农杆菌介导的bar基因和Bt基因的遗传转化研究

[目的]探讨不同基因对不同棉花品种的遗传转化差异.[方法]以新海14号、新海16号、新海24号和新海30号四个不同基因型海岛棉胚性愈伤组织为受体材料,通过农杆菌介导法分别将pBI121-bar/Bt和pBI121-Bt转化至四个品种中,对遗传转化体系中的PPT浓度和Cef浓度进行筛选,观察比较不同浓度下不同基因型胚性愈伤的生长状况,并对单价表达载体和双价表达载体转化不同基因型胚性愈伤的生长状态进行比较.[结果]转化体系的筛选确定双价表达载体的PPT筛选浓度为3.0 mg/L,Cef的筛选浓度为800 mg/L;转化单价表达载体LBA4404/pBI121-Bt的Cef的筛选浓度为600 mg/L.转化单价表达载体后,新海14号的出愈率最高,新海30号的出愈率最低;转化双价表达载体后,新海14号的出愈率最高,新海24号的出愈率最低.[结论]不同基因型对PPT的敏感性有差异;转化不同基因后,胚性愈伤对抗生素的敏感度有所不同;转化相同基因后,不同品种的胚性愈伤生长存在差异.     

利用GUS瞬时表达探讨香石竹品种“云红二号”基因枪转化参数

利用基因枪法和带有GUS基因的双元表达载体pBI121转化香石竹品种"云红二号"的外植体。通过检测GUS基因在香石竹叶片和茎段上的瞬时表达情况,分析受体材料、轰击距离及氦气压力对GUS瞬时表达的影响。结果表明,以茎段为受体材料,在射程为6 cm、氦气压力为1100 psi下,可检测到GUS基因较好的表达活性,瞬时表达率最高可达8.33%。     

基因枪法介导的南瓜的遗传转化体系构建

用南瓜的愈伤组织作受体进行了基因枪的轰击试验,确立了以轰击压力为1 100 psi,轰击距离为9 cm,3μLDNA／mg金粉的轰击比例,优化了基因枪的轰击参数;在轰击前4 h和轰击后16 h用附加有0．4 mol／L甘露醇的MS培养基进行高渗处理、轰击后恢复培养6 d,可以增加转化成功的机率。用1 mg／LBasta作 为选择压,筛选培养45 d后进行GUS基因组织化学染色,结果表明GUS基因可在南瓜的组织中瞬时表达。     

农杆菌介导的紫穗槐茎段愈伤组织遗传转化研究

采用农杆菌介导法对紫穗槐茎段诱导的愈伤组织进行遗传转化研究。确定了卡那霉素临界耐受浓度为40mg/L。菌液浓度与侵染时间的正交试验结果表明:侵染菌液OD600为0.8、侵染时间为30min时转化效率最高,达17.95%。GUS染色检测分析表明:含pBI121-GUS质粒DNA农杆菌侵染转化的愈伤组织其抗性不定芽和再生植株根和叶均呈蓝色。转化植株叶PCR检测结果表明外源GUS基因已整合到紫穗槐基因组中。以上结果表明建立了以茎段诱导愈伤组织为转化受体、农杆菌介导的紫穗槐高效遗传转化体系。为了验证其可重复性,又进行了pBI121-GFP基因的转化,T0代再生植株PCR检测整合率达85%,在488nm蓝光源激发下转化株的顶芽产生绿色荧光,说明转入的基因在35S启动子下过量表达。此遗传转化体系可应用于转基因育种。     

甜荞高效离体再生与GUS基因瞬时表达分析

以晋荞1号叶片为外植体,研究了不同类型(2,4-D,6-BA和NAA)及不同剂量的生长调节剂对愈伤组织诱导、幼苗分化及植株再生的影响;利用Ca MV35S启动子驱动GUS基因PBI121质粒转化EHA105农杆菌侵染愈伤组织,进行GUS染色鉴定。结果表明,愈伤组织诱导培养基中加入3.0 mg/L 2,4-D和1.0 mg/L 6-BA诱导愈伤组织的效果最好,出愈率达到69.5%;再分化培养基中加入1.0 mg/L的6-BA和1.0 mg/L的NAA分化率最高(47.0%);农杆菌侵染愈伤组织经过GUS染色鉴定证明为阳性。晋荞1号高效离体再生体系的建立为下一步转基因选育优良品种提供了理论依据和技术指导。     

不同施肥措施对稻田土壤氮素矿化的影响

以甘蔗品种新台糖22和粤糖93-159的愈伤组织和刚分化4周的小苗为试验材料,初步确定了灭草烟在愈伤组织分化阶段和刚分化4周小苗的筛选浓度.结果发现,不同基因型甘蔗的愈伤组织和刚分化小苗对灭草烟的耐受浓度均有差异.综合试验结果,适合灭草烟在新台糖22和粤糖93-159愈伤组织分化阶段的筛选浓度为0.3 μmol/L;适合灭草烟对新台糖22刚分化4周小苗的筛选浓度为0.5 μmol/L,适合灭草烟对粤糖93-159刚分化4周小苗的筛选浓度为1.0μmol/L.     

