青花菜病程相关蛋白基因BoPR1的克隆与表达分析

病程相关蛋白(Pathogenesis-related protein,PR)是参与植物抗病性的重要物质,在诱导系统抗性过程中起着重要作用。本研究以青花菜为材料,在克隆BoPR1基因的基础上,利用荧光定量PCR技术研究它们在根肿菌和核盘菌侵染下的表达模式。序列分析结果表明,BoPR1基因组全长为489bp,无内含子,编码162个氨基酸,具1个信号肽和1个SCP结构域。系统发育分析的结果表明,BoPR1与甘蓝型油菜和白菜的PR1遗传距离最小,亲缘关系最近,在进化树上聚为一组;与醉蝶花PR1遗传距离最大,亲缘关系最远。荧光定量PCR结果显示,BoPR1基因的表达受根肿菌诱导,在接种5d时的表达量最高,为对照的11.84倍;BoPR1基因的表达则不受核盘菌诱导。     

青花菜BoBURP2基因的克隆与表达分析

BURP是植物特有蛋白,在生长发育和抗逆反应中起着重要作用。本研究以青花菜为材料,利用PCR克隆到1个BURP基因,命名为BoBURP2。测序结果表明,BoBURP2的基因组DNA全长为1 218bp,具1个内含子,编码区全长为840bp,编码279个氨基酸;序列比对结果表明,该基因与BURP家族成员RD22具有较高的同源性。系统发育分析结果表明,BoBURP2与甘蓝、芜菁和甘蓝型油菜的同源序列相似性最高,在发育树上聚为一组,与醉蝶花的相似性最低,亲缘关系最远。RT-PCR结果表明,BoBURP2的表达受NaCl和干旱胁迫的诱导,表达量分别在24h和48h时达到最大值,暗示该基因与这2种逆境响应相关。青花菜BoBURP2的克隆与表达分析,为后续基因功能的鉴定和抗逆分子育种奠定了基础。     

青花菜CC-NBS-LRR抗病基因BoCNL1的克隆与分析

根据已知序列设计PCR引物,从青花菜中克隆1个NBS-LRR(核苷酸结合位点-富含亮氨酸重复)抗病基因BoCNL1;在生物信息学分析的基础上,利用RT-PCR研究该基因在不同器官中的表达模式。测序结果表明,BoCNL1基因的编码区全长为2 550 bp,编码849个氨基酸;编码蛋白具CC(卷曲螺旋)、NBS和LRR结构域;进化分析结果表明,BoCNL1与不结球白菜的关系最近,在进化树上处于同一分支,与醉蝶花的关系最远;RT-PCR结果表明,BoCNL1在根、花茎、叶、花蕾、开放的花和嫩角果中均有表达,但表达量低。     

青花菜转录因子基因BoWRKY3的克隆与表达分析

以青花菜为材料,从叶片中分离WRKY转录因子基因BoWRKY3(登录号:JN120758),并进行序列分析;利用逆转录聚合酶链式反应(RT‐PCR)对霜霉菌侵染前后叶片BoWRKY3的表达模式进行分析.测序结果表明:BoWRKY3的基因组DNA全长为1136bp,有3个内含子,长度分别为81、101和96bp;编码区全长为858bp,编码285个氨基酸,具WRKYGQK保守区和CX5CX23HX1H锌指结构.RT‐PCR结果表明,BoWRKY3的表达受霜霉菌诱导,表达量在接种6~36h时最高,暗示该基因与青花菜霜霉病抗性相关.序列比对结果表明,BoWRKY3与十字花科同源基因的差异最小,而与禾本科作物的序列差异最大,关系最远.     

