cry Ia基因小麦高效表达载体的构建

利用在禾谷类作物中表达效率较高的启动子Ubi对含目的基因cryIa的现有载体进行了改造,并引入了筛选标记基因bar,为提高目的基因的表达水平,还在目的基因5′端引入了Ω和Kozak序列,3′端引入了poly(A)序列。成功构建了适用于小麦的抗虫基因植物表达载体pGU4ABBar,该载体含有顺向连接的Ubi-cryIa及Ubi-bar基因表达盒,可用于基因枪、花粉管通道法等介导的小麦遗传转化,人工合成的苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白基因cryIa可以编码对鳞翅目昆虫具有毒杀作用的蛋白。     

远缘杂种鉴定方法在小麦育种中的应用

远缘杂交是小麦导入外源基因的有效方法。综述了导入外源基因的小麦杂种鉴定方法,如形态学标记、细胞学鉴定、生化标记、原位杂交方法和分子标记等;展望了远缘杂种鉴定方法在小麦育种中的应用前景。     

干旱胁迫下不同品种小麦4种功能基因的表达模式及相关生理指标分析

采用实时荧光定量PCR(Real-time PCR)对干旱胁迫下脂质转移蛋白基因(TaLTP1)、膨胀素基因(TaEXPB23)、水通道蛋白基因(TaAQP7)和果聚糖6-果糖基转移酶基因(Ta6-SFT)在4种小麦叶片中的表达情况进行分析;通过测定相对水分质量分数和果聚糖质量分数来判断小麦生长发育状况。结果显示:干旱胁迫48h内,4种基因在不同抗旱性小麦叶片中的表达模式不同,干旱敏感型小麦中4种基因的相对表达量先上升后下降,恢复到正常水平;干旱耐受型小麦中4种基因的相对表达量先上升后下降,但仍维持较高表达水平;干旱耐受型小麦具有较高的相对水分质量分数和果聚糖累积量。以上结果表明,4种基因参与小麦干旱胁迫应答,4种基因的表达模式可以作为鉴定小麦抗旱的分子指标。本研究可为准确快速地鉴定小麦品种抗旱性提供重要分子依据。     

转TaCOMT-3D基因小麦的农艺性状评价

TaCOMT-3D基因是小麦木质素合成的关键基因,也是小麦抵御纹枯病菌侵染的重要基因。为了评估转基因小麦中TaCOMT-3D基因组成型表达对农艺性状的影响,4个遗传稳定的转基因株系及其受体对照扬麦16用于TaCOMT-3D基因检测、不同器官表达分析验证、纹枯病抗性鉴定、小区产量试验以及主要农艺性状的考察。结果显示,转基因株系均能检测到导入的TaCOMT-3D基因并且该基因能组成型表达;转基因株系与受体对照扬麦16相比,纹枯病抗性显著提高;除了部分转基因株系的主穗穗长、主穗粒数、籽粒蛋白含量与受体对照差异显著外,转基因小麦的生育期、、株高、产量性状、主穗性状和籽粒性状与受体对照均没有显著差异。试验结果表明,TaCOMT-3D基因的组成型表达对转基因小麦的主要农艺性状影响不明显。     

基因枪介导的转基因小麦的获得与鉴定

运用基因工程技术将外源抗病基因直接导入具有优良农艺性状的小麦品种中,能够获得抗赤霉病小麦新品种。采用基因枪介导的共转化法,以bar基因为筛选标记,将几丁质酶基因导入长江中下游小麦栽培品种郑麦9023,T0代经过PCR鉴定,获得6株阳性植株,表明几丁质酶基因已整合到小麦基因组中。     

枯草杆菌果聚糖蔗糖酶基因转化小麦的研究

 【目的】尝试将枯草杆菌果聚糖蔗糖酶基因（SacB）导入小麦品种（系）02-371、02-207、郑麦9023和东农7742以提高其耐旱性。【方法】利用农杆菌介导法转化小麦幼胚愈伤组织，将SacB基因导入4个小麦品种，并对转化植株进行PCR和Southern杂交检测。【结果】SacB基因已整合到受体小麦的基因组中。转基因植株整合目的基因的拷贝数多为1～2个。4个受体小麦品种（系）02-371、02-207、郑麦9023和东农7742的转化频率分别为0.88%、1.48%、1.04%和1.23%。RT-PCR检测结果表明，SacB基因在部分转基因植株中得到表达，并使转基因小麦植株的耐干旱胁迫能力明显提高。【结论】向小麦中导入枯草杆菌SacB基因可增强其耐旱性。     

