人参发根的诱导及其分子检测

[目的]探讨发根农杆菌诱导人参发根分子机理。[方法]用发根农杆菌A4菌株感染3年生人参根外植体,在无激素的MS培养基上诱导人参发根,并对其进行分子检测,考察rolB和rolC基因是否转化并整合到人参基因组中。[结果]成功获得了人参发根,该发根在固体和液体培养基上得到了很好的继代;从人参发根DNA中检测到rolB和rolC基因,与已发表发根农杆菌质粒相应的核苷酸序列的同源性达到99%。[结论]发根农杆菌质粒的rolB和rolC基因已转化并整合到人参基因组中,是人参发根产生的分子机理。     

人参发根的愈伤组织诱导

采用L9(34)正交试验设计方法研究了2,4-D、KT和6-BA3种植物生长调节物质在人参发根愈伤组织诱导中的作用.结果表明:人参发根愈伤组织诱导的最佳培养基为MS 2,4-D1mg/L 6-BA0.1mg/L;人参发根愈伤组织生长的最优培养基为MS 2,4-D1.5mg/L KT1.5mg/L.     

影响人参发根中皂甙含量基因的定位及其克隆

通过发根农杆菌与人参外植体共培养，在人参根外植体上用直接接菌方法，诱导出人参发根。Southern点杂交证明：本研究获得的人参发根确已被Ri质粒的T-DNA所转化，并被整合到人参发根DNA上。根据Slightom等RiA4 TL-DNA系列分析结果，利用PCR方法从人参发根中扩增并克隆了影响人参皂甙合成基因roIC。     

西洋参发根的诱导及其培养条件的研究

利用发根农杆菌A4菌株在西洋参根外植体上直接诱导产生发根。在1/2 MS和MS固体培养基上得到西洋参发根,并在B5液体培养基上建立起发根离体培养系,经连续多代的培养,发根仍保持旺盛生长状态。PCR扩增结果表明,发根农杆菌Ri质粒的rolC基因已整合到西洋参发根基因组中并得到表达。利用紫外分光光度法测得西洋参发根的总皂苷含量达3.88%。经对发根比生长速率的测定,确定1/2 B5培养基(15 g/L蔗糖)、摇床转速100 r/min、每4周更换1次培养基并继代培养1次为西洋参发根生长适宜条件。     

人参发根R9923系皂苷生产研究

在1／2MS培养液内补料培养4周，人参发根R9923系中各单体皂苷含量与总皂苷含量大致上呈先降后升再降的过程，发根生物量与总皂苷含量呈上升趋势；不同瓶型培养的发根，其生物产量与皂苷含量随培养容积的增大而降低；发根工厂化培养适宜的接种量：种子罐为3～5g／50mL，培养2周，次级罐接种量为30g／400mL，再培养2周后，即可转入生产罐(SL)中继续培养至采收。     

人参胚愈伤组织诱导和悬浮培养的研究

[目的]建立一种从人参胚诱导愈伤组织并进行悬浮培养的方法,考察这种悬浮细胞的生长和人参皂苷积累情况。[方法]以人参胚为外植体,在添加了2,4-D3mg/L、NAA2mg/L和6-BA0.5mg/L的MS培养基上诱导愈伤组织。选取经8次继代培养的松散的愈伤组织在含有同样激素的液体培养基中进行悬浮培养。继代悬浮培养5次后测定悬浮细胞生长曲线,用高效液相色谱（HPLC）技术分析细胞中所含的人参皂苷。[结果]有活性的人参胚愈伤组织的诱导率为100%。用这种愈伤组织建立的悬浮培养体系生物量在21d内可增加1.5倍,悬浮培养物至少含有6种人参皂苷,其中Rb1、Rg和Re的含量较高,分别为细胞干重的0.44%、0.35%和0.37%。[结论]由人参胚诱导的愈伤细胞进行悬浮培养比较容易,生长良好,含有较丰富的人参皂苷。     