玉米基因枪遗传转化体系的研究

以玉米自交系81162的胚性愈伤组织为受体材料,通过基因枪轰击法将nptII基因和afp基因转入玉米细胞,获得了抗性愈伤组织和再生植株。确定了筛选剂Geneticin的筛选浓度和方法,愈伤组织生长阶段和分化阶段Geneticin的有效浓度分别为60mg/L和30mg/L。对2个轰击参数氦气压力与轰击距离进行了组合试验,结果表明1100psi的氦气压力和8cm的轰击距离为最佳组合。PCR检测证明,目的基因已整合到玉米基因组中。     

农杆菌介导海岛棉胚性愈伤组织遗传转化影响因素分析

以3个栽培海岛棉品种新海30、新海24、新海16诱导而来的胚性愈伤组织为受体材料,分析了3种农杆菌菌株EHA105、LBA4404、GV3101和3种已构建质粒pCAMBIA1301、pCAMBIA1304、pBI121对已建立的农杆菌介导海岛棉外源基因转化体系的影响。研究结果表明,菌种和质粒对转化率有极其显著的影响,而两者之间的互作关系也比较显著。最终得到农杆菌介导转化海岛棉胚性愈伤组织的最佳菌种和质粒是GV3101和pBI121。     

新台糖16号甘蔗组织培养技术研究

研究不同配方对新台糖16号甘蔗诱导出愈伤组织、愈伤组织分化成绿苗、绿苗增殖及绿苗促根的影响,以筛选出较佳的配方。结果表明:用MS+2,4-D2.5mg/L对诱导愈伤组织效果较佳,MS+BA1.0mg/L+KT1.0mg/L+NAA0.3mg/L对分化绿苗及其增殖效果最好;选用1/2MS+IBA1.5mg/L+NAA1.5mg/L,附加活性炭0.05%,对促根的效果最好。     

用基因枪法将抗除草剂bar基因导入小麦的研究

用基因枪法将含有抗除草剂bar基因的植物表达载体导入优良品种小麦幼胚愈伤组织,并通过GUS瞬时表达对沉淀剂、轰击距离、金粉用量等轰击参数进行了优化.用除草剂对轰击后的材料进行分化生根筛选,共获得33株再生苗.通过PCR检测和涂叶检测,初步证明其中4株已将bar基因整合到小麦基因组中,平均转化率为0.33%.     

用基因枪法将抗除草剂bar基因导入小麦的研究

用基因枪法将含有抗除草剂bar基因的植物表达载体导入优良品种小麦幼胚愈伤组织，并通过GUS瞬时表达对沉淀剂、轰击距离、金粉用量等轰击参数进行了优化。用除草剂对轰击后的材料进行分化生根筛选，共获得33株再生苗。通过PCR检测和涂叶检测，初步证明其中4株已将bar。基因整合到小麦基因组中，平均转化率为0．33％。     

小麦成熟胚再生体系及基因枪转化的初步研究

以小麦品种晋麦2148的成熟胚为外植体,消毒后用解剖刀刨碎,接种于MS+VB5+11.2g·L-1葡萄糖+2mg·L-12,4D+8g·L-1琼脂糖的培养基中诱导愈伤组织,将诱导3周的成熟胚愈伤组织接种到胚状体成熟培养基(MS+VB5+11.2g·L-1葡萄糖+0.2mg·L-1IAA+8g·L-1琼脂糖)中培养4-8周,然后转接到再生培养基(1/2MS+VB5+30g·L-1蔗糖+8g·L-1琼脂糖)中进行再生成苗.接种1200块成熟胚,得到1123块愈伤组织,最终形成258株再生苗,再生率为21.5%.在建立了再生体系的基础上,用基因枪介导法将GUS基因导入成熟胚愈伤组织,Xgluc染色表明,GUS基因已经在小麦成熟胚愈伤组织中表达.将100块愈伤组织用Xgluc染色,29块愈伤组织出现肉眼可见的蓝色小点.     

基因枪导入法培育抗虫水稻

以含潮霉素抗性基因，GUS基因和雪花莲凝集素（GNA）基因的pWRG1515和pRSSGNA1为供体DNA，利用基因枪法转化上农香糯成熟胚诱导的愈伤组织，经抗性培养基筛选，从轰击的135块愈伤组织中得5株转 基因植株，GUS检测和PCR分析表明，外源基因已转入并整合到水稻基因组DNA上。     

基因枪转化小麦悬浮细胞参数的优化

小麦是我国的重要粮食作物,其遗传工程因受转基因技术的限制而进展缓慢。国际上,自１９９２年Ｖａｓｉｌ等〔７〕用基因枪技术首次得到转基因小麦以来,现在又有几例成功的报道〔３,４,８,９〕。国内成功的报道极少,有的即使得到了转基因植株,其频率也很低。导致小...     