青花菜钙依赖蛋白激酶基因BoCDPK1的克隆与表达

钙依赖蛋白激酶(calcium-dependent protein kinase,CDPK)为Ca²⁺传感蛋白,在植物生长发育和逆境响应中起着重要作用。在克隆青花菜BoCDPK1基因的基础上,开展序列分析、系统发育分析和表达分析,为后续的基因功能鉴定和抗逆育种奠定基础。该研究以青花菜为材料,利用PCR法克隆1个CDPK 基因,利用生物信息学对序列进行分析,并采用qRT-PCR研究该基因在霜霉菌和核盘菌侵染下的表达模式。测序结果表明,BoCDPK1的基因组DNA全长为2 414 bp,具6个内含子,编码区全长为1 647 bp,编码548个氨基酸;BoCDPK1有1个S_TKc和4个EF手性结构域。多序列比对结果表明,BoCDPK1与芸薹属植物同源序列的相似性最高,仅个别氨基酸残基存在差异,它们在系统发育树上聚于一组。qRT-PCR结果表明,BoCDPK1的表达受霜霉菌和核盘菌的诱导,表达量均呈现先上升后下降的规律。在霜霉菌的诱导下,BoCDPK1的表达量在72 h达最大值,为对照的3.4倍;而在核盘菌侵染下,BoCDPK1的表达量在36 h达最大值。该研究明确了青花菜BoCDPK1基因的序列特点、系统发育关系和表达特征。     

金银花黄酮合成酶LjFNS基因克隆及序列分析

采用染色体步移的方法,首次从金银花中克隆得到LjFNS的基因组全长序列,并根据基因特异性引物克隆得到LjFNS的编码序列(coding sequence,简称CDS)。LjFNS基因全长为1 701 bp,有2个内含子和3个外显子。编码序列长1 593 bp,编码530个氨基酸。序列同源性分析表明,金银花LjFNS基因编码的CDS序列与拟南芥LOC9307309基因CDS序列相似度达89%。生物信息学分析结果显示,LjFNS基因编码蛋白中含有亚铁血红素配合基结合位点,属于细胞色素P450家族,蛋白含有跨膜结构域。LjFNS基因表达实时荧光定量PCR(q PCR)分析结果显示,LjFNS在金银花中的表达具有组织特异性与时间特异性,在白花中的表达量最高,表明该基因的表达可能与花的发育紧密相关。     

泥鳅和大鳞副泥鳅细胞色素P450c17-Ⅰ(CYP17-Ⅰ)基因的克隆及组织表达分析

采用3'-和5'-RACE法克隆了泥鳅和大鳞副泥鳅CYP17-Ⅰ基因的c DNA全长序列,通过实时荧光定量PCR技术分析其表达情况。结果表明,泥鳅CYP17-Ⅰ基因c DNA全长1 706 bp,开放阅读框(open reading frame,ORF)1 563 bp,编码520个氨基酸;大鳞副泥鳅CYP17-Ⅰ基因c DNA全长1 763 bp,ORF长1 545 bp,编码514个氨基酸。2种鳅CYP17-Ⅰ氨基酸序列都有1个信号肽、1个跨膜区、1个保守的蛋白结构域和3个功能保守区。相似度分析显示,2种鳅之间CYP17-Ⅰ相似度为99%,与其他鱼类的相似度也超过70%。系统进化分析显示,2种鳅之间关系最为接近,其系统发育关系基本符合传统的分类地位。qRT-PCR结果显示,CYP17-Ⅰ在2种鳅的肠、肌肉、心脏、胃、肝脏、精巢、卵巢、脾脏等8个组织均有表达,在精巢和卵巢中表达量相对较高。     

小麦转录因子基因TabZIP20的克隆及其在小麦-条锈菌互作中的表达

bZIP转录因子已经在多种植物中被报道广泛参与抗病,但是对于bZIP转录因子在小麦与条锈菌互作过程中的抗病机制的研究很少。因此,通过电子克隆及RT PCR方法从条锈诱导的小麦水源11中克隆得到一个具有1 005 bp完整ORF,编码334个氨基酸,且具有bZIP保守结构域的小麦TabZIP转录因子基因。将该基因和拟南芥的基因组比对发现其和 AtbZIP20相似度最高,故命名该基因为TabZIP20。通过转化洋葱表皮细胞发现该基因编码的蛋白定位于细胞核;利用实时定量PCR分析了该基因在小麦与条锈菌亲和与非亲和组合中的表达情况,结果表明该基因在小麦对条锈菌的抗病反应中受条锈菌诱导表达。可见,TabZIP20参与小麦对条锈病的抗病反应,但具体作用机制仍待研究。     

