巨桉EgrCBF3基因的克隆与逆境响应表达分析

【目的】克隆巨桉(Eucalyptus grandis)抗逆相关基因EgrCBF3(GenBank登录号:JQ068829)的全长cDNA序列,分析EgrCBF3在低温、干旱、脱落酸(ABA)处理和高盐条件下的表达。【方法】利用RT-PCR结合RACE技术,克隆巨桉抗逆相关基因EgrCBF3全长cDNA序列;分析正常条件下,巨桉根、茎和叶中EgrCBF3的表达情况;同时采用qRT-PCR,分析不同低温(0,2,4,6,8℃)和4℃处理不同时间(2,4,8,24和48h),以及干旱、ABA和高盐等逆境条件下EgrCBF3的响应表达情况。【结果】EgrCBF3cDNA全长1 161bp,含有1个675bp的ORF,编码224个氨基酸,包含1个AP2结构域。该基因编码的蛋白与蓝桉中的CBF蛋白同源性最高,达97%。EgrCBF3在巨桉的叶、茎和根中均有表达,但表达量无明显差异。对不同低温和4℃不同处理时间条件下EgrCBF3表达的qRT-PCR分析表明,EgrCBF3基因受低温诱导,在2℃条件下诱导表达量最强;在4℃条件下随低温时间的延长,其诱导表达特性不变,仅略有波动。在100μmol/L ABA、200mmol/L NaCl和干旱处理条件下,EgrCBF3的表达不受ABA和盐胁迫的影响,但在干旱胁迫下被诱导。【结论】EgrCBF3响应低温胁迫诱导,同时可能也参与了干旱胁迫的逆境响应机制。     

苎麻BnbZIP1转录因子基因的克隆与表达特征分析

【目的】克隆苎麻转录因子基因BnbZIP1,分析其序列及表达特征,同时进行原核表达以及亚细胞定位分析。【方法】根据苎麻转录组测序中的Unigene48047片段序列,采用RT-PCR结合RACE技术克隆该基因的全长cDNA序列,并进行生物信息学分析;利用Real-time PCR分析该基因在不同组织和不同胁迫条件下表达特征;构建原核表达载体,进行原核表达;构建含EGFP的融合表达载体,观察其亚细胞定位情况。【结果】苎麻BnbZIP1的cDNA全长为2 071 bp,开放读码框为1 407 bp,编码468个氨基酸,推导该多肽的等电点和分子量为7.12和51.57 kD,与毛果杨（XP_002307972）的bZIP基因氨基酸序列的相似性最高,达到93%;IPTG诱导产生的重组蛋白相对分子量约为52 kD,与理论值一致;亚细胞定位分析表明其定位在细胞核中;荧光定量PCR分析表明,该基因在苎麻根、茎、茎尖、叶片、雌花和雄花中均有表达,其中,在雄花中表达最高,在根中表达最低,且该基因受ABA、干旱和高盐诱导上调表达。【结论】获得了BnbZIP1的全长cDNA序列,其编码蛋白具有植物bZIP转录因子典型的结构域,且该基因响应ABA、干旱和高盐逆境胁迫,预示该基因可能在植物抗逆反应中发挥着重要的调控作用。     