基因枪法将细胞周期蛋白基因CycD2导入小麦的研究

以小麦品种绵阳11作为基因枪转化的靶材料,用含有细胞周期蛋白基因CycD2和新霉素磷酸转移酶基因NPTII的质粒PBI121轰击小麦成熟胚性愈伤组织,在含有遗传霉素G418的筛选培养基对愈伤组织进行筛选后诱导得小麦再生植株,经PCR检测有4个转基因小麦植株呈阳性,South-ern-blot鉴定后进一步证明CycD2基因已经被成功导入小麦并整合到小麦基因组中。     

簇毛麦抗白粉病新种质的选育

小麦白粉病是小麦的主要病害之一。以簇毛麦为抗源,采用杂交与辐射、组织培养相结合的方法,将簇毛麦的抗白粉病基因导入小麦。经抗病鉴定、系统选育和细胞学分析,选育出农艺性状较好、抗白粉病的小麦新种质。经DNA分析,证明簇毛麦抗白粉病基因(或染色体片断)已被导入小麦品种。     

单芒山羊草染色体组优异基因发掘

单芒山羊草是小麦遗传改良的优异基因源,为发掘其基因组优异基因,以中国春小麦为对照,对一套中国春-单芒山羊草附加系进行农艺性状调查、抗病性鉴定以及品质性状测定。结果发现,单芒山羊草5N染色体上含有矮秆基因,1N和7N染色体上含有密穗基因;1N染色体上具有抗小麦条锈病基因;4N染色体导入小麦能够显著提高小麦品质。这些优异基因可用于小麦染色体工程育种中。     

黑麦优良基因在小麦育种中的应用

黑麦属蕴藏着许多对改良小麦有用的基因资源,将黑麦的优良基因导入小麦不仅可以拓宽小麦的遗传基础,而且可以有效改良小麦的产量、品质、抗性及适应性等性状。为了了解目前黑麦在小麦遗传育种中的研究现状,本文从黑麦基因导入小麦的途径、黑麦基因资源在小麦中的鉴定以及黑麦基因资源在小麦中的应用前景三方面总结论述了黑麦优良基因在小麦育种中的应用,以期促进黑麦优良基因向小麦中转移,深入开拓和利用黑麦基因资源。     

拟南芥两个MYB基因标签融合蛋白转基因植株的获得和鉴定

[目的]进行染色体免疫共沉淀（ChIP）试验,挖掘MYB类基因At3g11280和At5g05790所调控的下游基因。[方法]在构建了标签融合蛋白植物表达载体的基础上,利用农杆菌介导的转化将这些载体转入拟南芥植物中,获得转基因植株,并用Western blotting检测标签融合蛋白在转基因植株中的表达。[结果]拟南芥植株转基因的效率很高,4种标签蛋白融合载体的转化均获得了20株以上的转基因植株。随机对4种转基因植株的8株T1代植株进行Western blotting分析,结果表明4,种转基因植株中均鉴定出阳性植株。融合蛋白的条带大小在30 kD左右,将显色信号条带与Marker比对,显示条带大小与预测蛋白大小相符。[结论]这些有融合蛋白表达的转基因植株为ChIP试验的进行提供了重要材料。     

The Function Identification of the Candidate Disease-Resistance Gene in Cabbage

In order to understand the function of TuR2, a candidate disease-resistance gene was isolated from cabbage, we transformed it into mustard （Brassicajuncea L. Linshicaoyaozi） which was susceptible to TuMV through Agrobacterium tumefacine-mediated method. Transgenic plants were detected by Southern blotting and Northern blotting. Our results confirmed that the TuR2 gene had been integrated into the mustard genome, and it showed different expression levels among primary transplants （T0）. The primary transplants （T0） and the first progenies of transgenic plants （T1） were inoculated with TuMV in a greenhouse. The transgenic plants had high TuMV-resistance, whereas the serious virus disease symptom was observed in CK （no transformation plants）. The TuR2 gene in the first progenies of transgenic plants （T1） showed dominant monogenic inheritance. Compared with CK, the progenies containing TuR2 gene had stronger resistance to TuMV. The TuR2 gene which was isolated from cabbage had the function of TuMV-resistance.     

