二化螟线粒体cox1基因的克隆、序列测定和分子系统学分析

[目的]克隆并分析二化螟线粒体细胞色素c氧化酶亚基I基因（cox1）。[方法]利用PCR方法扩增了二化螟线粒体cox1基因,并测定了其全序列。通过检索GenBank数据库获得了其他21种鳞翅目昆虫的cox1序列,并进行了同源性比较和分子系统学分析。[结果]cox1基因编码框包含1531个核苷酸,编码510个氨基酸的蛋白;起始密码子为CGA,终止密码子仅由一个T组成。利用ML方法构建了基于cox1基因编码氨基酸序列的鳞翅目昆虫的分子系统树,发现分子系统树与从形态学角度的系统分类在大方面上是基本一致的,但也略有差异。[结论]为进一步研究cox1基因的表达和应用奠定了基础。     

基于线粒体DNA全序列11个蛋白编码基因拼接序列的鳞翅目昆虫系统发育研究

目前已测定线粒体DNA全序列的鳞翅目昆虫有12种。由于高变异性和强核苷酸组成偏好性,去除了两个蛋白基因和两个物种,最终以10个鳞翅目物种的11个蛋白编码基因拼接序列对鳞翅目分子系统发育关系进行了研究。与前人的结果一致,基于11个蛋白编码基因拼接序列数据所构的最大似然树支持鳞翅目,鳞翅目内各总科和各科均为单系群。与MINET[1]基于形态学数据的结果相同,各总科的系统发育关系为{卷蛾总科+[螟蛾总科+(尺蛾总科+蚕蛾总科)]}。蚕蛾总科内各科系统发育关系类似于REGIER等[2]的结论。     

锯谷盗线粒体基因组及扁甲总科系统发育分析

【目的】探究锯谷盗Oryzaephilus surinamensis的线粒体基因组结构特征及扁甲总科的系统发育关系。【方法】利用下一代测序方法获得了锯谷盗线粒体基因组的全序列，并基于扁甲总科65个物种(内群)和2个象甲总科物种(外群)的13个蛋白质编码基因、通过最大似然法和邻接法构建扁甲总科的系统发育树。【结果】锯谷盗的线粒体基因组包含37个基因(13个蛋白质编码基因、22个tRNA基因和2个rRNA基因)和一段控制区。整个线粒体基因组全长为15 711 bp(GenBank登录号：OM215199)。锯谷盗线粒体基因组的3个蛋白质编码基因(cox1,nad2和nad1)的起始密码子是ATC或GTG,其余10个蛋白质编码基因都是以ATT或ATG开头；cox1,cox2,nad2,cox3和nad3以不完整的终止密码子T结尾，其余蛋白质编码基因以完整的终止密码子TAA或TAG结尾。除trnS1因缺少DHU臂而形成一个简单的环，无法形成稳定的三叶草结构外，其余tRNA基因均能形成典型的三叶草结构。此外，trnS1的反密码子不是常见的GCU,而是UCU。rrnL基因的全长为1 281 bp,...     

猎蝽科昆虫线粒体基因组的比较研究

线粒体基因组是系统发育常用的分子标记,本研究旨在对猎蝽科昆虫的线粒体基因组进行比较研究,着重分析基因重排、碱基组成、密码子使用偏好性等特征,并构建基于13个蛋白编码基因的系统发育关系。在GenBank数据库下载猎蝽科11亚科30属代表物种的线粒体基因组序列,通过Geneious 8.0.4抽提各编码基因的序列。利用MEGA 7.0统计碱基组成、氨基酸和核苷酸序列信息位点、起始密码子、终止密码子、相对密码子使用频率（RSCU）等序列基本信息。另外,利用DnaSP 6.0计算蛋白编码基因的非同义替换率（K_a）和同义替换率（K_s）,并通过K_a/K_s值比较基因的核苷酸进化速率。通过jModelTest选择进化模型,在MrBayes 3.2.2软件中构建基于贝叶斯法（BI）的系统发育树。结果表明：猎蝽科线粒体基因组均呈共线性结构,没有发现大面积的基因重排现象,只有部分序列中rrnS和trnT基因编码方向与原始序列编码方向相反,trnR和cytb基因出现多拷贝的现象。猎蝽科线粒体最常使用ATN起始密码子和TAA...     