小麦基因枪高效转化体系的建立

以小麦幼胚为基因枪转化受体 ,用含GUS和bar基因的质粒pDM80 3对小麦幼胚进行转化 ,并对幼胚大小、轰击距离、质粒和金粉用量等参数对GUS瞬时表达率及表达量的影响进行了研究。幼胚以 1 0～ 1 5mm最为适宜 ,6cm和 9cm各轰击一次、质粒 0 .5μg/枪及金粉 30 0 μg/枪 ,GUS瞬时表达率及表达量最高。通过对以上参数的优化 ,建立了一个高效的小麦基因枪转化体系。     

番红花组织基因枪转化瞬时表达检测

用高压氦气式基因枪将CaMV35S启动子驱动下的gus基因导入经济植物番红花的叶鞘和叶、芽来源的愈伤组织块中 ,4 8h后染色检测到了gus基因的瞬间表达 ,2 0d后仍检测到极少量表达 .研究发现 ,轰击前在加有 0 5mol L甘露醇的液体愈伤组织继代培养基上处理 6h ,明显增加了gus基因表达的数量 ;选择 110 0psi× 9cm的轰击条件 ,转化效果最好 ;高浓度卡那霉素 (5 0 0～ 80 0mg L)可以作为筛选剂 .结果表明 ,基因枪法是有效的番红花遗传转化方法 ,gus基因可以作为番红花基因工程研究的报告基因 ,CaMV35S启动子能有效驱动外源基因在番红花组织中表达     

冬小麦遗传再生体系及根癌农杆菌介导的转化研究

以临优145的幼胚为外植体诱导植株再生,并进行农杆菌转化研究.以冬小麦品种临优145的幼胚为外植体,消毒后用解剖刀挑取幼胚,盾片朝上接种于MS+2,4-D 2 mg/L+肌醇100 mg/L+MES 400 mg/L+CH 100 mg/L+40 g/L麦芽糖+8 g/L琼脂的培养基中诱导愈伤组织,每2周继代一次,将诱导出的淡黄色、颗粒状Ⅱ型胚性愈伤组织接种于分化培养基(MS+ZT 1 mg/L+IAA 1mg/L+MES 400 mg/L+CH 100 mg/L+麦芽糖40 g/L+gelrite 2.6 g/L,pH 5.8)上培养2-3周,然后转接到再生培养基(1/10 MS+NAA 0.5mg/L+KT0.5 mg/L+蔗糖30 g/L+gelrite 2.6 g/L,pH 5.8)中进行再生成苗.接种1229块幼胚,得到987块愈伤组织,Hyg抗性愈伤组织123块,抗性再生植株34株.在建立了再生体系的基础上,用根癌农杆菌介导法将GUS基因导入幼胚愈伤组织,抗性植株的PCR检测呈阳性.X-gluc染色表明,少部分愈伤组织出现肉眼可见的蓝色晕斑,说明GUS基因已经在小麦幼胚愈伤组织中表达.     

用农杆菌将Bt基因导入水稻愈伤组织的研究

从水稻成熟胚诱导出的愈伤组织经继代培养后可以产生大量的胚性愈伤组织。通过采用农杆菌共培养法转化上述胚性愈伤组织,在附加羧苄青霉素Ｃｂ（５００ｕｇ／ｍＬ）和卡那霉素Ｋｍ（５０ｕｇ／ｍＬ）的选择培养基上进行抗性愈伤组织的筛选,在附加羧苄青霉素Ｃｂ（５０ｕｇ／ｍＬ）和卡那霉素Ｋｍ（２５ｕｇ／ｍＬ）的分化培养基上诱导抗性芽。ＧＵＳ酶活性检测和ＰＣＲ检测结果均为阳性,证明外源目的基因（Ｂｔ）已在寒地水稻抗性愈伤组织中整合并表达。抗性再生植株的ＧＵＳ酶活性及ＰＣＲ检测正在进行中。     

用基因枪法将Bt杀虫基因导入水稻愈伤组织的研究

从水稻成熟胚诱导出的愈伤组织经继代培养后可以产生大量的胚性愈伤组织。本研究采用基因枪法转化上述胚性愈伤组织 ,在附加羧苄青霉素 (5 0 0 μg· m L-1)和卡那霉素 (5 0 μg·m L-1)的选择培养基上进行抗性愈伤组织的筛选 ,在附加羧苄青霉素 (5 0 0 μg· m L-1)和卡那霉素 (2 5 μg· m L-1)的分化培养基上诱导抗性芽。GUS酶活性检测和对基因组 DNA作 PCR检测结果均为阳性 ,证明外源目的基因 (Bt)已在寒地水稻抗性愈伤组织中整合并表达。抗性再生植株的 GUS酶活性及 PCR检测正在进行中