LAMP在检测转基因抗草甘膦大豆cp4-epsps基因的应用

以转基因抗草甘膦大豆为主要研究对象,利用环介导等温扩增技术（Loop-Mediated Isothermal Amplification,LAMP）,针对cp4-epsps合成酶基因（5-enolpymvlshimimate-3-phosphate synthase）的6个区域设计4条特异性引物,利用一种链置换DNA聚合酶（Bst DNA polymerase）,在65℃保温30Igm,通过荧光显色即可完成对转基因的检测工作。结果显示,该LAMP方法能够特异性检测cp4-epsps基因,其检测灵敏度是常规定性PCR方法的10倍。建立了针对转基因大豆cp4-epsps基因的LAMP检测方法,其具有高度的特异性及稳定性,结果可靠,适合转基因抗草甘膦大豆的快速检测。     

第一、二代转cp4-epsps基因大豆鉴定方法的建立

[目的]建立一种广谱性鉴定第一、二代转cp4-epsp基因大豆的检测方法,为准确鉴定第一、二代转cp4-epsps基因大豆及其产品提供技术支持.[方法]根据第一、二代转基因大豆的cp4-epsp基因保守序列设计一对能同时鉴定两代转基因大豆外源基因cp4-epsps的引物和探针,建立一种广谱性鉴定第一、二代转cp4-epsps基因大豆的方法,并从准确性、特异性、灵敏性及重复性4个方面对该方法进行评估.[结果]设计的引物/探针对鉴定第一、二代转cp4-epsps基因大豆及其产品具有广谱性;建立的检测方法能检测到反应体系中低至5×100拷贝的cp4-epsps基因,Ct为38.88,且能同时检测出两代转基因大豆.准确性和特异性评估结果显示仅两代转cp4-epsp基因的大豆能被检测到;40次重复试验结果显示,反应体系中5×100拷贝的cp4-epsps基因片段的检出率为100%.[结论]建立的第一、二代转cp4-epsps基因大豆鉴定方法具有特异强、灵敏度高、重复性好、准确性高等特点,可用于转cp4-epsp基因大豆及其产品的监测.     

抗草甘膦转基因大豆PCR检测方法的建立与应用

 应用PCR检测方法 ,以大豆凝集素 (lectin)基因为内置标准 ,检测了抗草甘膦转基因大豆中的外源CaMV35S启动子、NOS终止子和CP4 EPSPS成分 ,并通过Southern杂交进一步证实了PCR检测结果的可靠性 ,建立了基于PCR的抗草甘膦转基因大豆检测方法 ,最低检测限度为 0 .0 5 %。用此方法检测转基因情况未知 ,分别来自欧盟、美国、阿根廷、未知国别的进口大豆及未知国别的进口豆粕 ,除从欧盟进口的大豆无CaMV35S启动子、NOS终止子、CP4 EPSPS基因成分外 ,其余样品均含有上述成分 ;而从国内非转基因大豆中未检出上述成分。用此方法检测抗草甘膦大豆京引D1×豫豆 12的F2 和F2∶5群体植株 ,PCR检测结果与大田施药 (草甘膦有效成分 1.0kg·ha-1)检测结果一致率分别达 10 0 %和 93.0 %。     

抗草甘膦转基因大豆的获得

大豆[Glycine max(L.)Merrill]是我国主要的粮食和油料作物,但近年来由于大量进口美国的转基因大豆,使我国的大豆生产严重萎缩。生物技术方法应用于改良大豆的农艺性状和产品质量以及对除草剂的耐受性,特别是对草甘膦的耐受性这一个重要性状。本研究以东农50为受体,采用农杆菌介导法,将抗草甘膦基因G10-EPSPS基因转入到大豆中,先后获得了3株T0代植株,在T0代进行抗性鉴定后,1株得到种子。试验通过对转基因后代的PCR检测、Western检测以及草甘膦抗性鉴定,证明外源基因已整合到植物基因组中,并在T0、T1和T2代稳定表达。本研究为转基因大豆育种提供了材料和数据。     

抗草甘膦转基因大豆PCR定量检测研究

试验建立大豆中转基因成分的定量测定方法。采用双链DNA SYBR Green I结合染料实时荧光定量PCR技术，扩增编码大豆凝集素的内参照基因lec和抗草甘膦转基因大豆中的外源花椰菜花叶病毒CaMV35s基因。绘制2种基因扩增的循环数一拷贝数标准曲线图，根据标准曲线方程计算样品中的转基因含量；并作重现性和熔解曲线分析。结果表明，lec和CaMV35s基因标准曲线方程线性好，R^2值分别达到0．9997和0．9992。不同转基因含量的标准及模拟大豆样品定量显示，实测值与实际值接近，相对偏差5％～11％。SYBR Green I实时定量PCR方法可用于定量测定大豆中转基因品种的含量。     