蝎蝽次目线粒体蛋白质编码基因的比较研究

[目的]本研究旨在对蝎蝽次目11科线粒体基因组中13个蛋白质编码基因(PCG)的密码子使用情况、A+T含量、氨基酸序列和核苷酸序列信息位点以及核苷酸进化速率进行比较研究,同时基于13个PCG序列构建蝎蝽次目系统发育树。[方法]通过GenBank获得蝎蝽次目所有14个代表种的PCG序列,统计蝎蝽次目起始密码子和终止密码子的使用频率。在BioEdit 7. 1中计算核苷酸串联序列第一位、第二位、第三位和一二三位密码子A+T含量。在MEGA 6. 0中计算核苷酸串联序列和氨基酸串联序列的保守位点、信息简约位点和自裔位点。用软件DnaSP 6. 0计算蛋白质编码基因每个位点的非同义替代率(Ka)和同义替代率(Ks),由此分析每个基因的核苷酸进化速率Ka/Ks。在RAxML 8. 2. 8和MrBayes 3. 2. 5中分别基于最大似然法和贝叶斯法构建系统发育树。[结果]蝎蝽次目昆虫起始密码子使用中,ATN的使用频率明显高于GTG和TTG。蝎蝽次目使用的4种终止密码子中,TAA和T的使用频率最高。蝎蝽次目每一位密码子的碱基组成含量表明第三位密码子的AT含量最高,远远高于第一位与第二位密码子。在氨基酸和核苷酸序列中,COI的保守位点数最多,ATP8和ND4L的保守位点数最少;ND5的简约信息位点数最多,其次为ND2和ND4。核苷酸进化速率的分析中,ATP8基因的进化速率最快,COI基因进化速率最慢。ML和BI的系统发育结果基本一致,分支关系如下:(划蝽总科+((蟾蝽总科+蝎蝽总科)+(潜蝽总科+(仰泳蝽总科+固蝽总科))))。[结论]本研究补充了蛋白质编码基因在蝎蝽次目比较线粒体基因组学研究中的不足,揭示了蛋白质编码基因在比较线粒体基因组学研究中的重要性。     

鲈形目线粒体DNA蛋白编码基因的适用性分析

[目的]对线粒体DNA 13种蛋白质编码基因的系统进化分析能力进行了评估。[方法]单个基因和基因拼接序列比较,综合考虑序列的信息量和邻位连接法构建系统进化树的置信度。[结果]按分类阶元不同将基因都分成不同的4等。在鲈形目的科间阶元,最好的为ND6和cox2 好的序列为ND5和ND4 ND4L、ND3和ATP8差 包括Cyt b、cox1在内的其余6种基因为中等 在属内种间阶元,最好的为ATP6和cox2 好的序列为ND2和cox1 ND6、ND3和ATP8差 包括Cyt b在内的其余6种基因为中等。另外,分析揭示序列长度的增加可以提高系统进化树的置信度,且属内物种间比较时序列长度的影响小于高级阶元。[结论]线粒体DNA蛋白质编码基因的信息分布具不均一性,需分类阶元选择最佳基因和组合。     

