植物分子抗病机制研究进展

<正>自19世纪40年代末基因对基因假说的诞生就标志着分子生物学手段在植物抗病性研究中奠定了基础。植物抗病基因反映了植物对特体病原体的识别以及植物能否启动防卫反应的能力,抗病基因编码的产物决定了植物是否能识别特异性的病原菌,同时也在对植物防卫反应基因表达有着直接或间接的影响。植物中存在着抗侵染、抗扩展、预成抗性、诱导抗性、结构抗性、生化抗性、过敏性坏死反应和系统获得性抗性等。在1992年第一个抗病     

植物的诱导抗病性研究进展

诱导抗病性就是利用物理的、化学的以及生物的方法预先处理植株,改变植物对病害的反应,使原来感病反应产生局部或系统的抗性。在此,着重从植株诱导处理后发生的一系列生理变化、植物体内多种抗病防卫反应间的相互关系等方面对植物诱导抗病性作了概括性介绍。许多研究表明,植株经诱导物诱导后,体内产生PR蛋白,其过氧化物酶、多酚氧化酶、苯丙氨酸解氨酶、几丁酶活性都大大增加,侵染点周围迅速木质化;在植物的诱导抗病进程中有两套基因先后起作用,即抗病基因和防卫反应基因,抗病基因产物与病菌无毒基因产物有识别作用,从而诱导防卫反应基因表达。     

柑橘溃疡病相关基因CsPGIP的克隆与表达

【目的】克隆CsPGIP并分析其表达特性,转化柑橘得到超表达转基因株系,并进行柑橘溃疡病抗性评价,为柑橘溃疡病分子育种提供理论依据。【方法】从晚锦橙和四季橘中克隆柑橘CsPGIP,使用MEGA6进行多序列比对并构建系统发育树;采用在线软件BaCelLo和SignalP 4.0进行亚细胞定位和信号肽预测并用GFP瞬时表达确定CsPGIP在细胞内的定位;利用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）比较接种溃疡病菌前后高感品种和高抗品种中柑橘CsPGIP的表达特性,分析溃疡病菌侵染与CsPGIP表达的相关性;农杆菌介导遗传转化晚锦橙,采用GUS染色初筛、PCR鉴定和qRT-PCR相结合的方法鉴定超表达转基因株系;观察转基因和野生型株系表型变化,分析其株高、叶片表型;离体针刺法对超表达转基因株系和野生型株系进行柑橘溃疡病抗性评价,统计病斑面积和病情指数,分析CsPGIP表达对柑橘抗、感溃疡病的影响。【结果】晚锦橙和四季橘CsPGIP均编码328个氨基酸,与已报道的柑橘中的PGIP同源性高达99.39%,都包含2个PGIP基因典型的LRR结构域（LRR_1和LRR_2）;构建系统进化树发现甜橙中的CsPGIP与葡萄中的PGIP（GSVIVT01033370001）遗传距离最近,相似度达到62.97%,推测CsPGIP与葡萄中的PGIP具有类似的抗病效果。亚细胞定位和信号肽预测结果表明CsPGIP属于分泌蛋白,GFP洋葱瞬时表达证明柑橘CsPGIP定位在细胞膜和细胞壁,与预测结果一致。高感品种晚锦橙和高抗品种四季橘接种溃疡病菌后CsPGIP的表达特性不同,在高感品种中表达显著下调,而高抗品种中表达显著上调且维持在较高水平,推测CsPGIP与柑橘溃疡病的抗性相关。构建CsPGIP超表达载体并转化晚锦橙,通过PCR鉴定和qRT-PCR确定其中9个（OE1、OE3、OE4、OE5、OE6、OE9、OE10、OE12和OE14）为CsPGIP超表达阳性株系。通过对转基因株系的表型观察发现OE3、OE14株系表型与野生型株系相比差异明显,植株表现为较矮小,其中OE14出现叶片卷曲、增厚的表型变化。对CsPGIP超表达转基因株系（8个株系）进行离体抗溃疡病评价,结果显示超表达转基因株系可以使柑橘溃疡病病斑面积降至野生型的24.11%—83.88%,其中OE1株系的病斑面积最小;从病情指数来看,除OE3株系外,其余株系的病情指数均比野生型显著下降（为野生型的23.12%—75.49%）,其中OE1下降最显著,综上结果可知超表达CsPGIP可以有效抑制柑橘溃疡病菌的生长。【结论】CsPGIP是柑橘响应溃疡病菌侵染的重要基因,可抑制或减轻柑橘溃疡病的发病程度,在柑橘抗溃疡病机理研究方面具有较大的应用价值,也可作为柑橘抗溃疡病分子育种的一个候选基因。     

