罗氏沼虾TRY基因生物信息学及其mRNA表达分析

【目的】分析罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)胰蛋白酶(TRY)基因的生物信息学及其mRNA的表达情况,为深入探究TRY基因的生物学功能和提高罗氏沼虾产量提供参考依据。【方法】利用MegAlign、ProtParam、ProtScale和MLRC等在线软件对罗氏沼虾TRY基因进行生物信息学分析,采用实时荧光定量PCR检测其在罗氏沼虾腹部神经、胃、心脏、鳃、性腺、肝胰腺、肌肉和肠道等8个组织中的表达情况,进一步分析TRY基因在罗氏沼虾生长快速家系(FG)和生长慢速家系(SG)个体肌肉组织中的表达规律。【结果】罗氏沼虾TRY氨基酸序列与刀额新对虾(Metapenaeus ensis)TRY氨基酸序列的同源性最高,与凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)TRY氨基酸序列的同源性最低。罗氏沼虾TRY蛋白的分子量为28.54 kD,理论等电点为4.44,属于疏水性蛋白。罗氏沼虾TRY蛋白二级结构中α-螺旋占17.67%,延伸链占21.05%,无规则卷曲占61.28%。罗氏沼虾TRY基因在所检组织中均有表达,在雌性和雄性个体的肝胰腺组织中均高表达,而在雌性个体的鳃和雄性个体的肌肉组织中低表达。此外,罗氏沼虾TRY基因在FG个体肌肉组织中的表达量极显著高于在SG个体肌肉组织中的表达量(P0.01)。【结论】罗氏沼虾与刀额新对虾的亲缘关系最近;TRY基因在罗氏沼虾各组织中均广泛表达,以在雌、雄罗氏沼虾肝胰腺组织中表达量最高,且存在性别差异性。TRY基因在罗氏沼虾生长发育过程中发挥了重要作用,可能正向调控罗氏沼虾的生长发育。     

盐度对不同蜕皮时期罗氏沼虾生理生化及蜕皮相关基因表达的影响

【目的】分析盐度对不同蜕皮时期罗氏沼虾蜕皮生理生化指标、能量代谢酶活性及蜕皮相关基因表达的影响,为实际生产中罗氏沼虾培育提供理论参考。【方法】以300尾平均初始湿体质量4.28±0.53 g/尾的健康罗氏沼虾为对象,试验设0.2‰（对照）、 3.0‰、 6.0‰、 9.0‰、 12.0‰等5个盐度梯度,记录不同盐度条件下罗氏沼虾的蜕皮周期、每日蜕皮率和蜕皮增重率。按照不同蜕皮时期取肝胰腺、肌肉和鳃丝,使用生化试剂盒测定丙酮酸激酶 （PK）和琥珀酸脱氢酶（SDH）活力,并用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测蜕皮抑制激素（MIH）、维甲酸X受体（RXR）、蜕皮激素受体（EcR）、保幼激素酯酶环氧水解酶（JHEH）基因的表达情况。【结果】罗氏沼虾的蜕皮周期随盐度的升高而不断延长,其中6.0‰盐度组蜕皮周期最长,显著高于0.2‰盐度组 （P<0.05）;蜕皮增重率随盐度的升高总体呈下降趋势,在盐度6.0‰、 9.0‰和12.0‰组中的蜕皮增重率显著低于0.2‰盐度组。在5个盐度条件下,肝胰腺、鳃丝的PK和SDH的活力均在蜕皮后期B有最大值,随着蜕皮后时间的延长,到蜕皮前期D时,其活力呈现下降的趋势,表明肝胰腺、鳃丝组织在蜕皮后期时能量代谢酶活力达到最高水平。在4个蜕皮阶段下,随着盐度的升高,肝胰腺和鳃丝的PK和SDH活力总体呈先上升后下降的趋势。低盐度的刺激导致罗氏沼虾肌肉的PK和SDH活力升高,而在12.0‰盐度组活力下降。MIH基因在各盐度组的相对表达量均随蜕壳时间的延长而明显下降,在0.2‰和3.0‰盐度组蜕皮后期A与蜕皮后期B的相对表达量显著高于蜕皮间期C。RXR基因在蜕皮间期C的相对表达量最高,其他蜕皮时期均极显著低于0.2‰盐度组（P<0.001）。与蜕皮间期C相比,各盐度组JHEH基因均在蜕皮前期D的相对表达量最高,而在3.0‰、6.0‰和12.0‰盐度组时,鳃丝EcR基因的相对表达量在蜕皮前期D极显著高于蜕皮间期C （P<0.001）。【结论】低盐度对罗氏沼虾的生长蜕皮有较大影响,不仅导致蜕皮增重率下降,蜕皮周期变长,对生产实践产生负面影响,还可使罗氏沼虾肌肉和肝胰腺的PK和SDH活力升高,从而促使肝胰腺和肌肉中的糖酵解速率加快,三羧酸循环作用加强,但在高盐度 （12.0‰）条件下受到抑制。盐度胁迫下, MIH基因上调表达、 EcR基因下调表达会引发蜕皮前期D时间延迟,蜕皮困难,致使JHEH和RXR基因表达下调,是导致罗氏沼虾生长缓慢的主要原因。罗氏沼虾养殖适宜的水体盐度为0.2‰~3.0‰。     