二化螟味觉受体基因鉴定、克隆与表达模式分析

【背景】二化螟(Chilo suppressalis)是我国水稻上的重要害虫之一,味觉受体(gustatory receptor,GR)基因在昆虫取食、产卵等过程中发挥重要作用。【目的】基于组学数据鉴定并克隆二化螟GR基因序列,明确其在不同发育阶段和成虫不同组织中的表达特性,为后续深入研究二化螟GR基因的功能打下基础。【方法】结合二化螟转录组数据和其他昆虫的GR基因序列,通过多重序列比对,鉴定二化螟GR基因。利用RT-PCR方法克隆获得二化螟GR基因的完整开放阅读框(open reading frame,ORF)序列,运用生物信息学分析工具对二化螟GR基因编码的氨基酸序列进行分子生物学特征、结构域等分析;基于最大似然法构建二化螟GR基因蛋白序列与其他昆虫GR基因的系统进化树;利用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)方法分析GR基因在二化螟不同发育阶段(1—6龄幼虫和雌、雄成虫)和成虫不同组织(雌、雄成虫的触角、头、翅、腹、足)中的表达模式。【结果】鉴定并克隆得到5个二化螟GR基因,分别命名为CsupGR1—5,ORF长度为1 122—1 428 bp,编码氨基酸序列长度为373—475...     

小片蝽线粒体基因组及蝽科系统发育分析

为了从线粒体基因组水平探讨小片蝽Sciocoris lateralis在蝽科的分类地位,丰富蝽科线粒体基因组基本数据,为蝽科系统发育进化研究提供一定的理论依据,通过高通量测序,首次测定并分析了小片蝽完整线粒体基因组（Genbank登录号：OP531920）,提取蝽科物种的13个蛋白编码串联序列（PCGs）,使用最大似然法、贝叶斯法构建系统发育树。结果显示,小片蝽昆虫的线粒体全基因组长度为15 445 bp,包括13个蛋白编码基因（Protein-codinggenes,PCGs）、2个rRNA基因（ribosomeRNAs,rRNAs）、22个tRNA基因（transferRNAs,tRNAs）和1个控制区（Control region）。小片蝽线粒体基因组结构排序与其他蝽科物种一致,均无基因重排现象。小片蝽线粒体全序列AT含量为74.26%,GC含量为25.74%。13个蛋白编码基因中,cox1、nad1和nad6的起始密码子为TTG,其余10个蛋白编码基因的起始密码子是ATT、ATA、ATG。在所测得的tRNA基因中,trnS1和trnV缺失DHU臂,其他20个tRNA均能折叠形成...     

基于线粒体COX1基因的蚕蛾类系统发育分析

基于生物信息学的方法,以16种蚕蛾类昆虫作为研究对象,利用线粒体基因COX1的碱基序列作为分子标记对其系统发育信息进行分析。结果表明,COX1基因序列具有明显的AT偏倚性,编码氨基酸的密码子有26个具有明显的使用偏好性,种群间的校正遗传距离在0.003～0.177之间,表明蚕蛾类昆虫的亲缘关系近。利用MEGA6软件,分别采用邻接法（NJ）和最大似然法( ML)构建系统发育树,其发育树的分支明显,大部分的节点支持率都很高,进一步说明了蚕蛾类昆虫的亲缘关系较近。本研究补充了对蚕蛾类传统分类的认识,也为蚕蛾类昆虫的分类提供依据。     

基于线粒体DNA全序列11个蛋白编码基因拼接序列的鳞翅目昆虫系统发育研究*

 目前已测定线粒体DNA全序列的鳞翅目昆虫有12种。由于高变异性和强核苷酸组成偏好性,去除了两个蛋白基因和两个物种,最终以10个鳞翅目物种的11个蛋白编码基因拼接序列对鳞翅目分子系统发育关系进行了研究。与前人的结果一致,基于11个蛋白编码基因拼接序列数据所构的最大似然树支持鳞翅目,鳞翅目内各总科和各科均为单系群。与MINET ^［1］基于形态学数据的结果相同,各总科的系统发育关系为{卷蛾总科＋［螟蛾总科＋（尺蛾总科＋蚕蛾总科）］}。蚕蛾总科内各科系统发育关系类似于REGIER等［2］的结论。     

