中草药提取液对3种柑橘病原菌的抑制作用

为了对中草药提取物应用于水果保鲜领域和开发新型植物源农药提供理论基础和依据,在中药质量浓度为0.05g/mL条件下,测定19种中草药水提物对3种来自柑橘采后病害的病原菌意大利青霉(Penicillium italicum Wehmer)、指状青霉(Penicillium digitatum Sacc.)和柑橘链格孢(Alternaria citri Ellis et Pierce)的抑菌效果.结果表明:同一种中药对不同病原菌及不同中药对同一病原菌的抑制作用存在差异.19种中草药水提物中,黄连对3种病原菌的综合抑菌率最高,为98.37%,且黄连提取物对意大利青霉,指状青霉,柑橘链格孢的最小抑菌浓度(MIC)分别为:0.2,0.025,0.05g/mL.而白芥子对意大利青霉以及桃仁、茯苓和玄参对指状青霉的生长则具有不同程度的促进作用.     

赣南脐橙致腐菌的分离鉴定及其对2-苯乙醇敏感性分析

从采摘后贮存自然发病的赣南脐橙中分离出4种病原真菌,根据菌株形态学观察和rDNA-ITS序列分析进行鉴定,这4种病原真菌分别为意大利青霉(Penicillium italicum)、指状青霉(Penicillium digitatum)、柑橘链格孢(Alternaria citri)和芽枝状枝孢(Cladosporium cladosporioides)。生物保鲜剂2-苯乙醇(2-PE)可有效地抑制这4种病原真菌的孢子萌发和菌丝生长,但对不同致腐菌抑菌效果差异显著(P0.05)。2-PE对芽枝状枝孢霉、指状青霉菌、柑橘链格孢和意大利青霉菌菌丝生长的最小抑菌浓度分别为1.4、1.8、2.2和2.4 g/L。     

指状青霉草酰乙酸水解酶的结构特征与原核表达分析

利用生物信息学技术手段分析了柑橘绿霉病病原菌指状青霉(Penicillium digitatum)中草酰乙酸水解酶(PdOAH)的二级和三级结构,并利用分子生物学技术对重组的PdOAH进行了原核表达分析和分离纯化。生物信息学分析结果表明PdOAH的建模结构的质量较高,与其它来源的草酰乙酸水解酶的氨基酸序列具有高度的同源性,且在活性中心氨基酸残基高度保守。重组PdOAH蛋白在大肠杆菌中进行原核表达,在16℃、0.2 mmol/L IPTG浓度条件下具有较高的表达量,并且有一定的可溶性。利用亲和层析技术分离纯化方法获得了纯度较高的重组PdOAH蛋白。     

指状青霉草酰乙酸水解酶的结构特征与原核表达分析

利用生物信息学技术手段分析了柑橘绿霉病病原菌指状青霉(Penicillium digitatum)中草酰乙酸水解酶(PdOAH)的二级和三级结构,并利用分子生物学技术对重组的PdOAH进行了原核表达分析和分离纯化.生物信息学分析结果表明PdOAH的建模结构的质量较高,与其它来源的草酰乙酸水解酶的氨基酸序列具有高度的同源性,且在活性中心氨基酸残基高度保守.重组PdOAH蛋白在大肠杆菌中进行原核表达,在16℃、0.2 mmol/L IPTG浓度条件下具有较高的表达量,并且有一定的可溶性.利用亲和层析技术分离纯化方法获得了纯度较高的重组PdOAH蛋白.     

柑橘溃疡病菌胞外蛋白水解酶对其致病力的作用

采用异源表达方法从柑橘黄单胞柑橘亚种(Xcc)中国菌株Xcc 29-1中鉴定出6个编码胞外蛋白水解酶的基因.运用同源重组方法将6个编码基因全部敲除,得到胞外蛋白水解酶缺失突变体,对其致病力、形成生物膜的能力和生长繁殖速度进行检测.结果显示,蛋白水解酶突变体在柑橘上的致病力减弱,并且附着到试管壁的细菌数量显著减少,形成生物膜的能力下降.在野生型菌株中过表达蛋白水解酶后,形成的溃疡病斑水渍状程度加大,在柑橘中的繁殖速度变快;在柑橘叶片中,6个胞外蛋白水解酶基因的转录水平都增强表达.这些结果表明Xcc的胞外蛋白水解酶是一个重要的致病因子.     

柑橘采后主要病原菌的生物学特性研究

研究不同环境因子下柑橘绿霉病(指状青霉)、青霉病(意大利青霉)病原菌的生长生物学特性。分析不同的培养基、不同碳源、不同氮源、不同温度、不同pH值、不同盐度对指状青霉、意大利青霉生长所产生的影响。结果表明:采用PDA、SDA、PSA、YPGA等培养基培养2种青霉时,菌生长直径较大( 40 mm)、菌丝生长浓密、生长速度快;替换CA培养基中的蔗糖,当碳源采用葡萄糖、麦芽糖、乳糖、可溶性淀粉时,菌生长效果较好,菌落直径大于20 mm,菌丝密集度表现浓密或较浓密;酵母粉、蛋白胨、甘氨酸等有机氮对2种青霉病原菌菌丝的生长具有良好的促进作用。2种菌株在4～35℃范围内均可生长,最适生长温度为28～30℃;菌株能生长的pH值为2～12,最适生长的pH值为5～7;高浓度(4%以上)的盐水可以杀灭2种青霉菌;75℃是青霉菌的致死温度。     

植物杀菌剂的筛选

采用牛津杯管碟法用56种植物的丙酮提取物对指状青霉(Penicillium digitatum)和意大利青霉(P.itali-cum)进行抑菌活性测定.通过试验,分别筛选出11和12种对指状青霉和意大利青霉有抑制作用的植物提取液,其中丁香、肉桂、细辛、牡丹、五倍子等5种提取液对指状青霉和意大利青霉都表现出较强的抑制作用,并通过两倍稀释法确定了这5种提取液的最低抑菌浓度(MIC).研究结果为进一步探寻适宜的柑橘天然保鲜剂提供了重要的基础资料.     