菜粉蝶HSP20基因的克隆及温度胁迫下表达分析

[目的]克隆分析菜粉蝶(Pieris rapae)热激蛋白20基因(HSP20),并检测其在温度胁迫下的表达情况,为探析菜粉蝶适应温度胁迫机制提供参考.[方法]以菜粉蝶为试验材料,采用RT-PCR和RACE克隆获得菜粉蝶HSP20基因cDNA全长,并通过生物学软件分析其序列,明确其基因结构特征和亲缘关系;采用实时荧光定量PCR检测菜粉蝶HSP20基因在低温(-20~0℃)和高温(5~45℃)胁迫下的表达响应.[结果]菜粉蝶HSP20基因全长725 bp,5'-端非编码区105 bp,3'-端非编码区109 bp,开放阅读框531 bp,编码176个氨基酸,预测蛋白分子量19.5 kD,理论等电点6.61;其编码氨基酸序列中含有1个典型的HSP20家族结构域(位于第60~142位氨基酸)、1个α-晶体蛋白(位于第60~157位氨基酸)和1个Allato allatostatin(位于第14~24位氨基酸);基序列相似度分析其与二化螟、家蚕和甘蓝夜蛾HSP20蛋白氨基酸相似度较高并聚为一族.该基因随环境温度的升高或降低发生变化,在-5和40℃诱发该基因高效表达.[结论]低温和高温均能诱导菜粉蝶HSP20基因高效表达.     

小麦PR5Ks蛋白家族鉴定与分析

类PR5受体蛋白激酶（PR5 receptor-like protein kinase,PR5Ks）包含病程相关蛋白5(PR5)和激酶结构域,为植物类受体蛋白激酶（Receptor-like protein kinase,RLK）家族的1个亚族,与植物的抗病防御反应相关。本研究从小麦基因组中鉴定了17个PR5Ks基因,对其理化性质、基因结构、保守基序和启动子进行分析。结果表明,17个PR5Ks蛋白家族成员均为疏水性蛋白,氨基酸数目在415～663个,分子量在44.60～73.52 kD,等电点介于5.61～8.4,蛋白结构以无规则卷曲和α螺旋为主。顺式作用元件分析显示,在小麦PR5Ks基因转录起始位点上游2 000 bp序列中存在多种响应元件,包括SA、MeJA、厌氧诱导、低温等响应元件。为了明确17个小麦PR5Ks成员是否具有抗病性,对小麦在赤霉菌（Fusarium graminearum）和条锈菌（Puccinia striiformisf. sp.tritici）侵染过程中PR5Ks基因的表达规律进行分析,发现TaPR5K-3、TaPR5K-5、TaPR5K-9和TaPR5K-11受赤霉菌和条锈菌的共同诱导。利用实时荧光定量PCR(Quantitative real-time PCR,qPCR)技术检测了接种叶锈菌的小麦中基因的表达模式,结果显示,TaPR5K-3、TaPR5K-5、TaPR5K-9和TaPR5K-11这4个基因均受叶锈菌诱导且在抗病植株中高表达,表明他们在小麦与叶锈菌的互作中发挥正向调控作用。综上所述,本研究初步筛选到4个与小麦抗病相关的PR5Ks基因,为进一步揭示PR5Ks蛋白家族参与小麦生长发育及抗病防御反应提供参考。     

叶锈菌与‘TcLr19’小麦互作体系中PR1基因的克隆及分析

利用RT-PCR和cDNA末端快速扩增技术(RACE),从被小麦叶锈菌诱导的抗叶锈病近等基因系材料TcLr19中获得1个病程相关蛋白1(Pathogenesis-related proteins 1,PR1)基因,暂命名为TcLr19PR1。该基因长度为810bp,包含495bp ORF区,编码164个氨基酸,基因产物具有植物防御体系中病程相关蛋白SCP保守结构域,与多个植物病程相关蛋白1基因具有较高同源性。利用半定量分析表明,TcLr19PR1基因受叶锈菌诱导后表达量变化明显,非亲和组合表达高于亲和组合。Southern杂交验证说明TcLr19PR1在小麦基因组中为低拷贝。利用‘中国春’缺体-四体系成功将该基因定位在小麦7D染色体上,为进一步明确叶锈菌与‘TcLr19’小麦互作体系中病程相关蛋白1基因的抗叶锈相关性奠定了基础。     