番茄双抗TMV和CMV基因工程的研究

在ＴＭＶ外壳蛋白（ＣＰ）基因的５′和３′端分别合成寡聚核苷酸引物Ｐ１和Ｐ２，并分别引入ＣｌａＩ和ＢａｍＨＩ位点，采用ＰＣＲ技术扩增ＴＭＶＣＰ基因，用ＣｌａＩＢａｍＨＩ消化后重组到ｐＢｌｕｅ ｓｃｒｉｐｔＫＳ＋中，并将该基因与ＣＭＶＣＰ基因重组在同一个表达载体ｐＥ３上获得双价ＣＰ基因表达载体ｐＥＴＣ２，转化番茄，获得再生植株。通过点杂交、ＰＣＲ检测和Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交，证实２、１２和１３号为转ＴＭＶ和ＣＭＶＣＰ基因的工程植株。工程植株在温室中表现正常，比对照植株表现出明显的抗性。     

转Hpa110-42小麦分子鉴定及赤霉病抗性功能评价

【目的】筛选出抗赤霉病转Hpa110-42小麦植株,为抗赤霉病小麦新品种的选育提供材料。【方法】以转Hpa110-42小麦T2植株和受体扬麦158为供试材料,通过PCR、Southern blotting、RT-PCR等分子技术进行外源基因的整合与表达检测,并采用单花滴注法鉴定转基因小麦的赤霉病抗性,同时探讨其抗性生理。【结果】经分子检测证明,外源Hpa110-42以1—3个拷贝整合到小麦基因组中并能够稳定遗传,在转录水平上也能正常表达。赤霉病抗性鉴定表明,株系T2-17、T2-15、T2-68、T2-44和T2-36的平均病小穗率极显著低于扬麦158。除T2-17外,其余株系的平均病小穗率极显著高于苏麦3号,均未达到苏麦3号的抗性水平。T2-17株系平均病小穗率显著低于T2-15、T2-68和T2-44,极显著低于T2-36、T2-11和T2-20株系。抗性生理分析显示,接种赤霉菌孢子后,所有植株的苯丙氨酸解氨酶（PAL）、几丁质酶、β-1,3-葡聚糖酶活性均上升,但转基因高抗植株比扬麦158上升更快,而感病株上升相对缓慢;尽管可溶性蛋白含量呈下降趋势,但转基因植株的高抗植株始终高于其它株。β-1,3-葡聚糖酶活性和可溶性蛋白含量与赤霉病抗性等级值呈极显著负相关。【结论】外源Hpa110-42整合到小麦基因组中,能稳定遗传并正常表达,正向参与了小麦赤霉病抗性调控,获得了抗赤霉病转Hpa110-42小麦植株。     

转基因改良水稻的抗螟虫性研究

以质粒 pCUSBK -HPT作抗虫基因供体 ,优良籼型恢复系蜀恢 5 2 7为受体 ,采用基因枪转化法 ,获得了转抗虫基因sbk的植株。室内和田间试验发现转基因植株抗虫性得到提高。分子证据表明外源基因在受体植株中的遗传是稳定的。外源基因的转入没有改变受体的优良农艺性状     

农杆菌介导的水稻草矮病毒NS6基因的转化

水稻草矮病毒(Ricegrassystuntvirus,RGSV)RNA6片段毒义链编码的非结构蛋白NS6,与病害症状密切相关,被称为病害特异蛋白.因此,应用农杆菌介导法,选取对RGSV表现不同抗性的台农67、中花6号、中花12号、中花15号、台中1号、合系28和063817个水稻品种,以其未成熟胚或成熟胚预培养4d后,诱导生长旺盛的愈伤组织为外植体,将NS6基因导入其中,对影响水稻再生及农杆菌转化的主要因素进行了比较研究,并获得了转NS6基因工程植株.结果表明,以未成熟胚为受体,获得的抗性愈伤组织转化率明显高于成熟胚;水稻不同品种对农杆菌转化反应不同;添加一定浓度乙酰丁香酮和葡萄糖,可提高抗性愈伤组织形成率;选用G418进行抗性筛选能获得转NS6基因再生植株,用卡那霉素筛选产生的愈伤组织则未能获得再生植株.     

