检测分离菌株拮抗病原真菌活性;检测分离菌株的产吲哚乙酸(IAA)、溶磷和固氮能力;测定分离菌株除草活性、低温适生性及促种子萌发特性.[结果]从矮火绒草植株根、茎、叶和种子部位共分离获得52株内生细菌,基于16S rDNA序列分析发现52株菌株可归属于4门7纲10目14科18属.其中假单胞菌属细菌为根部优势属,约占根部细菌总数的52.17%;茎中以芽孢杆菌为优势属,约占茎部细菌总数的41.18%;各部位的内生细菌数量分布表现为根>茎>种子>叶.在52株内生细菌中,11株有拮抗病原真菌能力、9株具有产IAA能力、7株有溶磷活性、7株具有固氮活性、20株具有除草活性、13株具有耐低温能力和8株具有促生作用;从植株部位分布来看,7种类型的功能菌在根、茎和种子部位均有分布,拮抗菌和除草菌在根部所占的比例较高,溶磷菌株在各植株部位所占比例均较低;在叶中未分离到拮抗菌、产IAA菌、固氮菌和促生菌.各功能菌株分布在17个属,多样性较高,其中假单胞菌属和芽孢杆菌属中含有多种功能菌株,在植株4个部位所占比例也较高.[结论]矮火绒草植株不同部位内生细菌的数量分布具有差异性,但均可分离到不同类型的功能菌株,功能菌株涵盖17个属,其中以假单胞菌属和芽孢杆菌属居多.     

一株产梓醇的地黄内生细菌的鉴定

从地黄根内分离到一株能产生地黄主要药效成分梓醇的内生细菌,命名为tjD7。利用形态学方法、生理生化试验和16S rDNA序列分析法对该菌进行了鉴定。结果表明,该菌为厚壁菌门,芽孢杆菌纲,芽孢杆菌目,芽孢杆菌科,芽孢杆菌属,枯草芽孢杆菌。     

虾夷扇贝苗种培育水中可培养细菌群落分析

为研究虾夷扇贝Patinopecten yessoensisis苗种培育过程中幼体发育5个时期苗种培育水中(受精卵期水样W1,担轮幼虫期水样W2,D型幼虫期水样W3,壳顶幼虫期水样W4,稚贝期水样W5)可培养细菌的群落组成,采用传统培养方法,从每个水样分离细菌30株,通过16S rRNA基因测序分析鉴定细菌。结果表明:分离的150株细菌可归为2门、3纲、6目、9科、10属、22种;在门水平,W1~W5的优势门均为变形菌门,其次为厚壁菌门;在属水平,假交替单胞菌属为所有水样第一优势属,此外,W1的优势属依次为交替单胞菌属、弧菌属和海杆菌属,W2的优势属依次为弧菌属、交替单胞菌属和Cobetia,W3的优势属依次为弧菌属、交替单胞菌属和芽孢杆菌属,W4的优势属依次为交替单胞菌属、芽孢杆菌属和弧菌属,W5的优势属依次为弧菌属、Pseudophaeobacter、芽孢杆菌属和赤杆菌属。研究表明,扇贝幼体不同发育时期苗种培育水中所含可培养细菌种类比较丰富,细菌群落结构存在差异。     

药用植物细叶石仙桃内生细菌的分离和分子鉴定

以采自雁荡山、白岩山和划岩山3个样地的细叶石仙桃为材料,在分离和培养内生细菌的基础上,利用分子生物学手段对其进行鉴定。研究结果表明,共分离到13种内生细菌,它们来自果胶杆菌属、克雷伯氏菌属、泛菌属、科泽氏菌属、藤黄色杆菌属、肠杆菌属、假单胞菌属、类芽孢杆菌属和芽孢杆菌属等9个属;栖稻假单胞菌和胶质类芽孢杆菌为雁荡山细叶石仙桃特有,韦氏芽孢杆菌为划岩山细叶石仙桃特有。     

鳗鲡病原菌16SrRNA基因序列测定及系统进化分析

对从福建省不同鳗鲡养殖场发病鳗鲡肝脏中分离并经感染证实的35株致病菌的16S rRNA基因进行序列测定和系统进化分析。用CTAB法提取各菌株DNA,以细菌16S rDNA通用引物进行PCR扩增,用限制性片段长度多态性分析1、6S rDNA序列分析和系统进化分析对其进行分子鉴定,构建系统进化树。结果表明:35株致病菌分别属于γ-变形菌纲和厚壁菌门2大类群的6个属和1个科,主要种类是气单胞菌属的嗜水气单胞菌、维氏气单胞菌、简氏气单胞菌和豚鼠气单胞菌等,占63%;其次是芽孢杆菌属细菌;少量为鲁氏耶尔森菌、弗氏柠檬酸杆菌、克雷伯氏菌属、假交替单胞菌属细菌和肠杆菌科细菌。     