青花菜P450CYP79F1全长克隆、表达及其与不同器官中莱菔硫烷含量的相关性分析

【目的】克隆青花菜细胞色素家族P450CYP79F1,分析其序列特征,阐明其在不同发育时期器官中的表达情况及其与莱菔硫烷含量的关系,为进一步揭示莱菔硫烷合成机理提供科学依据,为青花菜品种改良和新品种选育奠定基础。【方法】通过5′和3ˊ端RACE克隆技术获得青花菜CYP79F1全长序列,利用DNAMAN 6.0进行基因拼接、氨基酸序列分析和蛋白二级结构预测,结合在线分析程序和软件进行基因和编码蛋白生物信息学分析;利用荧光定量PCR技术研究CYP79F1在不同发育器官中的表达情况;结合HPLC方法测定各相应时期器官中莱菔硫烷含量,包括青花菜发育时期的根、茎、叶,成熟花球,抽薹期花蕾（顶端蕾、成熟蕾、开花前1 d的蕾和花）和种子;对CYP79F1表达量与和莱菔硫烷含量进行相关性分析。【结果】获得了CYP79F1全长序列,GenBank登录号为MG012890,该基因全长2 014 bp,包含一个1 620 bp的开放读码框（ORF）,编码540个氨基酸;编码的蛋白与甘蓝、白菜、芥蓝和油菜等同源蛋白的相似性均在95%以上;生物信息学分析表明该基因编码的酶蛋白有2个信号肽和2个跨膜结构域,为亲水性稳定蛋白,Wolf Psort预测其亚细胞定位于细胞质中;CYP79F1在根和茎中的表达量较高,叶中表达量最低,在花器官发育时期,自顶端蕾到花发育过程中呈现逐渐降低的表达趋势,种子中该基因表达量与花处于同一水平。Pearson相关性分析显示,青花菜发育时期的根、茎、叶、成熟花球、抽薹期花蕾和种子中莱菔硫烷含量与CYP79F1表达量无显著相关关系,但抽薹期花蕾自顶端花蕾到花中莱菔硫烷生成量与CYP79F1表达量呈显著正相关关系（R=0.96,P<0.05）,CYP79F1在调控莱菔硫烷的生成方面起重要作用,尤其是在生殖器官花蕾的发育过程中,能够显著上调莱菔硫烷的生成量。【结论】CYP79F1在青花菜不同发育器官中对莱菔硫烷的生成发挥着重要调控作用,可能与青花菜不同器官中莱菔硫烷含量多样性密切相关。     

羽衣甘蓝BoRACK1基因克隆、亚细胞定位及表达分析

[目的]克隆羽衣甘蓝蛋白激酶C1受体(RACK1)基因(BoRACK1)序列,并对其进行亚细胞定位及表达分析,为研究RACK1基因在植物生长发育过程中的调控机制提供理论参考.[方法]PCR扩增BoRACK1基因,构建其亚细胞定位表达载体,通过基因枪法转化洋葱表皮细胞后在激光共聚焦显微镜下观察绿色荧光蛋白(GEP)的分布情况.利用荧光定量PCR(qRT-PCR)检测BoRACK1基因在不同组织中及在非生物胁迫(200 mmol/L NaCl、100 μmol/L ABA和1 mmol/L H2O2溶液)下幼苗中的表达情况.[结果]PCR扩增获得BoRACK1基因的开放阅读框(ORF)序列,其cDNA全长980 bp,编码326个氨基酸,氨基酸序列与其他植物的RACK1具有较高同源性,在65%以上,尤其与拟南芥的同源性高达93%.BoRACK1基因在羽衣甘蓝的根、茎、叶、花和种子中均有表达,其中在根、叶和种子中的表达量较高,而在花、幼芽和茎的表达量较少.BoRACK1基因在ABA、H2O2和NaCl胁迫下的表达量整体上呈下调趋势,其中NaCl胁迫下其表达量在6 h时降至最低,而其他胁迫下其表达量均在4 h时降至最低.BoRACK1定位于细胞质、细胞核和细胞质膜.[结论]BoRACK1基因表达无组织特异性,除了与羽衣甘蓝花、果实及营养器官的发育存在关联外,还可能参与了植物的抗逆性调控过程.     