碳酸铵和碳酸氢铵对柑橘青霉病的抑制作用

以引起柑橘采后青霉病的意大利青霉(Penicilium italicum)为研究对象,采用体外试验和体内试验测定碳酸铵和碳酸氢铵对病菌的抑菌活性。结果表明:碳酸铵和碳酸氢铵对意大利青霉孢子萌发和菌丝体生长均有显著抑制作用;当碳酸铵和碳酸氢铵的质量分数分别为0.32%和0.36%时,2种铵盐均可以完全抑制意大利青霉的孢子萌发;当2种铵盐溶液分别经过4~100℃范围内的不同温度处理一定时间后,仍能表现出良好的抑菌活性;碳酸铵和碳酸氢铵在中性及偏碱性的环境中有利于抑菌活性的发挥。接种和自然贮藏试验结果表明,质量分数为0.80%的碳酸铵和碳酸氢铵溶液可以显著降低接种意大利青霉的柑橘果实和自然贮藏条件下柑橘果实青霉病的发病率。     

柑橘响应溃疡病菌转录因子CsBZIP40的克隆及功能分析

【目的】分析柑橘BZIP转录因子家族并克隆柑橘溃疡病菌相关的转录因子Cs BZIP40,对其进行亚细胞定位并研究外源激素及机械损伤对该基因的诱导表达,确定其诱导表达模式,分析其与溃疡病菌侵染的关系。【方法】基于全基因组公共数据库,对柑橘BZIP转录因子进行综合专业注释以获得柑橘中BZIP家族的所有成员信息,并根据染色体定位对其进行命名;利用MEME分析其结构域;利用MEGA 6.0分析柑橘BZIP与拟南芥BZIP的系统发育关系,并根据系统发育关系对该基因家族进行分类,确定本研究关注的Cs BZIP40所属的类型;结合染色体定位和系统发育树确定该家族的基因复制情况;利用实时荧光定量PCR(q RT-PCR)方法验证感染溃疡病菌前后由柑橘转录组筛选出的Cs BZIP40表达模式;分析Cs BZIP40、启动子元件(plant CARE)和核定位信号(c NLSmapper),构建GFP融合载体,用洋葱表皮进行亚细胞定位分析,来对预测的核定位信息进行验证;利用q RT-PCR技术分析水杨酸(SA)、茉莉酸甲酯(Me JA)、乙烯利(ET)以及机械损伤(wounding)对该基因的诱导表达模式,揭示该转录因子与激素代谢途径的关系。【结果】从柑橘(甜橙)全基因组数据库中共注释到47个BZIP,这些BZIP基因位于9号染色体之外的所有染色体上,其中3号染色体基因密度最大为4.5×10-7个/Mb,2号染色体上的BZIP基因密度最小,仅占所有BZIP基因的2%;柑橘BZIP基因家族含有较少的基因复制事件,所以相对其他已测序物种其BZIP家族较小;Cs BZIP40基因全长5 756 bp,开放阅读框1 530 bp,编码509个氨基酸;经BZIP家族染色体定位、结构域和系统发育分析结果显示Cs BZIP40基因序列特异性较好,且Cs BZIP40与拟南芥中AT1g08320属于同源基因,属于柑橘10个亚家族中参与病菌防御的D亚类;上游启动子元件含多个与植物逆境或激素应答相关的顺式作用元件,例如Box-W1、HSE、ERE等;此基因含有核定位信号,亚细胞定位表明此蛋白定位于细胞核,具备转录因子发挥作用的前提;外源水杨酸并不会使四季橘和纽荷尔脐橙中Cs BZIP40的表达水平显著上调,纽荷尔脐橙在茉莉酸甲酯诱导后有明显的差异表达,但乙烯利可以使Cs BZIP40在四季橘和纽荷尔脐橙中均有较明显的差异表达;柑橘溃疡病菌侵染可诱导抗病品种四季橘中此基因上调表达,而在感病品种纽荷尔脐橙中,该基因对柑橘溃疡病菌侵染没有响应。【结论】Cs BZIP40是响应溃疡病菌侵染的一个转录因子,该基因可作为柑橘抗溃疡病菌分子育种的一个候选基因来进行进一步功能性验证,具有潜在的分子育种价值。     

猪髓样细胞触发因子1 CDR区的克隆、表达及生物活性

本研究旨在探讨重组猪TREM-1基因CDR区蛋白对猪肺泡巨噬细胞受到脂多糖(LPS)刺激后炎症因子表达状态的改变。首先克隆猪TREM-1基因CDR区,然后构建重组载体并转入BL21(DE3)中,IPTG诱导表达、纯化并复性猪TREM-1基因CDR蛋白。将不同浓度复性的重组蛋白添加到1 000 ng/ml LPS处理的猪肺泡巨噬细胞培养液中,然后通过荧光定量PCR方法分别测定主要促炎症因子(IL-1β、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12、IL-16、IL-18及TNFα)的表达规律。结果显示,重组猪TREM-1CDR区蛋白可显著降低由LPS诱导的主要促炎症因子的表达。表明重组猪TREM-1基因CDR区蛋白具有抑制炎症反应的生物学活性。