芒草根际、内生可培养细菌多样性及促生潜力研究

为研究芒草不同部位细菌群落组成,采用稀释梯度平板法分离芒草根际土壤、根部、茎部和叶部可培养细菌,并分析其植物促生活性。16S rRNA基因序列分析表明,分离的86株芒草根际、内生细菌由放线菌门(Actinobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、厚壁菌门(Firmicutes)和变形菌门(Proteobacteria)4个门、7个纲、22个属组成,不同部位细菌组成有所差异,其中短小杆菌属(Curtobacterium)在根际土壤和植物内部广泛存在,芽孢杆菌属(Bacillus)和根瘤菌属(Rhizobium)为根际土壤优势种群,伯克霍尔德菌属(Burkholderia)为根部优势种群,鞘脂单胞菌属(Sphingomonas)为茎部优势种群。分离菌株的植物促生特性分析表明,芒草根际和植物组织内部蕴含着丰富的产吲哚乙酸、产精氨酸脱羧酶和溶解难溶性磷酸盐等生物活性细菌,广泛分布于短小杆菌属、根瘤菌属、芽孢杆菌属、伯克霍尔德菌属、鞘脂单胞菌属等优势种群,且不同部位菌株促生特性和种类有所差别。     

茄类内生菌的分离及拮抗细菌的筛选

[目的]分离番茄、辣椒和茄子3种茄科果蔬的内生菌,并对青枯病拮抗细菌进行筛选与鉴定。[方法]采用研磨液培养法,利用选择培养基对3种植株进行内生菌分离,并采用平板划线法纯化,及菌块对峙培养法对已纯化的内生菌进行筛选。根据分离菌的培养特性及菌体形态特征、革兰氏染色及生化反应等,对筛选出来的内生拮抗细菌进行鉴定归属。[结果]3种植株内生菌分离,共得到53株内生细菌、53株内生真菌、44株内生放线菌。筛选出14株青枯病菌有强拮抗性的内生细菌,分属为芽孢杆菌属、埃希氏菌属、克雷伯氏菌属、土壤单胞菌属、欧文氏菌属、短小杆菌属,其中芽孢杆菌为优势种群,而且芽孢杆菌属菌株对青枯病菌的拮抗作用最强。[结论]提供了探索生物防治茄科植物青枯病的有效途径。     

斜带石斑鱼稚鱼和早期幼鱼消化道可培养菌群研究

利用常规微生物分离鉴定方法结合16S rRNA基因序列分析研究斜带石斑鱼Epinephelus coioides 40d稚鱼和70d早期幼鱼消化道可培养菌群.结果表明,副溶血弧菌Vibrio parahaemolyticus、哈维弧菌Vibrio harveyi、短小芽孢杆菌Bacillus pumilus、鲍氏不动杆菌Acinetobacter baumannii、恶臭假单胞菌Pseudomonas putida、嗜冷杆菌Psychrobact-er sp.和洋葱伯克霍尔德菌Burkholderia cepacia均从稚鱼和早期幼鱼消化道分离.系统进化分析结果表明,斜带石斑鱼消化道细菌可归为3类:γ-变形杆菌纲γ-Proteobacteria、β-变形杆菌纲β-Proteobacteria和芽孢杆菌纲Bacil-li.稚鱼和早期幼鱼消化道的优势菌相似,稚鱼消化道的优势菌为芽孢杆菌Bacillus、嗜冷杆菌Psychrobacter、葡萄球菌Staphylococcus和不动杆菌Acinetobacter,而早期幼鱼消化道的优势菌为芽孢杆菌、不动杆菌、嗜冷杆菌和假单胞菌Pseudomonas.芽孢杆菌为稚鱼与早期幼鱼消化道的最优势菌,分别占可培养细菌总数的78.6%和75.6%,而弧菌在稚鱼和早期幼鱼消化道中的数量均较低,分别仅占消化道可培养细菌总数的2.8%和1.1%.乳酸乳球菌Lactococcus lactis、干酪乳杆菌Lactobacillus casei和屎肠球菌Enterococcus faecium等3种乳酸菌仅见于早期幼鱼消化道.     