副溶血弧菌对罗氏沼虾肝胰腺和鳃组织中呼吸相关酶活性及抗氧化酶基因表达的影响

【目的】探讨副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）对罗氏沼虾（Macrobrachium rosenbergii）肝胰腺和鳃组织中呼吸相关酶活性和抗氧化酶基因的影响,以期为罗氏沼虾免疫机理研究和病害防治提供参考依据。【方法】选取规格整齐、健康的罗氏沼虾,分别注射PBS溶液（对照组）和副溶血弧菌（试验组）,在第1、3、6、12、24、48、72和96h统计累计存活率,并取肝胰腺和鳃组织进行呼吸相关酶活性及抗氧化酶相关基因表达测定。【结果】罗氏沼虾感染副溶血弧菌后,随着时间的推移,其累计存活率逐渐下降,在96h累计存活率为72%。感染副溶血弧菌后,其肝胰腺中的ATP合酶、细胞色素C氧化酶和NADH脱氢酶活性随时间延长均呈先降低后上升最后趋于对照组水平的变化趋势,且在6~24h 3种酶活性均显著低于对照组（P<00.05,下同）,之后酶活性逐步上升;活性氧（ROS）含量则呈先上升后下降的变化趋势,且在6~48h显著高于对照组;超氧化物歧化酶（SOD）基因、过氧化氢酶（CAT）基因及谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）基因相对表达量呈先升高后降低再升高的变化趋势。在鳃组织中,ATP合酶、细胞色素C氧化酶和NADH脱氢酶的活性随着感染时间的延长呈先降低后上升至趋于对照组水平,在6~72h 3种酶活性不同时间段表现出显著下降趋势;ROS含量则呈先上升后下降的变化趋势;SOD、CAT和GPX基因相对表达量呈先升高后降低再升高的变化趋势,且均在感染6h显著上调至最大值,其中GPX基因相对表达量在12~48h显著下调低于对照组,并在72h逐渐上调。【结论】副溶血弧菌感染罗氏沼虾后对肝胰腺和鳃组织中的呼吸相关酶及抗氧化酶基因产生显著影响,ROS水平呈上升趋势。虽然罗氏沼虾能通过自我调节呼吸相关酶和抗氧化酶基因促使机体抵御病原体入侵,但超过机体自我调节的限度时会对机体造成损伤。     

罗氏沼虾淀粉酶基因克隆及其表达规律分析

【目的】克隆罗氏沼虾（Macrobrachium rosenbergii）淀粉酶基因（AMY）,并进行生物学信息分析及其表达规律研究,为揭示AMY基因的生物学功能及其对罗氏沼虾生长发育的调控作用机理提供理论依据。【方法】PCR克隆罗氏沼虾AMY基因编码区（CDS）序列,利用ExPASy ProtParam、ExPASy ProtScale、SignalP-5.0、MegAlign及Lasergenev8.0等在线软件进行生物信息学分析,应用实时荧光定量PCR检测AMY基因在罗氏沼虾不同组织（腹神经节、胃、心脏、鳃组织、性腺、肝胰腺、肌肉和肠道）中的表达情况,并明确其在生长快速家系（FG）和生长慢速家系（SG）个体肌肉中的表达模式。【结果】罗氏沼虾AMY基因CDS序列全长2121 bp,共编码706个氨基酸残基;其编码蛋白分子量为76.87 kD,理论等电点（pI）为4.63,属于不稳定的亲水性蛋白,包含2个典型的淀粉酶结构域;在罗氏沼虾AMY蛋白二级结构中,α-螺旋占13.88%,延伸链占21.39%,无规则卷曲占64.73%。罗氏沼虾AMY氨基酸序列与克氏原螯虾AMY氨基酸序列的相似性最高（62.6%）,与大珠母贝AMY氨基酸序列的相似性较低（48.9%）;基于AMY氨基酸序列相似性构建的系统发育进化树显示,罗氏沼虾与克氏原螯虾的亲缘关系最近,而与中华绒螯蟹的亲缘关系较远。AMY基因在罗氏沼虾不同组织中广泛表达,但存在性别差异性和组织特异性,具体表现为:雌性个体肠道中的相对表达量极显著高于雄性个体（P<0.01,下同）,鳃组织中的相对表达量显著高于雄性个体（P<0.05）,而肝胰腺中的相对表达量极显著低于雄性个体。罗氏沼虾AMY基因在FG个体肌肉中的相对表达量极显著高于SG个体。【结论】AMY基因在罗氏沼虾的生长发育过程中发挥重要作用,广泛表达于罗氏沼虾的不同组织中,但存在性别差异性和组织特异性。     