苎麻ACC氧化酶基因（BnACO1）的克隆及表达

【目的】克隆苎麻中的一个ACO基因（BnACO1）,并对其进行生物信息学分析、表达分析、胁迫应答分析。【方法】通过RT-PCR结合RACE技术从湘苎3号中克隆该基因的全长cDNA序列,利用生物信息学软件对获得的基因序列及编码的蛋白质序列进行分析。利用实时荧光定量PCR分析BnACO1在苎麻不同部位的表达量以及在ABA、干旱和高盐胁迫下的应答。【结果】BnACO1的cDNA序列全长为1 476 bp,其开放阅读框为981 bp,编码326个氨基酸多肽,预测其分子量和等电点分别为36.81 kD和4.95,基因登录号为JX878855。与无花果（AB307720）、香叶天竺葵（U19856）、柿树（AB073009）、梨（JN807390）、猕猴桃（HQ293208）的ACO基因核苷酸序列相似性分别为83%、81%、79%、79%和79%,氨基酸序列的相似性分别为87%、80%、80%、78%和83%。实时荧光定量PCR分析表明苎麻BnACO1在苎麻根、茎、茎尖、叶片、雌花和雄花中均有表达,其中,在雄花中表达最高,在根、茎中表达最低,且该基因受ABA、干旱和NaCl胁迫诱导表达。【结论】获得的BnACO1是ACO家族成员之一,参与ABA、干旱、NaCl胁迫应答,该基因可能在苎麻性别分化中起到一定作用并且在调控苎麻生长发育和应对环境胁迫时具有独特的表达模式。     

辣椒ASR基因的克隆与表达分析

【目的】克隆辣椒ASR（ABA-stress-ripening）基因进行生物信息学分析并探究其在不同组织和非生物胁迫处理下的表达模式,为深入研究ASR基因家族在辣椒果实发育和逆境胁迫中的作用机制提供参考。【方法】以遵辣1号辣椒为材料克隆其ASR基因,对该基因家族成员进行生物信息学分析和系统进化分析,运用实时荧光定量PCR检测其在不同组织及在ABA、高温、高盐和干旱胁迫处理下的表达模式。【结果】克隆的2个辣椒ASR基因分别命名为CaASR2和CaASR3,基因全长分别为987和938 bp,最长开放阅读框（ORF）分别为333和339 bp,分别编码110和112个氨基酸,蛋白分子量分别为12.45和12.73 kD,理论等电点（pI）分别为7.47和6.50,均为亲水性蛋白。结合前人克隆的辣椒CaASR1基因分析,结果显示,CaASRs预测位于细胞核,均含有ABA/WDS特征结构域;基因结构分析结果显示,辣椒ASR基因均含有2个外显子和1个内含子,启动子区域均包含ABA响应元件ABRE。CaASR1、CaASR2和CaASR3氨基酸序列分别与番茄（Solanum lycopersicum）基因组中的ASR蛋白氨基酸序列NP_001269248.1（80.20%）、NP_001307920.1（91.30%）和NP_001234137.1（96.43%）有非常高的相似性,表明其进化的相对保守性。3个ASR基因在辣椒花中表达量最低,在根、茎、叶和种子中表达量中等,但均随着果实的发育表达量逐渐升高,特别是在转色和成熟果实中。ABA、高温、高盐和干旱胁迫处理下,基因的表达量均显著升高（P<0.05）,其中以CaASR3响应最快,且上调表达量高于其他同源基因。【结论】辣椒基因组中3个ASR基因具有ASR基因家族的典型特征,并在辣椒不同组织和非生物胁迫响应中发挥重要作用。     

白菜型油菜MPK12基因克隆及表达分析

【目的】克隆白菜型油菜‘陇油6号’MPK12基因的全长cDNA序列,研究其组织表达特异性,分析MPK12基因在低温、盐、ABA和H_2O_2处理下的表达情况,以阐明MPK12基因在油菜中的生物学功能。【方法】利用RACE技术克隆MPK12基因cDNA全长,并对其全长基因进行生物信息学分析;构建系统发育树,研究其与相似序列的同源性;利用实时荧光定量PCR方法,分析MPK12基因的组织表达特异性以及在低温、盐、ABA和H_2O_2逆境胁迫下的表达情况。【结果】油菜MPK12基因cDNA全长1 395bp,包括5′-UTR 69bp,3′-UTR 207bp,开放阅读框1 119bp,编码372个氨基酸,预测蛋白质分子量42.6ku,理论等电点为7.9,二级结构主要包括α-螺旋和不规则卷曲。多序列比对和系统进化分析表明,油菜MPK12与拟南芥AtMPK12具有很高的同源性,为90.7%。实时荧光定量PCR结果显示,MPK12基因在油菜根、茎、叶、芽和种子中均有表达,没有组织特异性;同时,该基因的表达受低温、盐、ABA和H_2O_2胁迫诱导。【结论】克隆得到油菜MPK12基因,其在油菜适应逆境胁迫过程中发挥作用。     