斜带石斑鱼幼鱼消化道与养殖水体中可培养菌群的研究

利用海水琼脂、TCBS和MRS培养基对斜带石斑鱼Epinephelus coioides幼鱼消化道和养殖水体中的细菌进行分离纯化,采用生理生化鉴定结合16SrRNA基因测序进行细菌鉴定,探讨了幼鱼消化道中的菌群与养殖水体中菌群的关系。结果表明：幼鱼消化道中可培养细菌总数（9．0×106cfu／g）高于养殖水体中可培养细菌总数（5．4×105cfu／mL）,幼鱼消化道中细菌种类也明显多于养殖水体;在幼鱼消化道和养殖水体中均检测到副溶血弧菌、哈维氏弧菌、短小芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、鲍氏不动杆菌、嗜冷杆菌和洋葱伯克霍尔德菌等7种细菌。细菌系统进化分析结果表明,这些细菌隶属于β-变形杆菌纲、γ-变形杆菌纲和芽孢杆菌纲。幼鱼消化道和养殖水体的优势菌中均有芽孢杆菌和嗜冷杆菌,提示芽孢杆菌和嗜冷杆菌能通过养殖水体很好地进入消化道。3种乳酸菌（乳酸乳球菌、干酪乳杆菌和屎肠球菌）仅见于幼鱼消化道,且仅占消化道菌群数量的0．70％。弧菌在消化道和养殖水体中所占比例均很小,分别仅占细菌总数的1．07％和0．10％。     

乌鲁木齐10号冷泉水中可培养细菌群落结构组成

[目的]了解乌鲁木齐10号冷泉水中可培养细菌群落结构组成,以及嗜盐微生物的分离鉴定.[方法]梯度稀释乌鲁木齐10号冷泉水,采用TSA、2A、0.1 ×LB、HM等4种培养基进行分离纯化.其中采用0.1;、0.5;、1;、2;、5;和10; NaCl的HM培养基分离嗜盐微生物.CTAB法提取所得菌株DNA,用细菌通用引物27F/1492R扩增16SrRNA基因,构建系统发育树.[结果]分离得到33株不同基因型细菌,16SrRNA测序、BLAST比对及系统发育分析将其归为假单胞菌属、金黄杆菌属、红杆菌属、芽孢杆菌属等,其中假单胞菌属占优势.R2A培养基分离效果较好,HM培养基在NaCl 5;～20;区间分离到的菌株数较多.[结论]乌鲁木齐10号冷泉水可培养细菌多样性较低,而中度嗜盐菌数量较丰富.     

BIOLOG碳源筛选与分离技术结合研究新疆哈密南湖嗜盐菌多样性

[目的]获得新疆哈密南湖的嗜盐菌,并分析其生物多样性,以期为分离培养基碳源设计引入一种快速可行的方法.[方法]利用BIOLOG筛选碳源并结合可培养方法分离哈密南湖中的嗜盐菌,通过16S rRNA基因序列系统发育分析法初步确定所分离菌株的分类地位,获得嗜盐菌的多样性信息.[结果]BIOLOG方法筛选出5种碳源,分别为海藻糖、蔗糖、柠檬酸、甘油和甘露醇.通过将筛选碳源添加至分离培养基的方法,共分离得到细菌和放线菌27株,分属于细菌域中3个门7个科14个属.多数菌株归属于厚壁菌门(Firmicutes),最优势菌株属于薄壁芽孢杆菌属(Gracilibacillus).其中6株菌株的16S rRNA基因序列与最近缘种的同源性在94.24;～96.86;,可能为潜在的新种或新属.[结论]新疆哈密南湖嗜盐细菌和放线菌都具有较为丰富的生物多样性,其嗜盐菌主要以薄壁芽孢杆菌和盐单胞菌为主,并且该地区可能含有丰富的嗜盐菌新物种,具有进一步开发研究价值.     

三种江蓠共附生细菌多样性及抑菌活性分析

【目的】研究广西北部湾涠洲岛海域3种江蓠可培养共附生细菌多样性及其代谢产物的抑菌活性,为该海域海藻共附生细菌的开发利用及新型生物杀菌剂的研发提供参考依据。【方法】经稀释涂布法后观察分析3种江蓠共附生细菌的菌落形态及其分布,基于16S rRNA序列对江蓠共附生细菌的物种多样性进行分析,并利用纸片扩散法对其抑菌活性进行初步筛选。【结果】从广西北部湾涠洲岛海域的江蓠、扁江蓠和集团江蓠中共分离获得28株可培养的共附生菌株,隶属于4门13科15属(芽孢杆菌属、葡萄球菌属、弧菌属、冷杆菌属、交替单胞菌属、假交替单胞菌属、赤杆菌属、副球菌属、考克氏菌属、微球菌属、红小梨形菌属、Kytococcus sp.、Dermacoccus sp.、Maribacter sp.和Cobetia sp.)。有5株共附生菌株的代谢产物对番木瓜炭疽病原菌或荔枝炭疽病原病菌表现出较好的拮抗作用,其中,菌株GXS0044、GXS0017和GXS0035的代谢产物对荔枝炭疽病菌有较好的抑制作用(抑菌圈直径分别为15.0、14.5和15.5 mm),菌株GXS0023和GXS0031的代谢产物则对番木瓜炭疽病菌有较好的抑制作用(抑菌圈直径分别为15.0和17.0 mm)。【结论】广西北部湾海域的江蓠共附生细菌较丰富,其代谢产物活性各不相同,因此从海藻中寻找具有抗农业病原菌的微生物将成为研究抗农业病原菌杀菌剂的新方向。     

