疯草研究进展

疯草是指含有苦马豆素的豆科黄芪属和棘豆属有毒植物,动物疯草中毒病是危害草原畜牧业最严重的问题之一.苦马豆素是疯草的主要毒性成分,它能抑制动物细胞α-甘露糖苷酶和甘露糖苷酶Ⅱ的活性,影响低聚糖的代谢和糖蛋白的加工,导致低聚糖蓄积和糖蛋白合成障碍.中毒动物表现为行为异常、瘫痪、不育、流产、体质量下降,严重的发生死亡,造成巨大的经济损失.本文主要对疯草的毒性成分、中毒机理、化学防除和脱毒利用等方面的研究进行了综述,旨在为疯草中毒病的防治和疯草的利用提供思路和认识.     

“疯草”中苦马豆素解毒制剂及抗肿瘤应用研究进展

"疯草"中的主要毒性成分苦马豆素,属于一种多羟基取代吲哚兹定生物碱。其能抑制动物机体中的α-甘露糖苷酶,造成人和动物中毒;同时又具有极强的抗肿瘤活性,而对人有益。全文概述了苦马豆素的生化特性、中毒机理、解毒制剂研制以及抗肿瘤作用的研究进展,以期为预防治疗苦马豆素中毒以及合理开发利用苦马豆素提供参考。     

中国主要疯草中苦马豆素的动态变化规律

通过研究疯草中主要毒性成分—苦马豆素的动态变化规律,为疯草防治利用提供理论依据。在采集疯草时对其生长环境进行观察和GPS定位,确定样品采集信息。采用气相色谱方法,对不同地区采集的不同种类、不同生长时期和不同生长部位的疯草样品中的苦马豆素含量进行测定,分析苦马豆素动态变化规律。按照疯草种类区分,甘肃棘豆苦马豆素平均含量最高,达到0.148‰,最低为哈密黄芪,为0.044‰;按照区域区分,采于青海野牛坡的花期急弯棘豆苦马豆素含量最高,达到0.277‰;按照生长阶段区分,花期苦马豆素含量最高,平均达到0.139‰;不同部位中,花的含量最高,平均达到0.162‰。不同种类疯草中苦马豆素含量由高到低的顺序依次为:甘肃棘豆、急弯棘豆、茎直黄芪、小花棘豆、变异黄芪、哈密黄芪;按区域区分,不同区域疯草中苦马豆素含量随海拔升高而升高;按生长阶段区分,不同生长时期的疯草中苦马豆素含量由高到低依次为花期、花果期、果期和花前期,按生长部位区分,苦马豆素含量也有差别,由高到低分别是花、叶、荚果、根和茎。     

黄花棘豆有毒成分的分离与鉴定

本研究从黄花棘豆中分离出吲哚兹定生物碱—苦马豆素,并证实这种生物碱对α-甘露糖甙酶有抑制作用。研究表明:人工饲喂黄花棘豆中毒羊血浆的α-甘露糖甙酶显著低于正常对照羊(p<0.01),停止饲喂黄花棘豆后,中毒羊逐渐康复,血浆α-甘露糖甙酶迅速恢复正常。经测定黄花棘豆及甘肃棘豆的苦马豆素含量分别为0.012%,0.021％。从而认为苦马豆素是黄花棘豆和甘肃棘豆的主要有毒成分。     

