2,3,7,8-四氯二苯并-p-二恶英对建鲤肝组织损伤作用研究

利用精密肝切片培养技术研究2,3,7,8-四氯二苯并-p-二恶英(TCDD)对建鲤肝组织的损伤作用,将精密肝切片组织分为5个处理组,每个处理组4个重复,将不同浓度TCDD(浓度设定为0.00、0.05、0.10、0.30、0.60μg/L)处理肝切片3 h后,收集上清培养液及肝切片组织测定丙氨酸转氨酶(GPT)、天冬氨酸转氨酶(GOT)、乳酸脱氢酶(LDH)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)、丙二醛(MDA)、三磷酸腺苷(ATP)等生化指标含量变化。结果表明:TCDD浓度在0.30μg/L时,对精密肝切片组织损伤较大,可以显著提高上清培养液中GPT、GOT、MDA的含量,显著提高切片匀浆上清液中LDH的活性值,与空白对照组相比,差异极显著(P0.01);可以显著降低切片匀浆上清液中ATP、GSH-PX的含量,与空白对照组相比,差异极显著(P0.01);显著降低上清培养液中SOD活性值,与空白对照组相比,差异显著(P0.05)。这说明采用TCDD进行急性染毒后,可以造成建鲤肝组织的损伤,使机体组织处于氧化应激状态,产生一系列氧化应激反应。     

甘草提取物对2,3,7,8-四氯二苯并-p-二口恶英致建鲤肝损伤的影响

为了评价甘草提取物是否对2,3,7,8-四氯二苯并-p-二口恶英(2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin,TCDD)引起建鲤肝组织损伤具有保护作用,本实验用含甘草提取物的饲料(0.1、0.5和1.0g/kg)饲喂建鲤60d,再腹腔注射0.6μg/kg TCDD,72h后收集血液和肝组织,检测血清和肝组织匀浆中谷丙转氨酶(alanine transaminase,ALT)、谷草转氨酶(aspartate transaminase,AST)、乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,AKP)、总蛋白(total protein,TP)、白蛋白(albumin,Alb)、过氧化氢酶(hydrogen peroxidase,CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GPx)、总抗氧化能力(total antioxidant capacity,TAOC)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)等生化指标,同时制备肝组织病理切片,观察甘草提取物对TCDD诱导建鲤肝组织损伤的影响。结果表明:1.0g/kg甘草提取物显著降低血清中ALT、AST、LDH和AKP活性,显著提高总蛋白(TP)、白蛋白(Alb)质量浓度、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)、总抗氧化能力(T-AOC)和超氧化物歧化酶(SOD)活性,降低丙二醛(MDA)质量摩尔浓度(P0.05或P0.01)。病理组织切片观察结果显示,甘草提取物处理组可以明显减轻TCDD引起肝组织损伤。提示,甘草提取物对TCDD引起的建鲤肝组织损伤具有较好的保护作用,而且甘草提取物的保护作用可能与其抗氧化性能有关。     

枸杞多糖对四氯化碳诱导建鲤原代肝细胞损伤的保护作用研究

研究中药枸杞多糖(Lycium barbarum polysaccharide,LBP)对四氯化碳(CCl4)诱导的建鲤(Cyprinus carpiovar Jian)肝细胞急性损伤的保护作用。利用8 mmol/L四氯化碳构建建鲤肝细胞损伤模型,用不同浓度的枸杞多糖处理肝细胞,设空白对照组、枸杞多糖对照组(0.4 mg/mL)、模型组(CCl4)、预防组(CCl4处理前加枸杞多糖孵育,0.1、0.2和0.4 mg/mL)、治疗组(CCl4处理后加枸杞多糖孵育,0.1、0.2和0.4 mg/mL)和预防治疗组(枸杞多糖孵育后经CCl4处理再经枸杞多糖孵育,0.1、0.2和0.4 mg/mL)。12 h后,收集细胞和细胞培养液,然后测定谷丙转氨酶(GPT)、谷草转氨酶(GOT)、乳酸脱氢酶(LDH)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、细胞活力、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)、免疫球蛋白M(IgM)及药物代谢酶细胞色素P450 2E1(CYP2E1)等生化指标。研究结果表明:CCl4处理后可以显著增加GPT、GOT、LDH、MDA、TNF-α、IL-1β、IgM及CYP2E1的含量,降低SOD活性和细胞活力;枸杞多糖处理组可不同程度地抑制上述生化指标的变化,其中预防组及预防治疗组对于转氨酶(GPT、GOT)、LDH、MDA、细胞因子(TNF-α、IL-1β)、IgM及CYP2E1等活性的升高皆有显著抑制作用,同时显著提高SOD酶活性及细胞活力,且呈剂量依赖性;而治疗组仅对LDH、TNF-α及CYP2E1有显著的抑制作用。综上结果,认为枸杞多糖对四氯化碳致建鲤肝损伤具有一定保护作用,可以应用于鱼类肝损伤的防治。     