茶树谷胱甘肽还原酶基因CsGRs的克隆与表达分析

【目的】克隆谷胱甘肽还原酶基因CsGRs,研究CsGRs在茶树抵御不同逆境胁迫中的作用。【方法】在茶树转录组数据库中搜索茶树CsGRs,根据获得的基因片段,设计反转录PCR（RT-PCR）引物和RACE-PCR特异引物,从茶树中克隆CsGRs的cDNA全长序列,并利用在线生物信息学软件对其进行分析。采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）分析CsGRs在茶树不同组织间的表达差异及其在低温、干旱、高盐胁迫和ABA处理下的表达模式,利用分光光度计测定低温胁迫和干旱胁迫下叶片中还原型谷胱甘肽（GSH）的含量变化。【结果】RT-PCR克隆获得CsGR1的cDNA全长,其长度为1 827 bp,包含1 482 bp开放阅读框（ORF）,编码493个氨基酸;RACE扩增获得712 bp和1 624 bp的5′和3′末端序列,拼接并进行RT-PCR验证后得到CsGR2序列,全长2 282 bp,包含1 698 bp ORF,编码565个氨基酸;CsGR1和CsGR2的GenBank登录号分别为KF906411和KF418080。CsGR1和CsGR2编码的蛋白质分子量分别为53.9 kD和61.0 kD,无信号肽位点,均为非分泌性蛋白。亚细胞定位预测CsGR1主要定位在细胞质等亚细胞中,无叶绿体锚定信号肽位点;CsGR2中N-端的71个氨基酸残基具有叶绿体转运信号功能,主要定位在叶绿体上。序列相似性比较显示,CsGR1与其他植物中胞质GR的相似性均在80％以上,而与叶绿体GR的相似性低于60％;CsGR2与其他叶绿体GR的相似性70％以上,与胞质GR的相似性在50％左右。二者在核酸序列和氨基酸序列水平上分别有63.4％和49.9％的相似性,且蛋白质二级结构也具有较高的相似性。系统发育树显示,CsGR1与胞质GR聚为一类,而CsGR2与叶绿体GR聚在一起,且都与葡萄的亲缘关系最近。二者均含有氧化还原二硫键活性位点、谷胱甘肽结合位点以及NADPH结合的Arg保守位点等结构域。CsGR1为胞质GR,CsGR2为双向定位在叶绿体和线粒体上的叶绿体GR。CsGR1在花和根中表达量较高,在叶片和茎中表达量低;CsGR2在叶片和茎中的表达量比在根和花中的表达量高。在短时胁迫处理24 h过程中,成熟叶片在100 μmol•L-1 ABA处理后,CsGR1和CsGR2的表达均被抑制,且CsGR2的抑制作用较显著;在4℃低温胁迫下,CsGR1的表达被抑制,而CsGR2的表达随处理时间延长逐渐被诱导;250 mmol•L-1 NaCl盐胁迫抑制CsGRs的表达,但胁迫24 h时CsGR2的表达被诱导。10%（w/v）PEG胁迫处理茶树8 h,叶片中的CsGRs均被诱导表达,且在复水48 h后CsGR1的表达被显著上调;根中CsGRs的表达在处理和复水48 h过程中均被抑制。随低温胁迫时间延长,茶树叶片中的GSH含量逐渐升高;干旱胁迫也能促进GSH在叶片中的积累,在复水48 h后又恢复到处理前的水平。【结论】克隆了2个茶树CsGRs,2个基因对4℃低温、NaCl盐、10％PEG和ABA处理均具有响应。推测CsGRs在茶树抵御逆境胁迫中起作用。     