产苦马豆素疯草内生真菌Alternaria Section Undifilum oxytropis的诱变筛选

【背景】疯草是黄芪属和棘豆属有毒植物的统称,疯草内生真菌Alternaria Section Undifilum oxytropis是从疯草中分离获得的一种具有产生苦马豆素（swainsonine,SW）能力的真菌。因其产物SW一方面体现出良好的抑制肿瘤细胞生长、浸润和转移作用及潜在的抗艾滋病病毒等多种药用活性,另一方面牛羊因大量误食疯草能导致中毒,对草原畜牧业健康发展造成了严重的危害,受到研究人员的广泛关注。但由于疯草内生真菌Alternaria Section Undifilum oxytropis产苦马豆素生物合成机制尚不清楚,严重制约了后续通过生物发酵大量获得SW用以抗肿瘤机制研究与临床应用,以及通过基因工程手段对疯草进行脱毒育种,使疯草成为牛羊可食用、无毒的天然牧草。【目的】利用有效的研究手段,阐明Alternaria Section Undifilum oxytropis产苦马豆素生物合成机制。【方法】以Alternaria Section Undifilum oxytropis为出发菌株,分别采用紫外辐照诱变、亚硝基胍化学诱变、紫外辐照与亚硝基胍复合诱变的3种诱变方式,在不同诱变时间、诱变剂量等条件下对其进行了诱变筛选研究。通过测定不同诱变方式和作用条件下对菌株的致死率,经发酵培养、连续5代传代培养、并采用α-甘露糖苷酶活性分析法检测诱变菌株产苦马豆素含量变化,优化确定了不同诱变方式下最佳诱变条件,并将优势突变菌株接种马铃薯葡萄糖琼脂培养基（potato dextrose agar,PDA）和改良察式液体培养基,连续培养32 d,测定并绘制了突变菌株D4和UD1的生长周期曲线。【结果】经上述3种诱变方式处理后,分别获得1株产苦马豆素含量变化较大、能稳定连续传代培养的突变菌株U4、D4、UD1。其优化的诱变条件,紫外辐照为辐照处理160 s,亚硝基胍化学诱变为亚硝基胍诱变剂量6 μL、诱变处理时间5 min,紫外辐照与亚硝基胍复合诱变为紫外辐照20 s,亚硝基胍诱变剂量2 μL,诱变处理时间5 min。突变菌株U4、D4、UD1较原始菌株,菌落形态偏小、中间凸起,菌落颜色呈微粉色或白色,且其产苦马豆素含量均有显著变化,其中U4突变菌株产苦马豆素量平均增加16.02%（P<0.01）、D4 突变菌株产苦马豆素量平均降低23.58% （P<0.01）,UD1 突变菌株SW产量平均增加21.87%（P<0.01）,但D4、UD1突变菌株生长周期与出发菌株一致,均为24 d。【结论】通过紫外辐照诱变、亚硝基胍化学诱变、紫外辐照与亚硝基胍复合诱变方法,成功筛选出产苦马豆素含量变化较原始菌株差异较大的3株突变菌株U4、D4、UD1,这为后续利用高通量测序等分子生物学手段,在分子水平上阐释疯草内生真菌Alternaria Section Undifilum oxytropis关键基因、关键酶在其生物合成苦马豆素机制关系方面奠定研究基础。     

苦马豆素国内外研究进展

苦马豆素作为疯草毒性的主要成分，文中阐述了其物理化学特性，来源，临床症状，致病机理。但随着科学家对它的研究，发现了其抑制肿瘤细胞生长与免疫调节的作用，并作为一种新型的抗癌药物，对其进行了分离纯化与合成。     

疯草中苦马豆素的固相萃取-亲水作用色谱检测

【目的】建立疯草中苦马豆素的固相萃取-亲水作用色谱分析方法。【方法】以小花棘豆、毛瓣棘豆、黄花棘豆、甘肃棘豆、冰川棘豆等5种疯草为样品,经纯乙醇索氏提取和SPE固相萃取柱净化,采用Waters X-Bredge HILIC色谱柱和蒸发光散射检测器,对流动相中的有机溶剂种类及质量浓度、缓冲盐浓度和柱温等条件进行优化,检测苦马豆素含量并用质谱检测法进行验证。【结果】苦马豆素与疯草中的其他成分在异丙醇-2mmol/L乙酸铵(体积比为52∶48)流动相条件下可以得到较好地分离;苦马豆素在10~100μg/mL的质量浓度与色谱峰面积具有良好的线性关系(r2=0.997),检出限(LOD)(信噪比=3)为6μg/mL,定量限(LOQ)(信噪比=10)为20μg/mL,加标回收率在80%~100%。【结论】建立的固相萃取-亲水作用色谱检测方法简单、快速、精密度和准确度高,可替代传统的阳离子交换树脂净化-衍生化法用于疯草中苦马豆素的测定。     

西藏3种疯草中合成苦马豆素内生真菌的鉴定

 【目的】从西藏毛瓣棘豆、冰川棘豆、茎直黄芪中分离内生真菌。【方法】应用薄层色谱法、气相色谱、气相色谱-质谱联用法检测内生真菌中的苦马豆素（swainsonine,SW）,筛选可生成SW的内生真菌;应用聚合酶链反应对真菌的ITS序列和IGS序列进行扩增,并根据ITS序列信息构建系统发育树,确定其种属分类;对IGS序列进行限制性酶切,并分析酶切产物。【结果】从3种疯草中分离到可以产生SW的4株内生真菌,各菌的形态、ITS序列的同源性与埃里格孢属真菌较为接近,系统发育分析表明4株真菌均为棘豆埃里格孢菌。ITS序列和IGS序列的限制性片段的分析表明,4株真菌遗传距离较近,但仍存在种间变异,可能为棘豆埃里格孢菌的不同亚种。【结论】本研究结果为探讨内生真菌合成SW机理研究奠定了基础,为动物疯草中毒病的防除和疯草资源的合理利用提供了新思路。     