26味清热解毒药对奶牛乳腺炎病原菌体外抗菌活性的比较分析

采用琼脂平板二倍稀释法测定蒲公英、白头翁、金银花、连翘、漏芦、野菊花、鱼腥草等26味清热解毒药对15个不同种属120株奶牛乳腺炎病原菌的最低抑菌质量浓度,统计分析抑菌活性相对较强的金银花、连翘、贯众、紫花地丁、野菊花等12味药物对金葡菌、凝固酶阴性葡萄球菌、链球菌、巨型球菌、吉氏库特氏菌、芽孢杆菌、大肠埃希菌、阴沟肠杆菌、鲁氏不动杆菌、产吲哚金黄杆菌、单胞菌属共11个种属的MIC50和MIC90,并采用单因素方差分析法比较分析清热解毒类药物对同种属菌株抑菌活性的强弱.结果表明,土茯苓、败酱草、半边莲、鸦胆子、重楼、毛慈姑、白花蛇舌草、北豆根、鱼腥草、大青叶、白蔹、板蓝根、马齿苋、射干共14味中药的体外抑菌活性较差;而金银花、连翘、贯众、紫花地丁、野菊花、金荞麦、蒲公英、红藤、白头翁、漏芦、拳参、青黛12味药物的体外抑菌活性相对较强.26味清热解毒药对不同种属细菌的抑菌活性不同,总体上,对革兰氏阳性菌的抑菌活性强于革兰氏阴性菌,革兰氏阴性菌中以对大肠埃希菌和阴沟肠杆菌的抑菌活性最差,其次为单胞菌属;对阳性菌、芽孢杆菌和阴性菌中的鲁氏不动杆菌、产吲哚金黄杆菌、变形杆菌和弗氏志贺氏菌的体外抑菌活性以拳参和青黛最强;其次为连翘和红藤;再次为金银花、紫花地丁、野菊花、蒲公英和漏芦;最差为金荞麦.     

菜豆花内生假单胞杆菌的分离与鉴定

[目的]分离并鉴定菜豆花中的1株内生优势细菌(WBF1)。[方法]从菜豆花中分离出1株内生优势细菌WBF1,通过革兰氏染色、16S r DNA及生理生化实验对其进行鉴定。[结果]革兰氏染色结果显示该菌为革兰氏阴性杆菌,16S r DNA序列分析显示其为变形杆菌科不动杆菌属假单胞杆菌;其生理生化特征符合假单胞杆菌特性;该菌定植于菜豆花中,生长温度为20~43℃。[结论]该菌是菜豆基因工程生防菌宿主菌的良好候选菌株。     

北极海洋沉积物可培养细菌多样性及抗植物病原真菌活性菌株筛选

根据菌落形态特征,从中国第4次北极科考采取的海洋沉积物BN05中分离到19株细菌,对其进行分子鉴定与系统发育分析,并利用平板扩散法从中筛选出对植物病原真菌尖刀镰孢菌(Fusarium oxysporum)具有明显抑制作用的活性菌株。分子鉴定与系统发育分析表明,从北极海洋沉积物中分离到的细菌主要为γ-变形杆菌纲(γ-Proteobacteria),分别属于假交替单胞菌属(Pseudoalteromonas)、假单胞菌属(Pseudomonas)、嗜冷杆菌属(Psychrobacter);1株属于放线菌门(Actinobacteria)的节杆菌属(Arthrobacter)。假交替单胞菌属是北极海洋沉积物BN05中可培养细菌中的优势菌群。活性菌株筛选结果表明,5株菌株对尖刀镰孢菌具有明显的抑制作用,其中菌株BN05-S-2和BN05-B-6属于假单胞菌属,菌株BN05-M-2、BN05-M-7和BN05-B-2属于假交替单胞菌属。     