小麦逆境胁迫相关基因TaC2DP1的克隆及表达分析

【目的】克隆与逆境胁迫相关的基因,并对其序列特征、进化关系和表达特性进行分析,探讨该基因在小麦抗逆调控过程中的生物学功能,为进一步解析植物的抗逆机制提供候选基因和理论依据。【方法】以cDNA芯片数据获得的水分胁迫诱导上调表达基因EST序列为探针,对小麦EST数据库进行搜索,筛选与探针同源性在97％以上的EST序列,通过电子克隆结合RT-PCR获得该基因cDNA全长,采用生物信息学软件分析比较克隆基因的保守结构域及序列特征;采用MEGA6.0软件构建该基因的系统进化树;将测序正确的该基因片段通过EcoRⅠ和HindⅢ限制性内切酶酶切连接至原核表达载体pMAL-c2X,重组质粒转化大肠杆菌BL21,经终浓度为0.3 mmol·L^-1 IPTG诱导1-5 h后,用SDS-PAGE分析融合蛋白的表达;采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）分析该基因在小麦不同组织间的表达差异及其在低温、干旱、高温和ABA处理下的表达模式。【结果】成功获得小麦cDNA全长序列,命名为TaC2DP1。该基因序列全长为1 356 bp,包含一个1 209 bp的开放阅读框（ORF）,5′端非编码区50 bp,3′端非编码区97 bp,编码402个氨基酸,推导编码蛋白质的预测分子量为43.41 kD,等电点为4.30,属于酸性蛋白,BLAST分析表明,该蛋白含有一个与钙离子结合的结构域,称为C2结构域（C2-domain）。多序列比对及进化树分析表明,TaC2DP1与乌拉尔图小麦TuC2亲缘关系最近,二者具有高度的同源性,其编码的氨基酸一致性达到91%;蛋白质结构预测分析显示TaC2DP1无跨膜螺旋和双硫键,亚细胞定位于细胞质中;成功构建了该基因的原核表达载体pMAL-c2X-TaC2DP1,在IPTG诱导下得到90 kD左右的蛋白,与理论值一致。通过实时荧光定量PCR进行TaC2DP1表达分析,显示该基因在小麦的根、茎、叶、幼穗、未成熟籽粒、胚及胚乳中均有表达,其中在幼穗中表达量最高,在花后5 d籽粒中表达量最低。TaC2DP1可被植物激素ABA诱导而上调表达;干旱胁迫过程中,TaC2DP1受胁迫诱导呈稳定上调表达趋势;高温和低温胁迫过程中,TaC2DP1均在胁迫后的0.5 h迅速诱导上调表达,分别为对照的21和17倍。推测该基因可能参与小麦ABA 信号通路中对逆境胁迫的抗性反应。【结论】获得小麦TaC2DP1的全长序列,其编码蛋白含有与钙离子结合的C2结构域;在低温、干旱、高温和ABA逆境胁迫下,TaC2DP1属于依赖于ABA胁迫响应基因调控网络,可能在干旱、低温和热胁迫中发挥重要作用。     

茶树CsWRKYIIcs转录因子的克隆及功能分析

【目的】以‘陕茶1号’为材料,克隆CsWRKYIIcs转录因子并分析序列特征,了解其在不同组织和非生物胁迫下的表达模式以及转录活性,为深入研究茶树在逆境胁迫中的功能提供理论依据。【方法】根据茶树基因组数据库注释的WRKY序列设计特异性引物,采用RT-PCR技术从‘陕茶1号’中扩增CsWRKYIIcs的cDNA序列,用生物信息工具分析序列的特点,实时荧光定量PCR（qRT-PCR）研究基因的表达模式,用酵母试验验证其转录活性。【结果】获得9条CsWRKYIIcs的cDNA序列,开放阅读框长度分别为561、960、936、978、897、912、720、1 008和969 bp,分别编码186、319、311、325、298、303、239、335、322个氨基酸。除了CsWRKYIIc7缺少锌指序列外,其他CsWRKYIIcs均含有1个WRKY保守结构域和典型的C₂H₂型锌指结构。不同物种中的WRKYIIcs具有相似的保守基序,而茶树CsWRKYIIcs和拟南芥、葡萄等双子叶植物的WRKYIIcs氨基酸序列相似性更高。另外,CsWRKYIIcs启动子区域均预测到多个与非生物胁迫相关的顺式作用元件,意味着其可能参与非生物胁迫响应。qRT-PCR结果表明,9个CsWRKYIIcs在根和花中的表达量高于茎和叶,具有一定的特异性。同时,在干旱、ABA、高温和高盐胁迫下被不同程度的诱导表达,其中CsWRKYIIc1和CsWRKYIIc7的表达量变化显著,与推定的顺式作用元件结果相符。酵母试验表明9个茶树CsWRKYIIcs均具有转录激活活性。【结论】克隆获得9个茶树CsWRKYIIcs转录因子,它们参与了茶树对ABA、干旱、高温和高盐胁迫的响应,也可能发挥转录激活因子的调控作用。CsWRKYIIc1和CsWRKYIIc7可作为候选基因深入研究茶树的抗逆功能。     