根肿病菌核糖体基因ITS区段的克隆测序及其在检测中的应用

 应用真菌核糖体基因ITS区段通用引物ITS1和ITS4,对十字花科蔬菜根肿病菌（Plasmodiophora brassicae）rDNA进行PCR扩增,并将扩增到的目的片段克隆到pGEM-T载体上。对重组克隆进行测序和碱基编码结构特点分析,结果表明:十字花科蔬菜根肿病菌ITS1区长141 bp,5.8 S区长160 bp,ITS2区长187 bp,rDNA总长为488 bp. 根据此序列设计一对根肿病菌特异性寡聚核苷酸引物（前引物:5’AGG TGA ACC TGC GGA AGG AT 3’和后引物:5’TTC AGC GGG TAA TCC TAC CT 3’）,应用聚合酶链式反应（polymerase chain reaction, PCR）技术,对分离自十字花科蔬菜（白菜、青菜、甘蓝、芥蓝、花椰菜等）根肿病菌全基因组DNA进行特异性扩增试验。试验结果表明,该对引物能从十字花科根肿病菌全基因组DNA中扩增到约500 bp长度的分子片段,而对照菌株和健康对照则无扩增产物。该实验结果对有效追踪根肿病菌在田间的发生动态监测和预测预报提供了重要的信息和手段。     

不结球白菜S位点受体激酶基因片段的克隆与表达分析

以不结球白菜自交不亲和系03的基因组DNA和柱头cDNA为模板,利用引物SRKF/SRKR扩增获得长度为964 bp和646 bp的SRK基因片段。序列比较分析表明,克隆的基因片段属于SRK基因的激酶域,该序列包含4个外显子和3个内含子,编码215个氨基酸,与芜菁、甘蓝、芥蓝等SRK基因有90%以上的相似性。荧光定量PCR分析结果表明:自交不亲和系03和自交亲和系105不同组织中SRK基因的表达水平存在显著的差异,SRK基因主要在自交不亲和系的柱头中高度表达,自交亲和系中该基因的表达主要分布于叶片、花蕾和柱头组织中。     

芸薹属物种（B. napus,B. oleracea,B. rapa） MAPK1家族的克隆、进化和表达特征

【目的】克隆甘蓝型油菜、甘蓝和白菜MAPK1家族,分析3个物种MAPK1转录表达器官特异性。【方法】在电子克隆的基础上,利用RACE（rapid amplification of cDNA ends）技术获得3个物种MAPK1全长cDNA序列和gDNA序列。利用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）分析3个物种MAPK1家族的器官特异性表达特征。【结果】从甘蓝型油菜、甘蓝和白菜中克隆了MAPK1家族共4个成员基因BnMAPK1-1、BnMAPK1-2、BoMAPK1和BrMAPK1,它们的gDNA长度为2 512—2 525 bp,均有3个外显子和2个内含子,最长标准mRNA为1 599—1 620 bp,ORF均为1 100 bp。系统进化分析表明,甘蓝型油菜MAPK1家族来自于甘蓝和白菜MAPK1之和,其中,BnMAPK1-1对应于BoMAPK1,BnMAPK1-2则对应于BrMAPK1。qRT-PCR结果显示3个物种MAPK1在所有检测器官中均有表达,但器官特异性在种间差异显著,暗示快速进化。【结论】克隆了甘蓝型油菜、甘蓝和白菜MAPK1的全长cDNA序列和gDNA序列,支持甘蓝和白菜通过天然种间杂交形成异源四倍体物种甘蓝型油菜的假说,芸薹属MAPK1基因和蛋白在序列和结构上非常保守,但转录表达的器官特异性上进化极快,近缘种间差异显著。