罗氏沼虾同工酶表达组织差异性及遗传多样性分析

【目的】从生化遗传角度分析罗氏沼虾群体的同工酶基因座及其酶谱表型,明确不同群体的遗传多样性,为其种质资源鉴定及遗传育种研究等提供基础数据。【方法】采用聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）对罗氏沼虾肌肉、复眼、鳃、心脏和肝胰腺等5种组织中的苹果酸脱氢酶（MDH）、超氧化物歧化酶（SOD）、山梨醇脱氢酶（SDH）、苹果酸酶（ME）、磷酸葡萄糖变位酶（PGM）、乙醇脱氢酶（ADH）、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PDH）、乳酸脱氢酶（LDH）、谷氨酸脱氢酶（GDH）、天冬氨酸脱氢酶（AAT）和酯酶（EST）等11种同工酶进行电泳分析,并选取肌肉同工酶对申漕群体、野生群体、抗病群体、生长群体和浙江群体（2017年引进种虾）等5个罗氏沼虾群体进行遗传学研究。【结果】同种同工酶在罗氏沼虾不同组织间所表现出的酶谱总数和酶带颜色（酶活性）存在明显差异,即罗氏沼虾同工酶具有明显的组织差异性;11种同工酶在罗氏沼虾5种组织中存在26个基因座。其中,EST在肌肉中未表达,但在肝胰腺中表达较多;ME在肌肉、复眼、鳃、心脏和肝胰腺等5种组织中均有表达;SOD-2只在肝胰腺中表达;PGM在肝胰腺和心脏中表达较多。罗氏沼虾肌肉中的7种同工酶存在11个基因座,有3个基因座（SDH-1、PGM-3和LDH-1）呈多态性,多态位点比例为27.27%。5个罗氏沼虾群体的平均预期杂合度在0.1006~0.1416,平均观测杂合度在0.1143~0.1762,Hardy-Weinberg遗传偏离指数（0.1362~0.2444）均为正值,即偏离Hardy-Weinberg平衡。【结论】罗氏沼虾同工酶具有明显的组织差异性,表现为不同组织间的酶谱总数和酶带颜色（酶活性）存在明显差异,因此同工酶可作为研究罗氏沼虾遗传多样性的一种生化遗传标志。5个罗氏沼虾群体均处于杂合子过剩状态,其遗传变异水平较高。     

罗氏沼虾TLRs基因表达差异分析

[目的]探究罗氏沼虾Toll样受体(TLRs)基因(MrToll1、MrToll2和MrToll3)在不同组织中及感染溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)后不同时间鳃组织的表达量差异变化,为揭示罗氏沼虾TLRs在应对病害等免疫方面的表现和作用机理提供参考依据.[方法]利用实时荧光定量RT-PCR分别检测MrToll1、MrToll2和MrToll3基因在罗氏沼虾肌肉、鳃、肝胰腺、心脏、胃、肠、血淋巴、神经节、眼柄等不同组织中的相对表达量,并以同样方法检测罗氏沼虾感染溶藻弧菌后TLRs基因的相对表达量变化情况.[结果]罗氏沼虾MrToll1、MrToll2和MrToll3基因在各组织中广泛表达,但存在组织表达差异性.MrToll1和MrToll2基因在鳃组织中的相对表达量最高,分别是在肝胰腺中相对表达量的19.26和20.03倍;MrToll3基因在神经节中的相对表达量最高,是在肝胰腺中的10.13倍.感染溶藻弧菌悬液后,罗氏沼虾死亡率随时间的推移不断升高,至注射感染72 h时死亡率达峰值(64%),随后不再出现死亡.感染溶藻弧菌后罗氏沼虾MrToll1基因表达量呈先升高后下降的变化趋势,注射感染后24 h的表达量达峰值;Mrtoll2基因表达量呈下降—升高—下降—升高的波动变化趋势,注射感染后24 h的表达量达峰值;MrToll3基因表达量急剧下降,且维持在较低水平.[结论]罗氏沼虾MrToll1基因是鳃组织抵御细菌感染的主要应答基因,MrToll2基因可能参与鳃组织的其他免疫活动,MrToll3基因的调控机制尚未清晰.     