小麦逆境胁迫相关基因Ta14S的克隆及表达分析

【目的】克隆与逆境胁迫相关的基因,通过对目的基因的表达分析进一步解析植物的抗逆机制,为小麦抗逆育种提供候选基因和理论依据。【方法】基于cDNA芯片数据获得的水分胁迫诱导上调表达基因EST序列,运用RACE技术进行cDNA全长克隆,采用生物信息学软件分析克隆基因的编码蛋白特性,并利用实时荧光定量PCR分析该基因在不同组织及不同胁迫处理条件下的表达模式。【结果】通过RACE扩增获得小麦cDNA全长序列（GenBank登录号：JN650603）,命名为Ta14S。该基因序列全长为1 056 bp,其中,5′端非编码区11 bp,3′端非编码区253 bp,开放阅读框为792 bp,编码263个氨基酸。序列比对发现其蛋白质序列包含1个蛋白激酶C的底物结构域、1个类膜蛋白结合域、1个转录因子结合域和1个核输出信号结合域,具有植物14-3-3蛋白的结构特征;运用实时荧光定量PCR进行Ta14S表达分析,该基因在小麦苗期根中表达量最高,在PEG和低温胁迫的任何时间点均稳定上调表达,在ABA和高温胁迫的6 h内其相对表达量均显著高于对照,推测Ta14S可能参与小麦ABA信号通路中对逆境胁迫的抗性反应。【结论】获得小麦Ta14S的全长cDNA序列,其编码蛋白包含与蛋白质互作的典型功能域;通过对Ta14S在干旱、高温、低温、ABA胁迫过程中的表达特性分析表明,Ta14S在小麦逆境胁迫中发挥着重要的调控功能。     