TCDD对建鲤肝脏的影响

研究2,3,7,8-四氯二苯并-p-二噁英(TCDD)对建鲤肝组织的影响。将建鲤随机分为5个处理组和1个空白对照组,每组30尾鱼。采用一次性腹腔注射染毒,处理组注射剂量分别为0.1,0.3,0.6,1.2,2.4μg·kg-1,空白组注射同体积二甲基亚砜(DMSO)。分别于给药后24,48,72,96,120 h采集血液及肝组织,测定谷草转氨酶(GOT)、谷丙转氨酶(GPT)、乳酸脱氢酶(LDH)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、谷胱甘肽S-转移酶(GST)活力和总抗氧化能力(T-AOC)的变化。结果表明:TCDD染毒72 h,各染毒组损伤程度较严重,GOT,LDH,GPT活性值显著升高(P0.01或P0.05),GST,GSH-Px,T-AOC活力显著降低(P0.01或P0.05)。这说明TCDD急性染毒后可以造成建鲤肝组织的损伤,引起建鲤肝组织的氧化应激反应。     

环磷酰胺诱导的尼罗罗非鱼体内外肝损伤模型的构建

以环磷酰胺(CTX)为诱导物，建立罗非鱼体内外急性肝损伤模型。体外，0、5、10、15、20和25 mmol·L^-1 CTX 分别作用于离体培养的罗非鱼精密肝切片（PCLS）6 h 后，测定切片培养上清中谷丙转氨酶（GPT）、谷草转氨酶（GOT）和乳酸脱氢酶（LDH）水平，同时收集肝切片，用噻唑蓝（MTT）法检测肝切片增殖活性，测定切片内总抗氧化能力（T-AOC）、丙二醛（MDA）、过氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽（GSH）水平。体内，采用胸腔注射法造模，每千克鱼体重分别注射0、10、25、75和100 mg环磷酰胺（下文以mg·kg^-1表示），每隔3 d给药1次，连续3次。末次给药后第4天取血，测定罗非鱼血清中GPT、 GOT 和LDH及肝组织匀浆中T-AOC 、MDA、SOD和GSH水平。结果显示： 20～25 mmol·L^-1 CTX作用体外培养精密肝切片6 h及75～100 mg·kg^-1 CTX胸腔注射罗非鱼后，均可以导致GPT、GOT和 LDH 活力显著升高；T-AOC、SOD活力及GSH含量显著下降，MDA含量显著提高。同时，20 和25 mmol·L^-1 CTX能导致肝切片增殖活性显著下降，分别为空白对照组的67.29%和55.41%，且有剂量依赖性。结果表明：CTX可引起罗非鱼肝损伤；分别采用20 mmol·L^-1 CTX 作用体外培养PCLS 6 h或者采用75～100 mg·kg^-1 CTX胸腔注射罗非鱼，每隔3 d给药1次，连续3次，均可以构建体内外急性肝损伤模型。     