新Cry1B蛋白基因的筛选与鉴定

[目的]Cry1B类杀虫蛋白对鳞翅目和鞘翅目昆虫具有较好的杀虫活性,具有广阔的应用前景。为进一步挖掘并研究Cry1B类蛋白。[方法]本文使用一对引物对24个Bt菌株进行定性PCR反应,尝试筛选新的cry1B基因。该引物能够扩增包括Cry1B蛋白N-端3个结构域在内的718个氨基酸编码序列。[结果]共有8个菌株包含cry1B基因,约占筛选菌株的33.3%。序列分析发现,获得8个基因中有6个为新基因,其中6-1和15-1基因编码氨基酸序列与Cry1Bd1完全相同;9-1、10-1、18-1、20-1和21-1对应氨基酸序列与Cry1Bd1的一致性≥98.5%;而4-1基因编码的氨基酸序列与Cry1Bb1和Cry1Bc1蛋白N-端仅差1个氨基酸,需要进一步鉴定C-端长尾的编码序列以判断其所属亚类。[结论]本研究获得6种新型Cry1B蛋白基因,为进一步解析这类蛋白的杀虫活性和机理提供了丰富的材料。     

茶六斑褐锦斑蛾Sorita pulchella线粒体基因组特征与系统发育分析

【目的】了解茶六斑褐锦斑蛾(Sorita pulchella)线粒体基因组特征，探究其分类地位，并分析蛾类高级分类阶元的系统发育关系。【方法】野外采集西藏自治区林芝市易贡茶场发生的茶六斑褐锦斑蛾。采用高通量测序的方法获得线粒体基因组序列并分析其基因组结构特征；用最大似然法和贝叶斯法构建系统发育树，探讨鳞翅目斑蛾科昆虫系统发育关系。【结果】茶六斑褐锦斑蛾(GenBank登录号：MZ157403)线粒体基因组序列的总长度为15 216 bp,编码37个基因，即13个蛋白质编码的基因、22个tRNA基因、2个rRNA基因(rrnL和rrnS)和1个A+T富含区。其基因组成与其它已知的鳞翅目昆虫一致。蛋白质编码基因的A+T的含量为77.7%,长度为10 830 bp。tRNA中的A+T的含量则为80.9%。22个tRNA的二级结构仅trnS1缺少二氢尿嘧啶环，其它tRNA的二级结构都为典型的三叶草型。20个种进行了系统发育分析，包括两个外群。贝叶斯系统发育树显示斑蛾科内的系统发生关系为：(Zeuzera multistrigata+Endoxyla cinereus)+(((Apoda lim...     

中华蜜蜂GnRH相关受体的基因克隆及表达研究

[目的]克隆中华蜜蜂(Apis cerana cerana)促性腺激素释放激素(gonadotrophin releasing hormone,GnRH)相关受体基因,对其进行表达研究。[方法]利用RT-PCR技术克隆了中华蜜蜂的GnRH相关受体基因的cDNA序列,并对其进行生物信息学分析和表达产物的原位杂交组织化学研究。[结果]序列分析显示,GnRH相关受体的cDNA序列全长1 177 bp,开放阅读框长1 050 bp,编码349个氨基酸残基。推导的氨基酸序列具有7个跨膜区;预测的分子量和等电点分别为40.6 kD和9.54。聚类分析显示该蛋白质与其他已知昆虫的GnRHRⅡ具有较近的亲缘关系。原位杂交显示GnRH相关受体基因在中华蜜蜂的脑、精巢、脂肪体以及肠道等组织均有表达。[结论]该研究结果表明GnRH相关受体为昆虫提供了生殖和新陈代谢之间的分子纽带,其在协调昆虫的生殖活动和环境状况的关系中执行了一定的功能。     