世界抗草甘膦大豆的发展

转基因抗除草剂作物的创制是近代农业生物技术中最活跃、也最具成效的领域,而抗草甘膦作物则是抗除草剂作物中的核心,其中抗草甘膦大豆居于首位而起着极为重要的作用。1抗草甘膦大豆在世界上的分布1996年抗草甘膦大豆开始大面积种植,美国农民迅速接受了抗除草剂品种,种植面积不     

转2mG2-epsps基因烟草的草甘膦耐受性分析

利用农杆菌介导法将耐草甘膦基因2mG2-epsps转入烟草,获得87株PCR阳性植株,阳性率为43%。对PCR阳性植株进行Southern杂交、RT PCR、Western 杂交和ELISA分析,结果显示外源基因已经整合到烟草基因组中并高效表达,转基因植株的叶片中2mG2-EPSPS蛋白的最高表达量可达26.03 μg/g 鲜重。转基因烟草草甘膦耐受性分析显示,其中有15个转化事件表现出较好的草甘膦耐受性,对草甘膦的耐受性可达到1%。转基因植株的种子可以在10 mmol/L草甘膦异丙铵盐浓度下萌发,T1代转基因烟草幼苗可以耐受浓度为0.8%的草甘膦。研究结果表明转2mG2-epsps基因烟草具有较高的草甘膦耐受性,2mG2-epsps基因可以用于耐除草剂转基因作物的培育。     

转基因抗草甘膦大豆安全性评价及对环境影响的检测

杂草防治是大豆种植中的重要问题。美国、阿根廷等国家主要是通过种植抗草甘膦大豆，进而喷施草甘膦来消灭杂草。转基因抗草甘膦大疆在我国目前尚没有推广种植。为了保护野生大豆资源的多样性，研究抗草甘膦大豆的基因检测方法，对环境尤其是豆类近缘作物的基凶漂移愈来愈重要。本试验对从阿根廷引进的抗草甘膦大豆在田间种植后对大豆及其近缘种漂移可能性及检测方法进行了研究，并在南京点检测到发生基因漂移的野生大豆1株。这说明大豆与野生大豆发生基因漂移是可能的，同时也提示引种抗草甘膦大豆应有足够的安全控制措施，以免发生基因漂移而逸生为超级杂草。     

抗草甘膦转基因大豆对豆田主要杂草多样性的影响

杂草是制约大豆生产的关键因子,抗除草剂转基因大豆为大豆生产提供可持续稳产和增产的潜力。目前,我国转基因大豆至今还处于试验阶段,还不能商业化种植。2010年在中国农科院廊坊科研中试实验基地用5点取样法调查研究了抗草甘膦转基因大豆AG5601、呼交03—263、呼交06—698对豆田杂草的影响。结果表明：在对豆田杂草种类及数量、田间密度（MD）、田间均度（U）、田间频率（F）和相对多度（RA）调查中,只有抗草甘膦转基因大豆呼交03—263豆田中狗尾草的F和RA显著低于亲本受体蒙豆12,其它杂草无显著差异。这说明抗草甘膦转基因大豆AG5601、呼交03—263、呼交06—698对豆田杂草没有显著影响。     

抗草甘膦转基因大豆对豆田主要杂草多样性的影响

杂草是制约大豆生产的关键因子,抗除草剂转基因大豆为大豆生产提供可持续稳产和增产的潜力.目前,我国转基因大豆至今还处于试验阶段,还不能商业化种植.2010年在中国农科院廊坊科研中试实验基地用5点取样法调查研究了抗草甘膦转基因大豆AG5601、呼交03-263、呼交06-698对豆田杂草的影响.结果表明:在对豆田杂草种类及数量、田间密度(MD)、田间均度(U)、田间频率(F)和相对多度(RA)调查中,只有抗草甘膦转基因大豆呼交03-263豆田中狗尾草的F和RA显著低于亲本受体蒙豆12,其它杂草无显著差异.这说明抗草甘膦转基因大豆AG5601、呼交03-263、呼交06-698对豆田杂草没有显著影响.     