虎杖提取物对CCl4诱导建鲤损伤肝细胞生化指标的影响

为探明虎杖对鱼类损伤肝细胞是否具有修复作用，分离建鲤肝细胞，设6个试验组：I组(空白对照组)；II组(CCl4模型组)；III组(800 μg/mL虎杖提取物对照组)；IV组(造模前200、400、800 μg/mL虎杖提取物处理组)；V组(造模后200、400、800 μg/mL虎杖提取物处理组)；VI组(造模前、后200、400、800 μg/mL虎杖提取物处理组)。各组细胞经处理后继续培养12 h，收集肝细胞培养液，检测上清培养液中丙氨酸转氨酶(GPT)、天冬氨酸转氨酶(GOT)、乳酸脱氢酶(LDH)、超氧化物歧化酶(SOD)等酶活性，丙二醛(MDA)含量及肝细胞的存活率。结果表明：III组肝细胞培养液中GOT、GPT、LDH、SOD、MDA值及细胞存活率与I组相比无明显变化(P＞0.05)，说明800 μg/mL虎杖提取物没有细胞毒性，可用于后续试验；与II组相比，IV组中800 μg/mL虎杖提取物处理组的效果优于其他2个浓度组，可以极显著降低培养液中GOT值(P<0.01)，显著降低培养液中GPT、LDH值(P<0.05)，显著提高肝细胞的存活率(P<0.05)，而MDA含量和SOD值差异无统计学意义(P＞0.05)；与II组相比，V组中400 μg/mL虎杖提取物效果优于其他2个浓度组，可以极显著降低培养液中GOT值(P<0.01)，显著降低培养液中LDH值(P<0.05)，显著提高肝细胞的存活率(P<0.05)，但GPT值、MDA含量、SOD的差异无统计学意义(P＞0.05)；与II组相比，VI组中800 μg/mL虎杖提取物效果优于其他2个浓度组，能极显著降低培养液中GOT、GPT、LDH在肝细胞中的释放(P<0.01)，显著降低培养液中MDA含量(P<0.05)，显著提高肝细胞的存活率(P<0.05)。综合以上结果，以VI组中800 μg/mL的虎杖提取物效果最好，能有效抑制CCl4所造成的肝细胞损伤，其机制可能与其抗氧化作用有关。     

CCl4诱导的建鲤精密肝切片损伤模型的构建 及CYP1A对肝损伤的影响

为了评价CYP1A在四氯化碳(CCl_4)诱导的建鲤(Cyprinus carpio.Jian)急性肝损伤中的作用,利用精密肝切片(precision-cut liver slices,PCLS)技术,构建了CCl4诱导的建鲤精密肝切片体外损伤模型。研究中通过测定精密肝切片的增值活力、生化指标、肝组织中CYP1A的m RNA表达水平来探讨CYP1A对肝损伤的调节作用。研究结果显示,4～24 mmol·L~(-1) CCl_4作用4 h后,建鲤精密肝切片培养上清液的谷丙转氨酶(GPT)、谷草转氨酶(GOT)、乳酸脱氢酶(LDH)含量升高,切片匀浆中和丙二醛(MDA)大量产生,超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽(GSH)水平下降,其中,浓度为12mmol·L~(-1)的CCl_4,损伤4h,肝切片的活力维持在65%以上,可以作为造模的条件;75μmol·L~(-1)α-萘黄酮作用精密肝切片6h后,肝组织中CYP1A的m RNA表达被显著抑制,生化指标显著改善。研究结果表明,CYP1A与CCl_4诱导的建鲤肝损伤关系密切,抑制CYP1A的表达可能对肝损伤有保护作用。     

猪苓多糖对四氯化碳诱导的建鲤肝细胞损伤中生化指标及CYP3A表达的影响

采用胰酶消化法分离原代建鲤肝细胞并进行培养,用四氯化碳(CCl4)构建建鲤肝细胞损伤模型,以3种不同浓度的猪苓多糖进行干预,检测肝细胞培养液中丙氨酸转氨酶(GPT)、天冬氨酸转氨酶(GOT)、乳酸脱氢酶(LDH)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)的含量及肝细胞存活率;收集肝细胞进行RNA提取,并用RT-PCR法测定CYP3A基因表达情况。结果表明:以前处理组中质量浓度为0.8mg/mL的猪苓多糖效果最好,与CCl4组相比,显著降低了GOT、GPT、MDA在肝细胞中的释放;极显著降低了LDH在肝细胞中的释放;显著升高了肝细胞中SOD活性值;显著提高了肝细胞的存活率;显著诱导了CYP3A mRNA的表达。这说明猪苓多糖能有效抑制CCl4所造成的建鲤肝细胞损伤。     