不同抗性柑橘对野生型和柑橘链格孢毒素合成受阻褐斑病菌侵染的转录响应差异

为探讨不同抗性柑橘在与褐斑病菌互作过程中对柑橘链格孢毒素的响应差异，以抗病品种克里曼丁（Citrus clementina Hort. ex Tan. cv. Clementine）和感病品种丹西红橘（Citrus reticulata Blanco cv. Dancy）为材料，分别接种野生型产毒菌株Z7和毒素合成基因ACTT6双敲除突变体菌株ΔΔACTT6，并利用转录组测序技术对接种24 h和48 h后的叶片进行基因表达分析。比较2种柑橘对产毒和不产毒菌株侵染后的转录差异发现，2个品种的先天免疫通路（病原物相关分子模式触发的免疫反应和效应子触发的免疫反应）、病程相关蛋白、WRKY转录因子、次生代谢途径等基因均受产毒菌株诱导表达。在接种后期（48 h），产毒菌株主要激活感病品种的脂质和蛋白质等大分子降解过程，说明其细胞完整性因毒素产生而遭到破坏；而抗病柑橘则主要富集解毒和茉莉酸代谢等生物过程，其中特异激活的多药及毒素化合物外排蛋白（multidrug and toxic compound extrusion protein, MATE）基因与其抵御褐斑病菌毒素的能力有关。本研究初步明确...     

csi-miR399响应柑橘溃疡病菌侵染的表达模式及其抗病性分析

【目的】明确csi-miR399响应柑橘溃疡病菌（Xanthomonas citri subsp. citri,Xcc）侵染的表达模式，筛选其靶基因，进而分析csi-miR399与寄主Xcc抗性的相关性，为柑橘溃疡病抗性种质的创制打下基础。【方法】分别以柑橘溃疡病抗性品种四季橘（Citrus microcarpa）和感病品种纽荷尔脐橙（Citrus sinensis）为试材，通过茎环qPCR方法分析csi-miR399在叶片离体注射Xcc 1、3和5 d时的表达量变化，明确抗/感品种中csi-miR399响应Xcc侵染的表达模式；利用在线软件psRNATarget预测csi-miR399的靶基因，并通过qPCR分析候选靶基因在接种Xcc柑橘叶片和瞬时表达csi-miR399叶片中表达量的变化；克隆csi-miR399前体基因序列，通过同源重组方法构建病毒表达载体pCLBV202-MIR399，根癌农杆菌介导的真空浸润法接种尤力克柠檬（Citrus limon），通过qPCR分析csi-miR399表达量；进而采用离体叶片针刺法接种Xcc，观察发病症状，统计病情指数，分析csi-miR3...     

植物病害中的信号传导

植物由抗病基因介导的防卫过程存在一系列生理生化和分子生物学反应,这些反应从病原菌侵染点开始的超敏反应(HypersensitiveResponse,HR),并延伸到远处组织的系统抗性或获得性抗性(SystemicAcquiredResistance,SAR),受制于一种信号传导网络的调控。这个信号系统有抗病蛋白和病原菌非病毒性蛋白,在一种配体—受体的互作模式下激发,并由信号分子H2O2、NO和系统信号分子水杨酸(SA)、茉莉酸(JA)和乙烯(ET),通过关键调控基因传递和放大,最终诱导一系列防卫反应基因的表达和代谢的变化而产生抗性。植物防卫信号的产生类似于动物免疫系统因子的介导,并可由非寄主病原菌或诱导子诱发。这些信号途径所产生的广谱抗性为植物抗病基因工程的应用奠定了基础。     