棉花GhGT-2转录因子的克隆及其功能分析

【目的】棉花是重要的纤维作物,其生长常遭受非生物逆境危害,严重影响棉花的生长和产量。Trihelix转录因子在植物抵御各种逆境胁迫中扮演重要作用。克隆棉花Trihelix转录因子基因并分析其表达特性和功能,为最终利用转基因手段改良棉花抗逆性奠定基础。【方法】通过BLAST分析比对,从棉花EST数据库中获得1个高度同源基因,通过基因序列分析,发现其属于Trihelix转录因子GT-2亚家族,命名为GhGT-2。以棉花叶片总RNA为模板,根据EST序列设计引物,利用RT-PCR结合RACE技术,获得GhGT-2的编码序列。使用MEGA5对蛋白序列及其同源序列进行多序列比对分析,并构建同源物种间系统进化树,通过SMART网站（http://smart.embl- heidelberg.de/）进行蛋白结构预测。以陆地棉品种新陆早26号为研究材料,在棉花15 d苗龄时（一对真叶期）,分别对其植株进行非生物胁迫和ABA处理0、1、3、6和12 h,然后采集相应时段棉苗叶片。另外采集同一品种棉花的不同发育时期的根、茎、叶、花、开花后当天胚珠以及开花后12 d（12 days post anthesis,DPA）纤维等不同组织样品,利用实时荧光定量PCR方法分析GhGT-2在棉花不同组织间的表达差异及其在低温、干旱、高盐和ABA处理下的表达模式。将GhGT-2克隆至GFP表达载体pBI221,和GAL4 DNA结合结构域载体,在拟南芥原生质体中验证GhGT-2在细胞内的定位情况和转录激活活性。利用凝胶迁移试验（EMSA）检测DNA结合元件。【结果】克隆了棉花GhGT-2的cDNA全长序列。该基因cDNA全长1 579 bp,开放阅读框为1 428 bp,编码475个氨基酸的蛋白,推导编码蛋白质的分子量为54.07 kD,等电点为8.96。SMART蛋白结构预测发现,该蛋白含有2个Trihelix家族典型的SANT蛋白结合域。系统进化树分析表明,GhGT-2属于Trihelix转录因子GT-2亚家族,与拟南芥AtGTL1、白杨PtaGTL1 GT2-Box、GT3-Box、GT-1b（BoxⅡ）和MYB元件MBS1、MRE1、MRE3、MRE4亲缘关系最近。实时荧光定量PCR表明,GhGT-2在棉花的根、茎、叶、花、开花后当天胚珠以及开花后12 d（12 DPA）纤维中均有表达,其中,在叶中表达量最高,在根中表达量最低。在冷胁迫下,GhGT-2除在3 h时表达量接近0 h外,在1、6和12 h的表达量均低于0 h,呈现抑制表达特征。在高盐、干旱和ABA处理3种胁迫下,GhGT-2在1 h的表达量均低于0 h,但3、6和12 h的表达量均高于0 h,表现为先抑制后上调表达特征。推测该基因可能参与棉花ABA信号通路中对逆境胁迫的抗性反应。利用拟南芥原生质体分析,GhGT-2主要定位于细胞核中,转录激活活性不明显。凝胶阻滞（EMSA）分析发现,GhGT-2可以结合GT元件。【结论】获得棉花GhGT-2的全长cDNA序列,其编码蛋白含有2个SANT蛋白结合域,属于棉花Trihelix转录因子GT-2亚家族。在干旱、高盐和ABA逆境胁迫下,GhGT-2属于依赖于ABA胁迫响应基因调控网络,推测GhGT-2在陆地棉的非生物胁迫适应过程中可能具有重要的作用。     

藜CaMAPKK2的表达分析及盐胁迫信号通路互作组分的筛选

【目的】通过对抗逆植物藜的丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）级联途径中MAPKK的胁迫表达模式分析及信号转导途径互作组分的筛选,探索植物藜响应外界胁迫信号诱发逆境耐受的机制。【方法】以藜叶片总RNA为模板,利用定量PCR方法对NaCl、H2O2和ABA胁迫下藜MAPKK表达规律进行了分析。利用RT-PCR结合RACE技术获得了藜MAPKK的全长cDNA序列。利用酵母双杂交技术对MAPKK盐胁迫信号通路互作组分进行了分析。【结果】获得一个藜MAPKK的全长cDNA序列,命名为CaMAPKK2,其开放阅读框为1 089 bp,编码一个由362个氨基酸组成的丝裂原活化蛋白激酶。定量PCR显示CaMAPKK2受盐胁迫诱导明显上调表达,同时受外源H2O2和ABA调控。H2O2合成抑制剂DPI与ABA合成抑制剂Na2WO4显著抑制了300 mmol•L-1 NaCl处理下CaMAPKK2的表达。以全长CaMAPKK2为诱饵蛋白,利用酵母双杂交技术筛选到5个可能与CaMAPKK2相互作用的蛋白。测序结果显示,其中1个序列可通读,该cDNA序列长794 bp,与欧洲赤杨（Alnus glutinosa）和拟南芥的噻唑合成酶（thiazole biosynthetic enzyme）基因AgTHI1和AtTHI1核酸序列相似度达79%和78%,其它4个序列没有连续的读码框。【结论】CaMAPKK2受NaCl和H2O2诱导上调表达,暗示盐胁迫可能通过诱导H2O2和ABA的积累从而导致CaMAPKK2表达增加。要进一步筛选CaMAPKK2互作组分需获得更多阳性克隆并开展相关功能验证试验。     