建鲤体内外急性肝损伤模型的建立

以四氯化碳(CCl4)为肝毒剂,建立建鲤体内外急性肝损伤模型.体内,采用腹腔注射法造模,按0.1 mL/10g一次性分别注射0、6.25％、12.5％和15％ CCl4-橄榄油溶液(v/v),于造模后24 ～ 144 h取血,测定建鲤血清中谷丙转氨酶(GPT)、谷草转氨酶(GOT)、乳酸脱氢酶(LDH)和丙二醛(MDA)水平;体外,0、2、4、8、16、32 mmol·L-1 CCl4分别作用于原代培养的建鲤肝细胞4h后,用噻唑蓝(MTT)法检测细胞生存状况,同时收集细胞培养上清,测定其GPT、GOT、LDH、MDA、超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽(GSH)活力.结果显示,12.5％、15％ CCl4-橄榄油溶液腹腔注射建鲤24 h后即能引起血清中GOT、GPT和MDA显著升高,15％ CCl4溶液造模组48 h能显著提高血清中LDH水平,4个指标均在CC14作用96 h后恢复到接近正常水平;8～ 32 mmol·L1 CCl4作用体外培养肝细胞4h时,细胞上清中GPT、GOT、LDH和MDA含量显著升高、SOD和GSH活力显著下降,肝细胞存活率显著下降,分别为空白对照组的66.29％、54％和37％且有剂量依赖性.结果表明,分别采用15％ CCl4-橄榄油腹腔注射建鲤72 h和8 mmol·L-1 CCl4作用体外培养肝细胞4h可以构建体内外急性肝损伤模型.     

枸杞多糖对四氯化碳致建鲤急性肝损伤的保护作用

研究枸杞多糖(LBP)对四氯化碳诱导建鲤肝组织急性损伤的保护作用。将建鲤随机分为6个组,即空白对照组(CK)、模型组(CCl4)、枸杞多糖药物对照组(LBP CK)、处理组(LBP 0.1 g·kg-1、0.5 g·kg-1、1.0g·kg-1),连续饲喂60 d后,模型组及处理组按体重0.05 m L·10g-1体内注射30%CCl4-植物油混合液,72 h后收集肝组织及血液,检测谷丙转氨酶(GPT)、谷草转氨酶(GOT)、乳酸脱氢酶(LDH)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、总蛋白(TP)、白蛋白(Alb)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、谷胱甘肽(GSH)、总抗氧化能力(T-AOC)等一系列生化指标。研究结果表明:腹腔注射30%CCl4-植物油可诱导建鲤急性肝组织损伤。1.0 g·kg-1的枸杞多糖能有效降低建鲤血清中GPT、GOT、LDH活性及肝组织中MDA含量,显著提高肝组织中T-AOC、CAT、GSH-PX、SOD、GSH及TP含量(P0.05);0.5 g·kg-1枸杞多糖对血清中GPT的降低及肝组织中SOD、T-AOC和Alb的提高均有显著作用(P0.05);0.1 g·kg-1枸杞多糖对血清及肝组织中生化指标无显著效果。综上结果,认为枸杞多糖对四氯化碳致建鲤肝损伤具有一定保护作用,可以应用于鱼类肝损伤的防治。     

丙氨酰-谷氨酰胺对建鲤体外培养淋巴细胞增殖的影响

【目的】探讨丙氨酰-谷氨酰胺（Ala-Gln）对免疫抑制和应激建鲤体外培养淋巴细胞增殖的调控作用。【方法】通过对建鲤注射环磷酰胺和皮质醇来建立免疫抑制和应激模型,以注射生理盐水为对照,分离头肾、脾脏和外周血淋巴细胞进行体外培养,测定培养液中不同浓度Ala-Gln（0.0,2.0,4.0,6.0,8.0和10.0 mmol/L）对淋巴细胞转化率的影响。【结果】免疫抑制模型及应激模型中,建鲤头肾、脾脏和外周血的淋巴细胞转化率均显著低于对照组（P<0.05）,Ala-Gln浓度在0.0～8.0 mmol/L时,可以促进免疫抑制建鲤的淋巴细胞增殖（P<0.05）,在0.0～6.0 mmol/L 时,可以促进应激建鲤的淋巴细胞增殖（P<0.05）,随着Ala-Gln浓度的进一步增大,淋巴细胞转化率不再继续增大（P＞0.05）。【结论】Ala-Gln对离体培养免疫抑制和应激条件下的建鲤淋巴细胞增殖具有明显的促进作用,是有潜力的鱼用抗应激免疫增强剂。     