柠檬自交后代抗柑橘溃疡病的离体鉴定

为鉴定柠檬自交后代对柑橘溃疡病的抗性,以柠檬鲜叶为材料,通过注射法和针刺法接种不同浓度溃疡病菌菌液,对114株柠檬自交后代群体进行离体鉴定,并以感病材料冰糖橙、抗病材料枸橼C-05作为对照。结果表明:柠檬自交后代对溃疡病抗性存在个体间差异;其中,注射接种法中表现为抗10~4和10~5 CFU/m L病原菌的植株有24株,针刺接种法中表现为抗108 CFU/m L病原菌的植株有11株;其中,有6株柠檬自交后代在2种鉴定方法中均被认定为抗病株。综合2种鉴定方法,114株柠檬自交后代中有29株对溃疡病表现出抗10~4 CFU/m L病原菌。     

梨抗黑星病的遗传育种研究

鸭梨、早酥等8个品种15个杂交组合的F1群体对黑星病的抗性表现为质量性状的遗传。抗病性对感病性为显性。80％以上的供试组合F1对黑星病的抗感分离比可用4对基因控制的抗病性来解释。亲本品种的抗性对杂交后代的影响较大,且品种间有差异。佳白梨、五九香梨是梨抗黑星病育种的良好亲本。西洋梨及其杂种在梨抗黑星病育种中作一亲或双亲是有利的。     

甜瓜蔓枯病抗性聚合材料中防卫基因的表达分析

蔓枯病是危害甜瓜的一种真菌性病害,由于存在生理小种的变异,携带单个抗病基因的甜瓜品种在生产中表现出抗性不足,本研究的目的是评价聚合基因材料的抗性,并分析相关防卫基因的差异表达。利用5份抗源创制8份聚合抗病基因材料,在采用梯度浓度孢子液接种鉴定的基础上,利用RT-PCR技术研究接种后苯丙氨酸解氨酶(PAL)基因、抗坏血酸氧化酶(APX)基因、几丁质酶(CHT)基因等防卫基因在聚合基因材料中的表达情况。结果表明:当接种浓度为5×109mL-1时,单一抗源已开始出现感病现象,而聚合基因材料仍表现高抗或抗,其中,890-398(PI511890×PI482398)和145-471(PI420145×PI140471)抗性最高。890-398中PAL基因表达高峰在1 d,早于PI420145和PI511890的2 d;抗、感及聚合甜瓜材料中的APX基因表达均在接种后3 d达到高峰,890-398中APX基因的表达水平约为对照‘白皮脆’的13.31倍,PI420145和PI511890中APX基因表达水平约为对照的10.00和9.38倍;CHT基因表达最高峰时,890-398中CHT基因的表达量约为对照的28.46倍,PI420145和PI511890约为对照的8.03和20.43倍。结论:甜瓜抗蔓枯病基因的聚合能提高其对蔓枯病的抗性,防卫基因在聚合材料中的高表达或早表达使其表现较高的抗性。本文创制的聚合基因材料可用于甜瓜的抗蔓枯病聚合育种,对甜瓜抗病育种具有重要意义。     

花椰菜苗期黑腐病抗、感品种转录组差异表达分析

为研究花椰菜抗黑腐病的分子机制,本试验利用Illumina测序平台的RNA-Seq技术对花椰菜黑腐病感病品种Y1-2和抗病品种EC-247接种黑腐病菌5 d后的样本进行高通量转录组分析,采用RSEM软件计算基因表达量,并在此基础上筛选两组样本间的差异表达基因。结果显示,抗、感品种间差异表达基因共3 195个,其中上调表达基因1 424个,下调表达基因1 771个。通过GO和KEGG进行基因功能显著性富集分析发现,差异表达基因主要富集于苯丙烷类代谢、次级代谢产物合成、逆境响应、MAPK信号通路等途径。本研究结果可为解析花椰菜与黑腐病互作机制、挖掘黑腐病抗病基因提供参考。