农杆菌介导获得转水稻草矮病毒NS3基因水稻植株

构建了包含水稻草矮病毒(Ricegrassystuntvirus,RGSV)NS3基因的植物表达载体pCBTNSv3,应用农杆菌介导法,将NS3基因导入水稻愈伤组织中,获得了转RGSVNS3的水稻转基因植株,总DNA经PCR、Southern点杂交鉴定,初步证实NS3基因已整合到水稻基因组中.     

RNA干涉水稻端粒酶再生植株的初步研究

依据水稻端粒酶基因的相关生物学信息,构建了含有水稻端粒酶序列RNA干扰结构的植物表达载体pC am 23A-1-2,并利用农杆菌介导法将目的基因导入到粳稻品种日本晴中,获得了78个独立转化子,共165棵转基因植株。通过PCR和Southern杂交分析,证明RNA干扰结构已整合进水稻基因组中;应用染色体末端限制性片段分析法,显示在转基因水稻中端粒DNA序列长度有逐代缩短的趋势,初步证明这些转基因水稻中端粒酶亚基已失活,但是T0和T1代转基因水稻植株的主要农艺性状没有发生明显变化。     

利用RNAi抑制B-hordein合成降低大麦籽粒蛋白质含量

【目的】通过RNAi策略抑制大麦籽粒B-hordein的表达,获得高氮肥水平下籽粒蛋白质含量降低的转基因大麦新种质,探索大麦品质改良新途径。【方法】采用同源PCR技术克隆大麦B-hordein核心保守序列,通过Gateway技术构建大麦B-hordein的RNAi植物表达载体pBract207-zz-gp4,利用农杆菌介导法转化大麦Golden Promise幼胚,获得转基因植株。通过PCR检测、Southern杂交验证RNAi构件在转基因大麦及其后代基因组的整合情况。采用半定量RT-PCR分析转基因大麦花后不同发育时期B-hordein转录表达情况。基于近红外谷物分析仪测定蛋白质含量,并进行醇溶蛋白SDS-PAGE检测,以筛选蛋白质含量降低的转基因大麦株系。开展氮肥运筹相关试验,检验RNAi效率及高氮肥水平下转基因大麦蛋白质含量变化情况。【结果】获得大麦B-hordein片段2条（Gp4和Gp5）,测序结果表明该片段大小为349 bp,聚类分析表明该序列跟已知大麦醇溶蛋白基因同源性最高达92%,与该基因已登录的mRNA序列同源性高于98%,确认所得片段为大麦B醇溶蛋白基因片段。利用Gateway技术将Gp4片段正反向插入载体pBract207,反向重复序列用i18 和 iv2 intron连接,构建了Ubi启动子驱动的大麦B-hordein RNAi植物表达载体 pBract207-zz-gp4。通过农杆菌介导转化大麦Golden Promise幼胚,结合目标基因及筛选标记基因的PCR验证,获得含有RNAi构件及筛选标记基因的转基因大麦株系11个。Southern杂交检测表明RNAi构件已经稳定整合到T₂/T₃转基因大麦基因组。随机选取6个T₃转基因大麦株系,半定量RT-PCR结果表明花后不同发育时期转基因大麦籽粒B-hordein表达水平明显低于非转基因对照,20 d时转基因株系表达量不仅相比同期对照降低28.19%-55.19%,而且在各时期中也最低。利用随机选取的T₁和T₃籽粒进行蛋白质含量测定表明,8个转基因大麦株系的蛋白质含量相比非转基因对照显著降低,SDS-PAGE电泳结果显示与非转基因相比,转基因各株系B-醇溶蛋白比率有不同程度降低,其中3个株系B-醇溶蛋白比率降低明显,平均减幅为49.42%。采用蛋白质含量降低的转基因大麦株系RNAi-20开展氮肥运筹试验,结果表明,高氮肥水平HN₂及HN₃处理,该株系蛋白质含量显著低于非转基因对照;施以等量高氮肥时,伴随氮肥后移（HN₂到HN₃）,该株系总蛋白含量相对非转基因对照逐渐降低。SDS-PAGE电泳结果显示B醇溶蛋白含量降低,电泳带型发生变化。【结论】RNAi技术能抑制籽粒B-hordein表达,降低B-醇溶蛋白含量,高氮肥水平下能显著降低大麦蛋白质含量。