RNA干扰不同类型TLR基因对罗氏沼虾免疫相关基因表达的影响

本研究探讨了罗氏沼虾三种Toll样受体基因（Toll-like receptors,TLRs）的生理功能,为罗氏沼虾的免疫研究提供基础。实验通过对罗氏沼虾注射0.4μg/g、0.8μg/g和1.2μg/g（siRNA/体质量）三种剂量小干扰RNA（Short-interfering RNAs,siRNA）将MrTLR1、MrTLR2和MrTLR3三种TLR基因分别沉默。并采用荧光定量PCR技术对这三种Toll样受体基因在注射siRNA后0h、6h、12h、24h和48h鳃组织中的相对表达量进行分析,结果显示1.2μg/g组为最适干扰剂量。选取注射1.2μg/g siRNA后0h、24h以及48h鳃样品,结果显示在沉默MrTLR1后,罗氏沼虾体内髓样分化因子88基因（MyD88）、甲壳素基因（Crustin）和抗脂多糖因子基因（ALF）的相对表达量均出现显著下降,相反MrTLR2的相对表达量出现了上升;将MrTLR2沉默之后,MyD88以及Crustin的相对表达量明显下降;而在沉默MrTLR3后,免疫缺陷同系物基因（IMD）以及ALF的表达量显著上升,此外三种TLR基因的沉默对酚氧化酶原基因（proPO）的表达没有影响。研究结果表明MrTLR1和MrTLR2可调控MyD88以及抗菌肽的表达;而MrTLR3不仅参与Toll信号通路,也可能影响IMD信号通路。     

罗氏沼虾谷氨酸脱氢酶基因克隆及其在MrTV感染下的组织表达分析

本研究利用c DNA末端快速扩增技术克隆获得罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)谷氨酸脱氢酶(glutamate dehydrogenase,GDH)基因(Mr GDH)的c DNA全长序列,对其进行生物信息学分析,并检测该基因在罗氏沼虾不同组织中的表达差异;同时,利用罗氏沼虾太湖病毒(Macrobrachium rosenbergii Taihu virus,Mr TV)感染沼虾,研究感染前后沼虾鳃和肝胰腺Mr GDH的转录特征。结果显示,Mr GDH基因c DNA序列全长2 257 bp,拥有一个1 662 bp长的开放阅读框,合计编码氨基酸553个,合成的蛋白质分子质量约为61.37 k Da。Mr GDH氨基酸序列与中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)、凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)的同源性较高,达到92%,其二级结构和三维结构与黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)以及家蚕(Bombyx mori)高度相似,说明Mr GDH氨基酸序列比较保守。实时荧光定量聚合酶链式反应(quantitative real-time polymerase chain reaction,q RT-PCR)结果显示,Mr GDH基因在与机体运动和代谢有关的组织中表达量较高,其中在肌肉中表达量最高,而在血淋巴中最低。罗氏沼虾受Mr TV病毒感染48 h,肝胰腺和鳃中Mr GDH基因的表达在统计学上均极显著高于对照组(P0.01);感染72 h,鳃中Mr GDH基因表达显著高于对照组(P0.05),肝胰腺中Mr GDH基因表达极显著高于对照组(P0.01):说明Mr TV感染胁迫可以刺激罗氏沼虾Mr GDH的表达上调。     