白边大叶蝉线粒体基因组测序与分析

采用引物步移法测得白边大叶蝉Kolla paulula(Walker)线粒体基因组90%左右的序列,并分析了该叶蝉的线粒体基因组特征。基于23个物种(半翅目)的蛋白编码基因序列,以最大似然法和贝叶斯法构建了头喙亚目系统发育树。已测得序列长度为13 579 bp(AT:73.33%),其中包含了13个蛋白编码基因、21个t RNA基因和1个r RNA基因。除了ND5基因使用GTT作为起始密码子外,其他所有蛋白编码基因均使用ATN作为起始密码子;除了CO II使用不完整的T作为终止密码子,其他所有蛋白编码基因均使用TAA或TAG作为终止密码子。21个t RNA基因中,除了t RNASer(AGN)缺失1个稳定的茎环结构外,其他所有t RNA基因均能形成典型的三叶草二级结构。系统发育分析结果表明,进化树明显可以被分为沫蝉总科+(角蝉总科+蜡蝉总科);白边大叶蝉属于角蝉总科的叶蝉科,白边大叶蝉线粒体基因组特征与其他叶蝉科昆虫相同。     

球毛壳菌cox5基因克隆及特性分析

利用BlastX将球毛壳菌(Chaetomium globosum)ESTs序列与GenBank的Nr数据库进行相似性搜索,获得含有细胞色素c氧化酶亚基5基因(cox5)全长cDNA序列的EST(BP099084),以此设计引物。以球毛壳菌总RNA反转录产物为模板进行PCR扩增,获得球毛壳菌cox5的cDNA序列。cDNA全长685bp,编码169个氨基酸的多肽,蛋白质分子量18.3KD。蛋白质家族预测其属于cox4家族。球毛壳菌cox5是具有导肽的跨线粒体内膜的蛋白质。BlastP相似性分析表明cox5氨基酸序列保守性不高,与其相似性最高的是柄孢霉的cox5(Podospora anserina,CAB76570),相似性为75%。cox5基因的cDNA序列及推测的氨基酸序列在GenBank上登录(登录号分别为DQ082750、AAY85812)。     

中华蜜蜂嗅觉受体基因AcerOR141的克隆与表达分析

[目的]克隆鉴定中华蜜蜂Apis cerana cerana嗅觉受体基因AcerOR141,并对其全长序列和表达谱进行分析,为该基因的功能研究奠定基础。[方法]利用PCR扩增和基因克隆技术获得中华蜜蜂嗅觉受体基因AcerOR141的cDNA全长序列;利用多种生物信息学软件对该基因编码的氨基酸序列进行结构预测、序列比对和进化树分析;利用qRT-PCR技术检测该基因在1、5、10、15、20、25和30日龄工蜂各组织中的表达情况。[结果]AcerOR141 cDNA全长为1 659 bp,ORF序列长度为1 299 bp,编码432个氨基酸,有7个跨膜结构且N端位于胞内,无信号肽,第184～421位氨基酸之间存在一个昆虫嗅觉受体7tm-6 superfamily的保守结构域。序列比对和进化树分析表明,AcerOR141与西方蜜蜂AmelOR141的亲缘关系最近,氨基酸序列一致性高达91%。荧光定量PCR结果显示,AcerOR141 mRNA在工蜂触角和头部的表达较高,且极显著高于其他组织(P0.01);在胸、腹、足和翅膀中仅有微量的表达。[结论]克隆获得AcerOR141的全长cDNA序列,其编码产物具有昆虫嗅觉受体的典型结构特征;明确了该基因在中华蜜蜂成蜂触角和头部中有较高的表达,推测其表达产物为普通嗅觉受体蛋白,可能参与挥发性气味分子的识别过程。     

三化螟蜕皮激素受体和超气门蛋白基因的克隆和序列分析

利用RACE技术,根据已有的三化螟转录组数据,设计特异引物对三化螟的蜕皮激素受体(EcR)和超气门蛋白(USP)基因进行克隆,获得了三化螟EcR和USP基因的全长序列。EcR基因全长2857bp,氨基酸序列包括545个氨基酸。USP基因全长共2082bp,氨基酸序列包括408个氨基酸。序列比对后发现,三化螟EcR和USP基因的氨基酸序列与已报道的鳞翅目昆虫EcR和USP基因的氨基酸序列具有很高的同源性,其中与二化螟的相似性分别达到94%和97%。序列分析表明,三化螟EcR和USP序列具有昆虫EcR和USP基因的特征结构:DNA结合域和2个锌指结构。     