茶树Whirly基因家族的鉴定与表达分析

【目的】对茶树Whirly基因家族成员进行鉴定及表达分析,为进一步探究Whirly基因家族在茶树生长发育和逆境响应的作用机理提供参考。【方法】以茶树品种北茶36、龙井43和大面白的叶片为材料,基于Whirly基因家族的保守结构特征,从茶树基因组鉴定CsWhys基因家族成员,利用生物信息学软件对其进行可视化分析,并对组织特异性和时空表达模式分析。【结果】从舒茶早茶树基因组中鉴定获得2个CsWhy基因,命名为CsWhy1(XP_028085682.1)和CsWhy2(XP_028102803.1)。系统进化树分析结果显示CsWhy1和CsWhy2蛋白分别与已知的定位于叶绿体和线粒体的Whirly蛋白聚为一类。CsWhys基因启动子区域富含激素、胁迫和MYB转录因子结合位点等顺式作用元件,种类呈多样性。组织表达特性分析显示,CsWhy1在茶树叶片和芽中具有较高的表达丰度;CsWhy2则在茶树不同组织中均具有较高的表达丰度。时空表达模式分析结果发现,CsWhys的表达在不同时间点受低温、干旱、ABA、GA和H₂O₂处理诱导上调。冷驯化条件下,CsWhy1在抗寒品种龙井43和不抗寒品种大面白中呈现相反的表达模式,而CsWhy2在2个品种中均下调表达。【结论】茶树基因组中2个CsWhys基因具有Whirly基因家族的典型特征,茶树CsWhys基因的表达具有明显的组织特异性,推测CsWhys基因家族在茶树芽叶生长和抗逆过程中起发挥了重要调控作用。     

茶树胆碱单加氧酶CsCMO的克隆及甜菜碱合成关键基因的表达分析

【目的】从茶树中克隆甜菜碱（GB）合成途径中的关键酶——胆碱单加氧酶CsCMO,研究不同逆境胁迫和不同抗寒茶树品种间GB合成中关键基因的表达模式,并分析茶树体内GB的含量,为茶树抗性育种奠定基础。【方法】采用反转录PCR结合RACE技术,从茶树中克隆CsCMO的全长cDNA序列,并对其进行生物信息学分析,结合前期克隆得到的茶树甜菜碱醛脱氢酶CsBADH,用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）方法分析这2个基因的表达模式,紫外分光光度计测定GB含量。【结果】克隆得到茶树CsCMO（GenBank登录号：JX050146）的cDNA全长1 558 bp,包含1 305 bp的完整开放阅读框（ORF）,编码434个氨基酸,并被定位在叶绿体上。氨基酸序列分析表明,CsCMO含有CMO中保守的Rieske型2Fe-2S结构域和单分子非血红素Fe结合位点,与其它植物CMO序列相似性在50%以上;进化树分析显示,它与枸杞的关系最近。qRT-PCR分析表明,4℃低温、NaCl盐和ABA处理均能诱导CsCMO和CsBADH表达,96 h内随着处理时间的增加,表达量呈增加趋势,但2个基因的表达模式有差异,盐胁迫诱导基因表达更显著;在不同抗寒品种中,2个基因的表达在抗性强的品种中表达量总体要高于抗性弱的品种,且CsBADH的变化比CsCMO的显著。3种胁迫处理48 h后,叶片中的GB含量均增加;低温处理后抗寒性强的品种中GB含量比抗寒性弱的高。【结论】克隆了茶树CsCMO,在低温、NaCl盐以及ABA处理下,GB积累,CsBADH和CsCMO上调表达,且盐胁迫下的表达更明显,表明GB与茶树抵御这3种胁迫关系密切。     