丙氨酰-谷氨酰胺对建鲤的适宜投喂模式

【目的】探讨丙氨酰-谷氨酰胺(Ala-Gln)对建鲤适宜的投喂模式。【方法】以初始质量(33.52±0.17)g的建鲤鱼种为研究对象,在室内单循环养殖系统中进行8周生长试验,分别配制添加0.0g/kg(对照饲料)和5.0g/kg(试验饲料)Ala-Gln的等氮(350g/kg粗蛋白)、等能(17kJ/g)饲料,采用5种不同的Ala-Gln投喂模式(Ⅰ.连续8周投喂对照饲料(对照组);Ⅱ.试验饲料2周间隔投喂;Ⅲ.前4周投喂试验饲料,后4周投喂对照饲料的4周间隔投喂;Ⅳ.前4周投喂对照饲料,后4周投喂试验饲料的4周间隔投喂;Ⅴ.8周连续投喂试验饲料),研究Ala-Gln投喂模式对建鲤生长、饲料利用和体成分的影响。【结果】Ala-Gln连续投喂和间隔投喂时,建鲤的生长性能均显著高于对照组(P0.05),2周间隔投喂组建鲤的平均增质量率和特定生长率均显著高于4周间隔和连续8周投喂组(P0.05),2组4周间隔投喂组间无显著差异(P0.05),但前4周投喂试验饲料的4周间隔投喂组建鲤的平均增质量率和特定生长率高于8周连续投喂组(P0.05),2周间隔投喂组和后4周投喂试验饲料的4周间隔投喂组建鲤的脏体比显著低于对照组(P0.05);在Ala-Gln的4种不同投喂模式下,建鲤的摄食率均显著高于对照组(P0.05),2周间隔投喂组和前4周投喂试验饲料的4周间隔投喂组建鲤的蛋白效率显著高于对照组(P0.05),2周间隔投喂组和前4周投喂试验饲料的4周间隔投喂组建鲤的饲料系数显著低于对照组和连续8周投喂组(P0.05);只有8周连续投喂组建鲤的白肌粗蛋白质含量显著高于对照组(P0.05)。【结论】在本试验条件下,饲料中添加Ala-Gln可提高建鲤的生长、饲料利用和白肌粗蛋白质含量,但不同投喂模式间有显著差异,从建鲤生长性能、饲料利用和体组成的角度,并结合经济性和适用性等进行考虑,建议采用2周间隔投喂模式或前4周投喂添加Ala-Gln饲料的4周间隔投喂模式。     

建鲤催乳素基因全长cDNA的克隆及序列分析和组织表达

为了解催乳素(prolactin,PRL)的基因序列以及在建鲤渗透调节组织中的表达情况,采用同源克隆和末端快速扩增(rapid amplication of cDNA ends,RACE)的方法分离克隆了建鲤(Cyprinus carpiovar.Jian) PRL基因全长cDNA,得到1 028 bp的全长cDNA,包括633 bp的开放阅读框(ORF),51 bp 的5′末端非编码区(UTR)以及344 bp的3′末端非编码区(UTR)。对该基因序列和推测的氨基酸序列进行同源性比对和系统分析显示：建鲤与其它硬骨鱼类该基因的氨基酸序列相似度为55.02%~94.76%,与草鱼(Ctenopharyngodon idella)相似度最高(94.76%),与齐口裂腹鱼(Schizothorax prenanti)、斑马鱼(Danio rerio)相似度稍低,与红鳍东方鲀(Takifugu rubripes)的相似度较低(55.02%),表明不同物种间PRL的氨基酸序列具有较高的保守性。用实时定量PCR (RT PCR)检测该基因在建鲤脑垂体、脑、肠、鳃、性腺、肝、脾、肾中PRL的相对表达量,其中脑垂体最高,其次是肝、鳃、脾、脑、肠、肾,在性腺中也有较低的表达量,表明脑垂体是建鲤PRL基因的主要表达场所,在性腺、肝、脾的表达说明其在鱼体内除了渗透调控可能还存在多种生理功能。     