发根农杆菌诱导黄芩毛状根的研究

利用发根农杆菌A4,A4 9615,1.2556诱导中药黄芩外植体,得到黄芩不定根,根据形态和在MS培养基中进行培养证实得到黄芩毛状根,经抗菌素氨苄西林钠500 mg/L除菌后,毛状根表现出分枝多,生长快,且能在MS中生长繁殖的特性,为采用生物技术生产黄芩活性成分奠定基础。     

发根农杆菌介导的怀地黄遗传转化研究

利用发根农杆菌转化怀地黄组培苗子叶、叶柄和茎段,建立了有效的毛状根培养及其植株再生体系。毛状根可直接从受伤的外植体产生,能在无外源激素的1/2MS固体和液体培养基上自主生长,表现出典型的发根特征。毛状根在附加0.2mg/LKT和3.0mg/L6-BA的1/2MS培养基上能100%形成愈伤组织,51.49%分化出芽;分化芽在1/2MS培养基上100%生根,形成具有矮化、节间短和根系发达等特征的转化再生植株且移栽后生长旺盛。rolB基因PCR和冠瘿碱纸电泳检测证明,农杆菌Ri质粒上的T-DNA整合到怀地黄基因组中并表达,获得转基因怀地黄。     

发根农杆菌A4菌株诱导三分三毛状根的研究

利用发根农杆菌A4菌株侵染三分三组培苗叶片诱导毛状根,并对其毛状根进行继代增殖培养;采用PCR技术检测毛状根。结果表明：发根农杆菌A4菌株Ri质粒的rolB基因已整合到三分三叶肉细胞的基因组中,进而成功地从叶片诱导出毛状根,诱导率可达77%以上;毛状根除菌后,能在无激素的MS固体培养基上快速生长。三分三遗传转化体系的建立为实现基于毛状根的三分三产托品烷类生物碱的代谢工程奠定基础。     

发根农杆菌对非洲紫罗兰的转化初报

利用农杆碱型发根农杆菌R1601对非洲紫罗兰无菌苗叶片进行了转化,转化后叶片产生白色茸状毛根,与对照相比有明显的形态差异,离体根能在不含激素的MS液体培养基上自主生长。     

黄秋葵再生体系的建立及毛状根的诱导

[目的]建立黄秋葵的再生体系并诱导其毛状根.[方法]以黄秋葵无菌苗的叶片和茎段为外植体,建立黄秋葵的体细胞再生体系,并利用发根农杆菌A4侵染黄秋葵叶片,诱导毛状根.[结果]愈伤组织的最佳诱导培养基为MS＋ 1.0 mg/L 6-BA ＋0.5 mg/L NAA时;最佳体细胞胚发生培养基为MS ＋0.5 mg/L NAA;毛状根最佳诱导条件为叶片预培养48h,侵染时间6min.[结论]该研究为成功构建黄秋葵遗传转化体系和研究黄秋葵中的次生代谢产物奠定了基础.     

铃铛子发根诱导体系及培养条件的优化

铃铛子(Anisodus luridus)是西藏特有的托品烷生物碱药源植物.利用农杆菌C58C1(pRiA4)侵染铃铛子不同器官考察发根诱导频率,并考察了7种培养基(1/2MS,MS,1/2B5,White,WPM,B5和N6)对发根生物量和托品烷生物碱质量分数的影响.真叶和茎段的发根诱导频率分别为53.33%和60.00%,子叶不能诱导出发根.PCR表明rolB和rolC基因已整合到发根的基因组中.B5培养基最适于铃铛子发根生物量和托品烷生物碱积累,发根鲜质量和干质量分别达到6.9±0.94g/瓶和0.44±0.06g/瓶;发根中莨菪碱质量分数为3.49±0.13mg/g.B5和1/2B5培养基中发根的东莨菪碱质量分数高于其他的培养基,分别为1.37±0.06mg/g和1.43±0.22mg/g,二者之间差异无统计学意义.在B5培养基中发根总生物碱产量也是最高的,为2.1±0.29mg/瓶.研究结果为利用发根规模化生产莨菪碱和东莨菪碱奠定了基础.     