银中杨DREB基因的克隆及表达

【目的】克隆银中杨抗逆转录因子DREB基因,为其功能的深入研究奠定基础。【方法】根据DREB AP2/EREBP保守区设计1对简并引物,采用PCR方法对银中杨（Populus albaxp）转录因子DREB基因中间片段进行克隆;再利用反向PCR方法对该基因的旁侧序列进行克隆,最终将两侧序列与中间片段拼接得到基因全长;同时,根据基因序-列设计1对特异引物,利用荧光定量PCR分析银中杨DREB基因在不同逆境胁迫中的表达情况。【结果】成功地从银中杨中克隆到1个DREB基因,命名为PaDREB（注册号：EF582843）。该基因序列长935 bp,ORF为819 bp,编码272个氨基酸;同源性比较与系统发育分析证实,银中杨DREB属于DREB转录因子家族,并与月季DREB2C具有较高的同源性;荧光定量PCR检测结果显示,盐、低温、干旱及ABA均能诱导DREB基因的表达。【结论】首次从银中杨中分离并克隆了DREB基因,并证实其参与了银中杨对盐、低温、干旱及ABA的应答。     

玉米肌动蛋白解聚因子ZmADF4基因克隆、转录活性及表达分析

【目的】克隆玉米肌动蛋白解聚因子4（ZmADF4）基因,并对其转录活性和表达模式进行分析,为探究玉米ADF家族基因的功能及调控机制提供参考依据,也为玉米抵抗逆境胁迫研究提供潜在的基因资源。【方法】采用同源克隆技术克隆玉米叶片ZmADF4基因,运用生物信息学软件分析其编码蛋白的理化性质、保守结构域及二、三级结构;通过原生质体瞬时转化进行亚细胞定位;利用酵母自激活分析该基因转录活性,下载RNA-Seq数据分析其在不同组织中的表达特性,并利用实时荧光定量PCR检测其在不同逆境胁迫下的表达情况。【结果】从玉米叶片克隆获得的ZmADF4基因,编码区（CDS）长度为420 bp,编码139个氨基酸残基,蛋白分子量为15.855 kD,理论等电点（pI）为7.66,属于亲水性蛋白,具有典型的植物ADF蛋白家族的保守结构域ADF_gelsolin,主要定位于细胞质中。ZmADF4基因不具有转录自激活效应,且在根、茎、叶、花丝、花药、胚、胚乳和果皮等组织中呈差异性表达,在茎、果皮和叶片中表达量较高。ZmADF4基因对高温胁迫、低温胁迫、高盐胁迫、干旱胁迫及脱落酸处理均有响应,其中高温胁迫下,整体呈上调表达趋势,而低温胁迫和脱落酸处理下,整体呈下调表达趋势,干旱和高盐胁迫下则呈先上调再下调表达的趋势。【结论】ZmADF4基因属于ADF基因家族成员,不仅参与玉米茎、果皮和叶片的生长发育调控,还参与低温、高温、干旱、脱落酸、盐胁迫等逆境响应调控。     

独行菜抗冷相关基因的克隆及表达分析

【目的】独行菜在种子萌发和幼苗生长阶段可耐受一定程度的低温胁迫,研究独行菜的低温耐受机制。【方法】设计兼并引物,从独行菜冷诱导叶片的cDNA中克隆获得LaCBF3和LaCOR15a基因核心片段。利用半定量RT-PCR法分析两个基因在不同胁迫处理下的表达情况。【结果】获得442 bp LaCBF3及405 bp LaCOR15a核心片段,经比对与拟南芥CBF3、COR15a基因核心片段相似性分别为84.38%、81.8%。半定量RT-PCR结果显示在独行菜幼苗中,LaCOR15a基因不仅响应低温胁迫,还能迅速响应高盐、干旱及ABA处理,不同条件下表达各有差异。LaCBF3仅对低温胁迫响应迅速。【结论】LaCBF3、LaCOR15a在独行菜幼苗响应低温胁迫的分子机制中具有重要的调控作用,且LaCOR15a基因也应答干旱、高盐等非生物胁迫。