锈色粒肩天牛幼虫的COⅠ、COⅡ、Cytb和28S基因片段序列分析

  目的  基于分子生物学手段，探讨可快速准确鉴别锈色粒肩天牛Apriona swainsoni幼虫与其他天牛幼虫的目标基因，为该保健昆虫的食药用安全提供保障。  方法  利用线粒体COⅠ、COⅡ、Cytb基因和28S细胞核基因的通用引物分别克隆获得4种基因片段，并进行同源序列检索、多重比对、序列信息分析及进化树构建。  结果  基因克隆最终获得锈色粒肩天牛4种基因序列的片段大小分别为817、545、434和1 088 bp。特殊位点分布结果显示:28S的保守位点占比最高，其后依次为Cytb、COⅠ和COⅡ，变异率则正好相反。COⅠ、COⅡ和Cytb基因片段的碱基组成和替换信息特点均表现为A+T含量>G+C含量，颠换高于转换，28S基因片段则表现为A+T含量  结论  COⅠ、COⅡ、Cytb和28S基因均可作为鉴定该虫的分子生物学参考依据。     

桂花OfPSY、OfPDS和OfHYB基因启动子克隆及表达特性分析

  目的  探究高温和外源脱落酸对桂花Osmanthus fragrans类胡萝卜素生物合成的3个相关基因,包括八氢番茄红素合成酶基因(PSY)、八氢番茄红素脱氢酶基因(PDS)、β-胡萝卜素羟化酶基因(HYB)的调控作用,为阐释桂花类胡萝卜素代谢调控的机制提供研究基础。  方法  根据桂花基因组数据库的序列,从桂花品种‘堰虹桂’‘Yanhong Gui’中克隆OfPSY、OfPDS、OfHYB基因的启动子序列,并进行生物信息学分析,再构建PCAMBIA3301-LUC载体在烟草Nicotiana benthamiana中瞬时表达,结合高温(37 ℃)和200 mg·L?1脱落酸处理,分析启动子活性。  结果  获得OfPSY、OfPDS、OfHYB基因的部分启动子,其长度分别为1 908、1 521及1 830 bp。作用元件分析表明:3个启动子中均存在TATA-box和CAAT-box等启动子基本元件、光响应元件、脱落酸响应元件以及MYB和MYC结合位点。此外,在OfPSY启动子中,存在赤霉素响应元件;在OfPDS启动子中,存在茉莉酸甲酯响应元件、赤霉素响应元件、厌氧诱导型元件参与防御和胁迫的元件;在OfHYB启动子中,存在生长素、乙烯、茉莉酸甲酯等激素响应元件、低温响应元件和厌氧诱导型元件。烟草瞬时转化试验表明:相对高温能激活OfPSY、OfPDS和OfHYB的启动子活性,脱落酸能激活OfPDS和OfHYB的启动子活性。  结论  高温和脱落酸可能通过调控桂花类胡萝卜素合成基因启动子活性,影响桂花类胡萝卜素的积累。图4表5参28     

大豆生育期E1、E2、E3和E4基因的研究与应用

大豆E1～E4基因作为对大豆生育期影响最大的E系列基因,与大豆品种生态类型密切相关。为总结大豆主要生育期基因E1～E4的研究进展和应用现状,促进中国大豆生育期育种模式的形成,本研究综述E1～E4基因不同变异类型、变异类型鉴定方法和调控大豆光周期机理的研究进展及大豆群体E1～E4基因型分析在大豆品种生长适应性研究中的应用,以期为大豆生育期遗传调控机理的全面深入研究提供参考,同时为适应不同生态区域的大豆遗传育种工作提供依据。     

沙门菌、巴氏杆菌和大肠埃希菌多重PCR检测方法的建立

旨在建立一种可以应用于临床样本同时检测沙门菌、多杀性巴氏杆菌和大肠埃希菌感染的多重PCR方法。根据NCBI上已收录的沙门菌hut基因、多杀性巴氏杆菌 kmt1基因和大肠埃希菌23SrRNA基因的全基因序列,设计并合成3对特异性引物,通过优化多重PCR反应条件,建立能够同时检测3种细菌混合感染的多重PCR诊断方法。特异性分析表明,应用该方法可以从沙门菌、多杀性巴氏杆菌和大肠埃希菌以及3种细菌的混合物中扩增出3条大小分别为286 bp、457 bp和652 bp的特异性条带,其他对照组检测结果均为阴性;敏感性分析表明,该方法对沙门菌、多杀性巴氏杆菌和大肠埃希菌的最低检出量分别为1.77×10　、1.99×10　、2.01×10　 CFU/mL;人工模拟感染样本检测表明,该方法能从混合感染的病料中检测出3种病原菌。可见：所建立的多重PCR方法具有特异性强,敏感度高,稳定性好的特点,可以有效检测沙门菌、多杀性巴氏杆菌和大肠埃希菌的混合感染。     