洗涤厂排污口可培养中度嗜热菌的多样性

为考查洗涤厂热废水排放口土壤在常年人为热环境下的可培养嗜热菌的多样性,采集洗涤厂热废水排放口附近的湿热泥土,应用不同培养基分离纯化泥土中的可培养嗜热菌,并对获得的纯培养细菌进行16S rDNA鉴定和系统发育相关分析。结果表明：分离纯化得到的29株不同表型的纯培养菌株均属于坚壁菌门芽孢杆菌纲,归属于5个属11个种,分别是地芽孢杆菌属 Geobacillus 3个种,芽孢杆菌属 Bacillus 3个种,无氧芽孢杆菌属 Anoxybacillus 3个种,解脲芽孢杆菌属Ureibacillus 1个种和高温放线菌属 Thermoactinomyces 1个种,属种多样性丰富,菌株资源具有潜在开发应用价值。     

柿树内生细菌的分离与鉴定

[目的]了解柿树内生细菌的多样性及分布规律.[方法]采用平板分离法对柿树内生细菌进行首次分离、筛选和鉴定.[结果]从柿树根、幼茎和叶中共分离出内生细菌11株,不同组织中内生细菌的数量存在差异;经菌落形态特征和显微形态观察鉴定分属于4个属,即短小杆菌属（Curtobacterium）1株、芽孢杆菌属（Bacillus）7株、乳杆菌属（ctobacillus）1株、假单胞菌属（Pseudomonas）2株.[结论]柿树内生细菌具有生物多样性.     

大尖囊蝴蝶兰内生真菌和细菌的分离与鉴定

以大尖囊蝴蝶兰(Phalaenopsis deliciosa)为材料,采用常规无菌培养技术从其根部分离内生真菌和细菌并进行分子鉴定,旨在了解大尖囊蝴蝶兰内生真菌和细菌的特点及多样性。实验结果获得代表性内生真菌菌株38株,鉴定归为5个OTUs,隶属于1门2纲4目4科5属,优势属为球二孢属(Lasiodiplodia)和曲霉属(Aspergillus);获得代表性内生细菌菌株54株,鉴定归为17个OTUs,隶属于3门5纲6目9科12属,优势属为芽孢杆菌属(Bacillus)和肠杆菌属(Enterobacter)。研究结果可为建立大尖囊蝴蝶兰的共生萌发和菌根化育苗提供基础数据,也为内生微生物与兰科植物的关系研究提供基础资料。     

马尾松毛虫肠道细菌的分离鉴定与产蛋白酶细菌的筛选

为分离鉴定马尾松毛虫幼虫肠道细菌,从中挖掘产蛋白酶的肠道细菌资源。以马尾松毛虫(Dendrolimus punctatus)幼虫为材料,通过常规细菌培养方法体外获得部分肠道细菌,利用16S rDNA鉴定细菌种类,采用酪蛋白选择培养基筛选具有产蛋白酶能力的菌株,依据GB/T 23527—2009《蛋白酶制剂》的检测方法,测定蛋白酶活性。结果表明:从马尾松毛虫肠道分离出18个不同种类的非厌氧细菌,隶属于厚壁菌门(Firmicutes)的芽孢杆菌属(Bacillus),变形菌门(Proteobacteria)的亚硫酸杆菌属(Sulfurobacillus)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、嗜冷杆菌属(Psychrobacter)、泛菌属(Pantoea)、假单胞菌属(Pseudomonas)、不动杆菌属(Acinetobacter)和柠檬酸杆菌属(Citrobacter)。经酪蛋白选择培养基筛选后共获得6株产蛋白酶细菌,均为芽孢杆菌。酶活性测定结果显示:这些产蛋白酶细菌均具有较高的产蛋白酶能力,尤其是菌株MW-39地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis),酶活性最高可达255.36 U·mL^-1;其次为MW-50解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)和MW-4枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis),酶活性最高可分别达193.85 U·mL^-1和165.81 U·mL^-1。分析3个蛋白酶活性最高菌种的蛋白酶酶学特性,发现它们均具有一定的热稳定性和酸碱耐受性。单因素方差分析结果显示,在pH 5.0~9.0和30~50 ℃各菌株产生的蛋白酶活性相对较高,MW-39、MW-4和MW-50的蛋白酶最适pH分别为8.0、7.5、8.0,最适温度分别为45、40、40 ℃。本研究揭示了马尾松毛虫幼虫肠道多个细菌种类,丰富了产蛋白酶细菌资源,为进一步开发利用昆虫肠道产蛋白酶细菌资源提供了参考。