不同启动子eGFP载体在罗氏沼虾活体内的表达效率比较

为筛选出较强的启动子用于提高外源基因在罗氏沼虾活体细胞中的转化表达效率,本研究构建包含eGFP基因和IE1、hr5-IE1及Sv40启动子的3个表达载体,分别按照10 μg·g^-1标准注射于体重5~7 g的活体罗氏沼虾肌肉内,采集注射活体肌肉的RNA样品检测各个启动子转录eGFP基因的效率。结果表明,在罗氏沼虾体内hr5-IE1启动子对eGFP基因的表达活性最强,其对eGFP外源基因的转录水平是IE1的3倍以上,IE1对于eGFP的转录水平也显著高于SV40的转录启动效率,其中SV40在罗氏沼虾体内的转录启动水平未检测到eGFP基因的转录表达,表明包含节肢动物门跨物种转录调控元件(增强子hr5)的IE1启动子能够在罗氏沼虾体内正常启动下游基因的转录表达及翻译,是罗氏沼虾开展分子功能研究较优的外源基因表达启动调控元件。     

罗氏沼虾 Doublesex 基因的原核表达与蛋白纯化

【目的】Doublesex 属于 DMRT 基因家族成员之一，在控制性别特异性分化中起关键作用。克隆罗氏沼虾（Macrobrachium rosenbergii）Doublesex 基因（MrDsx）的开放阅读框序列，构建重组质粒并诱导其表达，纯化获取罗氏沼虾重组蛋白 MrDsx，可为后续开展罗氏沼虾 MrDsx 基因的功能研究提供基础数据。【方法】基于罗氏沼虾 MrDsx 的开放阅读框序列，通过特异 PCR 产物与表达载体 pET-32a（+）连接，获得重组质粒 pET-32a-MrDsx，将其转化大肠杆菌 BL21（DE3）感受态细胞，构建罗氏沼虾 MrDsx 基因的原核表达细胞。利用异丙基 -β-D- 硫代半乳糖苷（IPTG）对阳性转化细胞进行诱导表达，并以 SDS-PAGE 电泳，Western blot 和质谱分析检测诱导表达的重组蛋白。【结果】以罗氏沼虾性腺 cDNA 为模板，利用 MrDsx 基因的特异引物，PCR 扩增获得了约 660 bp 大小的单一 DNA 条带。经测序确认为 MrDsx 基因的 ORF 序列。重组质粒 pET-32a-MrDsx转化后的感受态细胞经 IPTG 在 37 ℃条件下诱导 4 h 后获得罗氏沼虾重组蛋白 MrDsx。当 IPTG 终浓度为 0.1~0.5 mmol/L 时，重组蛋白 MrDsx 的表达量可达到峰值。可溶性分析显示，重组蛋白 MrDsx 主要以包涵体形式表达，经 8 mol/L 尿素溶解、Ni 柱纯化及透析复性后，SDS-PAGE 电泳和 Western blot 检测发现重组蛋白的相对分子量约 55 kD，且条带单一，表明重组蛋白 MrDsx 能被鼠抗 His-tag 单克隆抗体特异性识别。质谱分析结果显示，片段化肽段与理论的氨基酸序列相符，匹配度达到 100%。【结论】成功获得了 MrDsx 基因原核表达的重组质粒pET-32a-MrDsx。诱导表达的重组蛋白经溶解、纯化及复性后，可形成高纯度的活性罗氏沼虾 MrDsx 重组蛋白，为后续开展罗氏沼虾 MrDsx 基因的功能研究、互作蛋白的筛选和性别调控机制的解析提供初步依据。     