野桑蚕中肠组织cDNA文库的构建及丝氨酸蛋白酶基因片段的克隆与序列分析

[目的]构建野桑蚕中肠组织cDNA文库并分离其丝氨酸蛋白酶基因。[方法]利用TaKaRa公司生产的cDNA Library Construction Kit构建了野桑蚕中肠组织的cDNA文库,并采用测序法克隆分析丝氨酸蛋白酶基因cDNA。[结果]经鉴定,文库的滴度达6.2×105pfu/ml,文库插入片段的平均大小为1.2 kb左右。从文库的测序结果中获得了野桑蚕丝氨酸蛋白酶基因片段(登录号:EU672968),序列分析结果显示:该基因片段由854个核苷酸组成,编码284个氨基酸残基。通过对该基因片段编码的氨基酸和其他10种昆虫的丝氨酸蛋白酶基因编码的氨基酸的同源性分析,发现该氨基酸序列与其他丝氨酸蛋白酶具有一定的同源性。[结论]该基因的发现对于研究家蚕和野桑蚕对外来入侵物的抗性具有重要意义。     

2种果蝇(Drosophila melanogaster与D.sechellia)线粒体及NADH dehydrogenase subunit基因的密码子偏好性分析

[目的]分析2种果蝇(Drosophila melanogaster与D.sechellia)线粒体基因组及NADH dehydrogenase subunit基因的密码子偏好性。[方法]利用Codon W1.4计算密码子偏好性参数的相关参数。[结果]2种果蝇线粒体中蛋白编码基因的AT含量比GC含量更高。D.sechellia的线粒体基因组的密码子偏好性比黑腹果蝇D.melanogastera的线粒体基因组的密码子偏好性略强。2种果蝇线粒体基因组中各蛋白编码基因CDs中,RSCU值大于1的密码子都是以A或U结尾,而并不以C或G结尾。2种果蝇线粒体基因组及NADH dehydrogenase subunit基因簇基因的密码子偏好性都可能受到突变压力影响。D.melanogaster线粒体基因组中不存在密码子CGC。NADH dehydrogenase subunit 3基因的密码子偏好性可能比其他NADH dehydrogenase subunit基因更高。此外,尽管大部分NADH dehydrogenase subunit基因偏爱使用A或U结尾的密码子,但是在NADH dehydrogenase subunit 6基因中,有2个AU结尾的密码子(AGA、GCA)的RSCU也为0。[结论]该研究结果为2种果蝇线粒体的进化研究提供了新观点。     

中华蜜蜂GnRH相关受体的基因克隆及表达研究(英文)

[目的]克隆中华蜜蜂(Apis cerana cerana)促性腺激素释放激素(gonadotrophin releasing hormone,GnRH)相关受体基因,对其进行表达研究。[方法]利用RT-PCR技术克隆了中华蜜蜂的GnRH相关受体基因的cDNA序列,并对其进行生物信息学分析和表达产物的原位杂交组织化学研究。[结果]序列分析显示,GnRH相关受体的cDNA序列全长1177bp,开放阅读框长1050bp,编码349个氨基酸残基。推导的氨基酸序列具有7个跨膜区;预测的分子量和等电点分别为40.6kD和9.54。聚类分析显示该蛋白质与其他已知昆虫的GnRHRⅡ具有较近的亲缘关系。原位杂交显示GnRH相关受体基因在中华蜜蜂的脑、精巢、脂肪体以及肠道等组织均有表达。[结论]该研究结果表明GnRH相关受体为昆虫提供了生殖和新陈代谢之间的分子纽带,其在协调昆虫的生殖活动和环境状况的关系中执行了一定的功能。