南药巴戟天毛状根诱导条件优化研究

为探索巴戟天毛状根的诱导条件,该研究选择不同发根农杆菌ATCC15834、AR10、Msu440菌株诱导巴戟天无菌苗的幼芽、叶片、叶柄、茎段等外植体形成毛状根,并研究了共培养时间和乙酰丁香酮(AS)浓度等因素对巴戟天毛状根转化率的影响。结果表明:巴戟天毛状根的最佳诱导条件为:以幼芽为外植体,ATCC15834为转化菌,侵染时间20 min,并在培养基中添加300μmol/L乙酰丁香酮条件下,巴戟天毛状根的诱导转化率最高,可达36.7%。     

花生毛状根诱导及其体外培养

[目的]优化花生毛状根诱导条件,为体外培养毛状根生产白藜芦醇以及培养花生根结线虫奠定基础。[方法]研究不同的发根农杆菌及其菌液浓度、外植体类型、侵染时间、共培养时间、乙酰丁香酮浓度对花生毛状根诱导的影响。[结果]发根农杆菌ACCC10060的毛状根诱导率高于ATCC11325;幼叶外植体的毛状根诱导率高于子叶;最佳侵染菌液浓度为0.2～0.4;最佳共培养时间为2 d;最佳侵染时间为10～15 min;菌液中添加75μmol/L乙酰丁香酮(AS)可以提高毛状根诱导率。通过毛状根能在无激素的MS培养上自主生长以及毛状根冠瘿碱检测,确定发根农杆菌中Ri质粒中已整合到花生基因组中。毛状根体外培养的研究表明,液体培养效果好于固体培养,最佳液体培养基为无激素的MS培养基。[结论]该研究建立的花生毛状根培养体系,将为花生转基因技术的完善及利用毛状根生产白藜芦醇和无菌的花生根结线虫提供试验基础。     

发根农杆菌诱导苦参毛状根的研究

[目的]为苦参有用成分的大量生产提供新的途径。[方法]利用发根农杆菌R1601分别对药用植物苦参的根段、茎段、叶片、子叶进行侵染。[结果]在相同条件下,叶片、茎段和根段成功诱导出毛状根,但诱导频率不同,茎段作为外植体诱导率最高,达到26.7%,更适合作为外植体选用。毛状根除菌后,能在MS培养基上自主生长。[结论]发根农杆菌的RiT-DNA基因已经整合到苦参基因组中。该研究为采用生物技术生产苦参活性成分奠定了基础。     

党参毛状根诱导条件研究

[目的]研究党参毛状根的诱导条件。[方法]利用发根农杆菌A4、C58C1和A1476进行毛状根诱导,探讨发根农杆菌种类、外植体类型、菌液浓度、侵染时间和共培养天数等因素对党参毛状根诱导的影响。[结果]3种发根农杆菌中A4诱导率最高;茎段的诱导率最高;发根农杆菌浓度在OD_(600)为0.4时诱导效果较好;较佳侵染时间为5 min;共培养时间为2 d时诱导率较高;头孢噻肟钠浓度为300 mg/L时除菌效果较好。[结论]该试验为大量生产毛状根以及毛状根的后续研究提供试验基础。     

三裂叶葛毛状根的诱导及葛根素的产生

利用发根农杆菌R1601感染药用植物三裂叶野葛叶片、茎段、芽、叶柄等外植体,诱导毛状根产生,通过PCR扩增和southern印迹试验,证实发根农杆菌Ri质粒的T-DNA片段已整合进植物的核基因组中,这些毛状根可以在无激素的培养基中快速生长.本试验探索了不同的外植体对诱导率的影响,对产生的毛状根活性物质的含量进行了分析,结果表明,葛转化中叶片是最合适的外植体,而不同的毛状根细胞株中葛根素的含量差异较大,平均含量达到4.21%.