马氏珠母贝TLRP基因克隆及其功能研究

【目的】明确马氏珠母贝TLRP基因（PmTLRP）的组织表达特征及哈维氏弧菌（Vibrio harveyi）刺激、植核及脂多糖（LPS）刺激后的时序表达特点,为进一步研究TLRs在马氏珠母贝中的免疫机制打下基础。【方法】采用RACE克隆PmTLRP基因cDNA序列,通过ProtParam、 ProtScale、 SignalP 4.0、 TMHMM v.2.0、 SMART、 SoftBerry Psite和SOPMA等在线软件进行生物信息学分析,并以实时荧光定量PCR检测PmTLRP基因在马氏珠母贝各组织中及经哈维氏弧菌、植核及LPS刺激后的表达情况。【结果】 PmTLRP基因cDNA序列全长2214 bp,包含33 bp的5'非编码区 （5'-UTR）、135 bp的3'非编码区（3'-UTR）及2043 bp的开放阅读框（ORF）,共编码681个氨基酸残基;其编码蛋白含有信号肽、富含亮氨酸重复序列 （LRRs）、跨膜结构域和TIR结构域,符合TLRs家族所具有的特征; PmTLRP氨基酸序列与其他物种的TLRs氨基酸序列存在一定相似性,其中与美洲牡蛎TLP氨基酸序列的相似度较高。PmTLRP基因在马氏珠母贝外套膜、血淋巴、肝胰腺、鳃、性腺和闭壳肌中均有表达,以在肝胰腺中的相对表达量最高,显著高于在其他组织中的相对表达量 （P<0.05）。在哈维氏弧菌刺激下, PmTLRP基因在血淋巴中的相对表达量于注射刺激后12 h开始上调,至注射刺激后16 h达最大值,约是注射刺激前 （0 h）的19.0倍。经植核刺激后, PmTLRP基因相对表达量在植核后5~20 d呈逐渐上升趋势,于植核后30 d达最大值,约是植核前 （0 h）的6.4倍。在LPS刺激下, PmTLRP基因在血淋巴中的相对表达量先上升后下降,至注射刺激后3 h达最大值,约是对照组的5.0倍; PmTLRP基因在肝胰腺中的相对表达量呈升高→降低→升高→降低→升高的波动变化趋势,至注射刺激后24 h相对表达量上调到最大值,约是对照组的6.0倍。【结论】 PmTLRP基因在马氏珠母贝外套膜、血淋巴、肝胰腺、鳃、性腺和闭壳肌中均有表达,但表达水平存在差异,经哈维氏弧菌、植核及LPS刺激后呈明显上调表达趋势,说明TLRP在马氏珠母贝的免疫防御反应中扮演重要角色。     

文蛤CDK7基因克隆及其在不同品系生长发育中的表达分析

【目的】掌握文蛤（Meretrix meretrix）细胞周期蛋白依赖性激酶7（CDK7）基因（MmCDK7）的时空表达及在不同品系生长发育中的表达规律,从分子水平探究红壳色文蛤新品系的生长优势,为筛选文蛤生长相关基因及揭示其生长发育机制提供理论依据。【方法】利用RACE克隆MmCDK7基因cDNA序列,通过BLAST、ScanProsite、NetPhos3.0 server及ExPASy等在线软件进行生物信息学分析,使用实时荧光定量PCR检测MmCDK7基因在文蛤不同组织和不同发育时期的表达情况,并比较同一养殖条件下红壳色文蛤（简称红文蛤）和黄壳色文蛤（简称黄文蛤）的壳长、壳长相对增长率及MmCDK7基因表达差异。【结果】MmCDK7基因cDNA序列全长1296bp,其中,5'端非编码区（5'-UTR）为83bp,3'端非编码区（3'-UTR）为196bp,开放阅读框（ORF）为1017bp,共编码338个氨基酸残基。MmCDK7蛋白分子量约38.32 D,理论等电点（pI）为8.78,包含丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶催化结构域（S_TKc）、酪氨酸激酶催化结构域（TyrKc）及与细胞周期蛋白结合有关的激酶结构域NRTALRE;而S_TKc结构域中有包含蛋白激酶ATP结合位点区域、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶活化位点区域及T-loop环。MmCDK7氨基酸序列与虾夷扇贝CDK7氨基酸序列高度同源,其相似性为75.00%;基于CDK7氨基酸序列相似性构建的系统发育进化树显示,文蛤与中国真蛸、长牡蛎、厚壳贻贝及虾夷扇贝等软体动物先聚为一支。MmCDK7基因在性腺、水管、外套膜和肝胰腺等组织中均有表达,以性腺中的相对表达量显著高于其他组织（P<0.05,下同）;MmCDK7基因在2种文蛤的8个发育时期均有表达,均以多细胞时期的相对表达量最高。在同一养殖条件下,除9月18日外,其他采样时间点均表现为红文蛤的壳长显著大于黄文蛤,红文蛤相对于黄文蛤的壳长增长率在2.79%~32.37%;除11月15日和11月30日外,其他采样时间点均表现为红文蛤的MmCDK7基因相对表达量显著高于黄文蛤的相对表达量。【结论】MmCDK7基因属于CDK家族成员,在细胞分裂旺盛的性腺及多细胞时期的相对表达量最高,且在生长速度较快红文蛤中的相对表达量多数情况下显著高于黄文蛤,故推测MmCDK7基因参与调控文蛤的早期生长发育过程。     