苹果GMP、GME和GGP基因的克隆与表达分析

【目的】克隆苹果GDP-甘露糖焦磷酸化酶(GDP-mannose pyrophosphorylase,GMP)、GDP-甘露糖-3′,5′-表异构酶(GDP-mannose-3′,5′-epimerase,GME)和GDP-1-半乳糖磷酸酶(GDP-L-galactose-1-phosphate phosphorylase,GGP)的基因序列并分析其表达特性,探讨GMP、GME和GGP基因在抗坏血酸(Ascorbic acid,AsA)合成过程中的作用。【方法】以‘嘎啦’苹果幼果为材料,分别运用RT-PCR和PCR法克隆GMP、GME和GGP基因的cDNA和gDNA全长序列,对其序列及编码产物进行生物信息学分析,并采用实时荧光定量PCR,分析以上基因在苹果不同组织(幼叶、成熟叶、衰老叶、花、幼果、成熟果和根)中的表达情况。【结果】RT-PCR法克隆及序列分析显示,GMP基因的cDNA全长为1 280bp,编码361个氨基酸,gDNA序列中含有3个内含子;GME基因的cDNA全长为1 323bp,编码376个氨基酸,gDNA序列中含有5个内含子;GGP基因的cDNA全长为1 677bp,编码446个氨基酸,gDNA序列中含有6个内含子。基因表达的实时荧光定量PCR分析表明,GMP、GME和GGP在苹果不同组织中均有表达,在叶片中的表达量高于其他组织,且表达量随着叶片的生长逐渐升高;在花、幼果和成熟果中,GMP、GME和GGP的表达量差异不明显。【结论】克隆获得了苹果的GMP、GME和GGP基因,其在苹果不同组织的生长过程中有不同的表达特性,但GME的表达水平远远低于GMP和GGP,这在一定程度上表明,在苹果AsA的生物合成过程中,GMP、GGP较GME有更重要的作用。     

红花檵木LcCHI基因的克隆、表达分析及转化研究

从红花檵木(Loropetalum chinense var.rubrum)叶片中克隆获得查尔酮异构酶(Chalcone isomerase,CHI)同源基因,命名为LcCHI。LcCHI基因的开放阅读框长度为657 bp,编码218个氨基酸。氨基酸序列同源性比对结果表明,红花檵木LcCHI与包括玫瑰(Rosa rugosa)、月季(Rosa chinensis)在内的多种植物CHI的氨基酸序列同源性很高,氨基酸一致性均在75%以上。CHI负责酶催化活性的5个氨基酸残基位点也在不同植物的CHI氨基酸序列中高度保守。LcCHI蛋白的三级结构主要由8个α-螺旋和11个β-折叠片层形成的球状蛋白,其催化核心区域具有两个硝酸根配基结合位点。实时荧光定量PCR结果表明,LcCHI在不同组织中均有表达,其中在根中表达量最高,而成熟叶中表达量最低。成功构建了pLcCHI-SUPER1300过表达载体,在拟南芥中异源表达并获得了LcCHI基因过表达的转基因株系,为进一步分析LcCHI基因功能创造条件。     

黄花烟草(Nicotiana rustica)、迪勃纳氏烟草(Nicotiana debneyi)与Nicotiana tabacum K326互交亲和性的荧光鉴定

利用荧光显微镜对烟草互交组合Nicotiana tabacum K326×Nicotiana rustica与Nicotiana tabacum K326×Nicotiana debneyi授粉后花粉管生长部位和形态进行观察比较。结果显示,在正交组合中,N.rustica、N.debneyi花粉管大量生长进入Nicotiana tabacum K326花柱离柱头3/4区间后停止生长,在停止生长部位弯曲、膨胀,形成大量不规则胼胝质颗粒;用蒙导法、切割花柱法、已开放花朵授粉及已开花朵重复涂抹授粉等方法均未能有效促进2个父本花粉管在K326花柱中生长,而蕾期授粉花粉管可以生长进入子房,但授粉后没有获得种子;在反交组合中,K326花粉管可以在N.rustica、N.debneyi花柱中大量生长并进入子房,N.debneyi授粉后获得种子,种子萌发率为(49.67±1.53)%。