野生大豆抗草甘膦基因的漂移与检测

通过对从阿根廷引进的抗草甘膦大豆在田间种植,在四周50m范围内植野生大豆Y—8104,收获后第2年种植,通过喷施草甘膦,发现1株抗草甘膦野生大豆,因怀疑抗草甘膦大豆在田间种植,取其叶片提取DNA,再经过PCR检测,确认为阳性,可初步判定该株野生大豆为基因漂移植株。     

转基因大豆Roundup Ready的高通量PCR检测

以转基因大豆标准品(BF410f)为材料,以标准PCR检测方法为基础,根据不同标准检测参数的兼容性和PCR对引物退火温度的要求,设计高通量的PCR检测方法,从大豆中快速准确地检测出Lectin、CaMV35S、CP4-EPSPS、NOS等转基因元件,提高了PCR检测效率,节约了时间.另通过梯度PCR仪摸索出合适的反应体系:预变性T＝94 ℃,5 min;变性温度T＝94 ℃,30 s;退火温度T＝58 ℃,30 s; 延伸温度T＝72 ℃,延伸40 s.35个循环后,所有受试元件均得到了扩增,很大程度地提高检测效率,该方法对于引物理论退火温度在50～60 ℃范围内具有广泛的适用性.     

环介导等温扩增技术快速检测单核细胞增生性李斯特氏菌的研究

[目的]采用环介导等温扩增技术,快速检测单核细胞增生性李斯特氏菌。[方法]以单核细胞增生性李斯特氏菌（CMCC54001）的hlyA基因作为靶基因,设计引物,观察检测结果。[结果]确定了环介导等温扩增技术检测单核细胞增生性李斯特氏菌的最适反应条件。采用该方法检测单核细胞增生性李斯特氏菌的灵敏度为4.2CFU/ml。[结论]该研究建立了环介导等温扩增技术单核细胞增生性李斯特氏菌的检测方法。     

山西省马铃薯Y病毒cp基因的克隆

[目的]对山西省马铃薯Y病毒cp基因进行克隆与序列特征分析。[方法]依据马铃薯Y病毒基因组序列,设计合成了一对引物PVYP1和PVYP2,以从山西省获得的带毒马铃薯叶片总RNA为模板,对RT-PCR扩增得到的基因片段进行序列测定。[结果]该DNA片段1～798bp为马铃薯Y病毒印基因,799～1064bp为3’非编码区序列,可编码265个氨基酸。将RT—PCR产物与载体连接后转入大肠杆菌提取阳性克隆的质粒DNA,酶切后琼脂糖凝胶电泳检测结果表明,重组质粒已转入大肠杆菌。BLAST软件分析表明,山西省马铃薯Y病毒分离物CP氨基酸序列与已公布的PVY CP氨基酸序列相似性最高可达100％,说明所得DNA片段确为PVY cp基因片段。[结论]该研究为对山西省马铃薯Y病毒的防治提供理论依据。     

环介导等温扩增技术快速检测志贺氏菌的研究

[目的]利用环介导等温扩增技术快速检测志贺氏菌。[方法]以志贺氏菌侵袭性质粒抗原H基因（ipaH）作为靶序列,设计引物,优化Mg2＋浓度、Bst酶浓度等反应条件,建立LAMP反应体系。[结果]确定了环介导等温扩增技术检测志贺氏菌的适宜反应条件;该法检测志贺氏菌的灵敏度为62 cfu/ml。[结论]该研究初步建立了一种利用LAMP快速检测志贺氏菌的方法,为食品中志贺氏菌快速检测构建了一个技术平台。     

三七Y病毒部分ci基因和cp基因的克隆及序列分析

对云南文山地区三七上获得的三七Y病毒(Panax virus Y,PnVY)不同分离物进行了部分ci基因和cp基因的克隆及序列分析,获得的部分ci基因长657 nt,编码219个氨基酸;获得的部分cp基因长834 nt,编码278个氨基酸。所获得的11个PnVY分离物的ci基因之间核苷酸和氨基酸的同源性分别为80.8%~99.8%和91.3%~100%,与其他PnVY分离物的同源性分别为80.8%~98.8%和92.7%~99.5%。所获得的18个PnVY分离物的cp基因核苷酸和氨基酸序列同源性分别为91.8%~99.9%和93.9%~100%,与其他PnVY分离物的同源性分别为92.0%~100%和95.7%~100%。系统进化树分析表明,基于ci基因可以将PnVY分为2个大组,第Ⅱ组分离物之间的差异相比第Ⅰ组的复杂;基于cp基因可以将PnVY分为3个大组,第Ⅲ组分离物之间差异最大。基于ci基因和cp基因的分析结果均表明,PnVY不同种群间存在较为丰富的遗传多样性,但尚不清楚PnVY的分子变异是否与PnVY引起的多种症状类型有关。     

LAMP法在牛早期胚胎性别鉴定中的应用

对LAMP试剂盒的准确性、特异性和灵敏度进行鉴定,同时对11枚体外胚胎和38枚体内胚胎进行性别鉴定。结果表明:血样DNA的鉴定结果与实际性别吻合;LAMP试剂盒的灵敏度很高,且只对牛有特异性;对胚胎样品的鉴定结果与实际性别吻合。