盐碱胁迫对莫桑比克罗非鱼TauT2基因表达的影响

【目的】研究在莫桑比克罗非鱼（Oreochromis mossambicus）中新发现的编码牛磺酸转运蛋白的基因TauT2在盐碱胁迫下对鱼体渗透压调控的作用,为深入阐明鱼类中牛磺酸转运蛋白的功能提供更全面可靠的数据。【方法】通过PCR和直接测序的方法对TauT2基因的编码区序列（CDS）进行分析,用生物信息学分析方法预测其编码蛋白的氨基酸序列及其高级结构,并利用荧光定量PCR检测该基因在肝、肠、肌肉等13个组织中的表达特征,以及在盐碱胁迫（盐25 g/L,碱4 g/L） 96 h内,不同时间点鳃、肾、肠和肝组织中TTauT2基因mRNA的表达水平。【结果】获得的TauT2基因CDS序列全长1881 bp,共编码626个氨基酸,氨基酸序列与斑马拟丽鱼（Maylandia zebra）牛磺酸转运蛋白的一致性最高,为98.72%,与已报道的莫桑比克罗非鱼的tTAUT1蛋白一致性为88.52%,该蛋白具有典型的牛磺酸转运蛋白跨膜结构域。荧光定量PCR结果表明,TauT2基因在肝、肠、肌肉等13个组织均有表达,其中血液中表达量最高,肠中的表达量最低。盐碱胁迫条件下,TauT2基因mRNA表达水平在鳃、肾、肠和肝组织中的表达均呈先升高再下降的变化趋势,鳃和肝达峰值的时间为48 h,肾和肠达峰值的时间分别是24和72 h,达峰值的时间与莫桑比克罗非鱼的tTauT1基因存在明显差异。【结论】莫桑比克罗非鱼在受到盐碱胁迫后,通过提升TauT2基因的表达量来有效调控体内渗透压,为渗透压稳态的维持发挥作用。莫桑比克罗非鱼体内至少有2种不同的牛磺酸转运蛋白,已发现的这2个蛋白氨基酸序列、三级结构及在鱼体不同组织中精细调节体内渗透压的功能存在一定差异。     

中华绒螯蟹过氧化物还原酶基因克隆及其在鳗弧菌感染下的表达分析

【目的】克隆中华绒螯蟹（Eriocheir sinensis）过氧化物还原酶基因（EsPrx）的开放阅读框（ORF）,并分析EsPrx基因的组织表达特征及细菌感染下的表达情况,为中华绒螯蟹的先天免疫和抗病机制研究提供参考依据。【方法】通过RT-PCR结合转录组序列比对克隆出EsPrx基因,利用DNAStar、ClustalW、ExPASy、TMHMM Server v.2.0、SignalP 5.0及NetPhos 3.1 Server等在线软件进行生物信息学分析,并以实时荧光定量PCR检测EsPrx基因的组织表达特征及鳗弧菌（Vibrio anguillarum）感染下的表达情况。【结果】EsPrx基因ORF为597 bp,共编码198个氨基酸残基,含有Prx特有的2个结构域（FYPLDFTFVCPTEI和GEVCPA）。EsPrx蛋白分子式为C₉₉₄H₁₅₄₄N₂₅₈O₂₉₃S₈,分子量为22.05 kD,理论等电点（pI）为5.67,无跨膜域和信号肽,属于非分泌性蛋白。EsPrx氨基酸序列与扁额青蟹（Eurypanopeus depressus）、拟穴青蟹（Scylla paramamosain）和三疣梭子蟹（Portunus trituberculatus）的Prx氨基酸序列高度同源,对应的相似性分别89%、89%和88%;基于Prx氨基酸序列相似性构建的系统发育进化树也显示,EsPrx氨基酸序列先与拟穴青蟹、扁额青蟹及南美白对虾（Penaeus vannamei）的Prx氨基酸序列聚在一起,再与其他动物的2-Cys Prx氨基酸序列聚类,证实EsPrx基因属于未分化的Prx基因,即Prx1/2基因。EsPrx基因在中华绒螯蟹各组织中广泛表达,以肝胰腺的相对表达量最高,极显著高于在其他组织中的相对表达量（P<0.01）;EsPrx基因表达在鳗弧菌感染不同时间段存在明显差异,感染6~24 h其相对表达量显著升高（P<0.05）,而后迅速降至正常水平。【结论】EsPrx基因为甲壳动物未分化的Prx1/2基因,在中华绒螯蟹肝胰腺中高表达,并参与鳗弧菌感染的抗氧化应激反应,即在抗逆过程中发挥重要作用。     