苦马豆素抗牛病毒性腹泻病毒的研究

【目的】疯草是中国西部影响草地生态和畜牧业健康发展的毒草之一。主要有豆科棘豆属和黄芪属有毒植物等,在冬季牧草严重缺乏的时节,牛羊等牲畜被迫采食后可引起中毒和生产性能下降,甚至死亡,每年给我国草地生态和畜牧业造成的直接经济损失达几十亿元,是危害最严重的毒草。目前,我国西部天然草地动物因疯草中毒死亡所造成的经济损失仍持续剧增。苦马豆素被认为是引起动物疯草中毒的主要毒性成分。由于疯草分布广泛,资源丰富,如何改善草地生态,合理开发利用疯草成为研究的课题和方向。近几十年来, 随着对疯草研究的深入和扩展,人们发现苦马豆素不仅具有良好的抗肿瘤效果,还可作为免疫调节剂、抗HIV及扩散抑制剂、抗病毒和细胞保护剂等药物使用。目前,国内在对苦马豆素抗肿瘤、调节机体免疫方面研究较热,但是,对苦马豆素在抗病毒活性、作用机理方面的研究尚无相关报道。为了探讨茎直黄芪中生物碱苦马豆素（swainsonine,SW）抗牛病毒性腹泻病毒（bovine viral diarrhea virus,BVDV）的作用机制,明确其体外抗病毒作用效果,为抗BVDV的药物筛选提供参考依据。【方法】利用细胞培养技术,采用CPE观察法和MTT比色法相结合的方法测定不同浓度SW对牛肾原代细胞(madin-darby bovine kidney cells,MDBK)的毒性作用,确定药物的安全浓度和TD50,并分别采用先加药后感染病毒、先感染病毒后加药、药毒作用2 h后加入、感染病毒同时给药后再加药四种作用方式,检测不同浓度SW对BVDV入侵的阻断作用、复制的抑制作用、直接杀伤作用和综合作用,并计算不同作用方式下的治疗指数。【结果】结果显示：SW浓度小于0.256 μg•mL-1范围内对MBDK细胞无毒性作用,在大于0.512 μg•mL-1浓度下MBDK细胞表现出一定程度的病变,TD50为2.512 μg•mL-1,按Reed-Muench 氏法计算BVDV TCID50为10-4.7/0.1mL;在体外随苦马豆素质量浓度的增加,其抗BVDV作用具有很好的量效关系,且与作用方式有关,比较四种作用方式下的治疗指数1.05、2.47、2.08和3.21,说明SW对BVDV的综合作用（65.29%,P＜0.01）和复制（65.05%,P＜0.01）的抑制作用较好,亦有一定的直接杀伤作用,但对其入侵的阻断作用不佳。【结论】SW在体外有良好抗BVDV活性作用,并推测苦马豆素（SW）抗病毒的主要效应可能是SW能进入细胞内抑制BVDV的复制增殖以及直接灭活游离BVDV而发挥作用。     

苦马豆素抗血清治疗山羊甘肃棘豆中毒的血清学和免疫学指标评价

通过检测苦马豆素抗血清治疗山羊甘肃棘豆中毒的血清学和免疫学指标,评价苦马豆素抗血清对山羊疯草中毒的治疗效果。将18只山羊随机分为对照组(A组,6只)、攻毒治疗组(B组,6只)和攻毒组(C组,6只),其中B、C组山羊于第1天拌精料饲喂甘肃棘豆草粉,开始攻毒剂量为10 g/(kg.d);C组山羊(第55天)出现死亡时停止攻毒。攻毒后第21天,B组山羊颈部肌肉注射苦马豆素抗血清,每只山羊每次0.25 mL/(kg.d),连续注射4 d。各组山羊于攻毒前进行第1次采血,以后每隔7 d采血1次,共采血8次。结果显示,攻毒后第7天,B、C组山羊AKP活性和AMA活性分别上升和下降,且均与A组差异极显著(P<0.01);第14天,B、C组山羊血清LDH活性明显高于A组(P<0.05);第21天,B、C组山羊的E-玫瑰花环率明显低于A组(P<0.05)。对B组山羊注射苦马豆素抗血清,治疗后(第28天)首次检测结果显示,B组山羊AKP、AMA和BUN活性较C组均表现为差异极显著(P<0.01);第35天(第2次检测),B组山羊血清中苦马豆素浓度明显低于C组(P<0.01),而E-玫瑰花环率明显高于C组(P<0.05);第42天,B组山羊LDH活性显著低于C组山羊(P<0.05)。研究证实,苦马豆素抗血清能够有效治疗甘肃棘豆对山羊肝脏、心脏和肾脏等组织器官造成的损伤,可用于治疗山羊疯草中毒。