氰戊菊酯等4种化学药物对克氏原螯虾的急性毒性及组织病理观察

【目的】评价氰戊菊酯、辛硫磷、硫醚沙星和甲霜灵对克氏原螯虾（Procambarus clarkii）的急性毒性,分析其对克氏原螯虾的组织病理影响,为生态风险评估提供基础数据。【方法】采用静态试验法测定4种药物浸泡下克氏原螯虾的急性毒性作用,分别使用4种药物48 h半致死浓度（LC₅₀）和96 h-LC₅₀的10%浓度浸泡克氏原螯虾48和96 h后取样,基于石蜡切片技术比较分析4种药物对克氏原螯虾肝胰腺和肌肉组织结构的影响。【结果】4种药物浸泡下表现的中毒症状比较类似,且不同浓度组的中毒症状表现出明显的剂量和时间效应。急性毒性试验结果表明,4种化学药物对克氏原螯虾的毒性排序为氰戊菊酯>辛硫磷>硫醚沙星>甲霜灵。氰戊菊酯对克氏原螯虾24、48和96 h的LC₅₀分别为4.375、4.252和3.865μg/L,辛硫磷对克氏原螯虾24、48和96 h的LC₅₀分别为161.301、87.784和81.637μg/L,硫醚沙星对克氏原螯虾24、48和96 h的LC₅₀分别为76.541、72.509和52.529 mg/L,甲霜灵对克氏原螯虾24、48和96 h的LC₅₀分别为20.610、5.499和4.141 g/L。组织病理观察发现,以相对低浓度的化学药物染毒克氏原螯虾后,仍会对克氏原螯虾的组织产生损伤和破坏。染毒后的肝胰腺发现部分细胞破裂、皱缩、坏死,B细胞及其内部转运泡体积明显增大且增多,R细胞颜色加深等现象;肌肉整体呈现肌纤维断裂溶解、细胞排列不紧密、出现明显空腔等现象。【结论】氰戊菊酯、辛硫磷、硫醚沙星和甲霜灵对克氏原螯虾的急性毒性具有较大差异。克氏原螯虾在4种化学药物的安全浓度下均能够存活,但会对肝胰腺和肌肉组织产生破坏。     

大珠母贝组织蛋白酶B基因克隆及其表达分析

【目的】分析组织蛋白酶B基因（CatB）在大珠母贝（Pinctada maxima）不同组织中的表达模式,明确CatB在大珠母贝中的功能作用,为培育生长快且抗逆性强的大珠母贝提供基础资料。【方法】利用RACE克隆大珠母贝CatB基因,利用ExPASy ProtParam、ExPASy ProtScale、NPS@SOPMA、SWISS-MODEL及SignalP 4.1等在线软件进行生物信息学分析,并以实时荧光定量PCR检测CatB基因在大珠母贝外套膜（套膜区、边缘膜区和中央膜区）、肝胰腺、鳃、足和闭壳肌等组织中的表达情况。【结果】大珠母贝CatB基因cDNA序列全长1365 bp,其开放阅读框（ORF）1026 bp,5'非编码区（5'-UTR）长度81 bp,3'非编码区（3'-UTR）长度258 bp,共编码341个氨基酸残基。大珠母贝CatB蛋白分子量为37.73 kD,理论等电点（pI）为6.66,脂溶性系数为67.48,不稳定指数为31.18,亲水性平均系数（GRAVY）为-0.451,为稳定的亲水性蛋白;在第89~337位氨基酸存在一个Pept-C1结构域。大珠母贝CatB蛋白二级结构以无规则卷曲为主,占51.03%,α-螺旋占26.98%,β-转角占9.09%,延伸链占12.90%;三级结构与马氏珠母贝（P.fucata martensii）CatB蛋白结构相似。大珠母贝CatB氨基酸序列与马氏珠母贝CatB氨基酸序列（ADX32985.1）的相似性高达90.91%;与长牡蛎（Crassostrea gigas,XP_011428258.1）、海湾扇贝（Argopecten irradians,ANG56311.1）、褶纹冠蚌（Cristaria plicata,AEF32260.1）的CatB氨基酸序列相似性分别为79.47%、65.38%和62.18%。CatB基因在大珠母贝外套膜的套膜区、边缘膜区和中央膜区及肝胰腺、鳃、足和闭壳肌等7个组织中均有表达,以肝胰腺中的相对表达量最高,显著高于在其他组织中的相对表达量（P<0.05）,其次是外套膜的套膜区和中央膜区。【结论】CatB基因在大珠母贝肝胰腺中高表达,其次是外套膜的套膜区和中央膜区,故推测CatB是通过参与大珠母贝的消化吸收作用而调控其生长代谢过程。