PCR反应程序对土壤微生物PCR-DGGE分析的影响

利用聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳(PCR-DGGE)探讨不同PCR反应程序(降落式PCR、巢式-降落式PCR、普通PCR、巢式PCR)对土壤微生物PCR-DGGE群落结构和种群多样性分析的影响。利用Quantity One4. 6. 2软件对DGGE指纹图谱进行数字化处理,并计算相应PCR程序下DGGE图谱的多样性指数、丰富度指数、均匀度指数和不同反应程序下图谱的戴斯系数,应用SPSS 16. 0软件对相关指数进行方差分析,检测不同反应程序间各指数的差异显著性。不同PCR反应程序在土壤微生物PCR-DGGE分析时,其群落结构和种群多样性指数间存在明显差异。单纯应用降落式PCR虽然提高了扩增的特异性,却降低了扩增效率,其DGGE图谱丰富度较低,多样性较差,与其他反应程序的DGGE图谱相似度较低;普通PCR反应的DGGE图谱多样性和丰富度较高,与2种巢式PCR相似,然而由于普通PCR在复杂模板情况下容易发生错配,难以保证扩增特异性,因而夸大样品中微生物种群多样性,与2种巢式PCR的DGGE图谱相似度较低。2种巢式PCR反应程序下的DGGE图谱条带丰富,多样性高,群落结构相似度高,能比较全面和科学地反映样品中微生物群落结构和种群多样性。因此,在利用PCR-DGGE分析土壤微生物群落结构和种群多样性时,采用巢式PCR(包括巢式PCR和巢式-降落式PCR)比较合适。研究PCR反应程序对土壤微生物PCR-DGGE分析的影响,可为PCR-DGGE技术在土壤微生物群落结构和多样性分析中的应用和完善提供理论依据。     

土壤微生物群落结构研究方法综述

综述了土壤微生物传统培养方法和Biolog微平板分析碳素利用法、磷脂脂肪酸法(PLFA分析法)等微生物群落生理代谢研究方法,以及变性梯度凝胶电泳(DGGE)、末端限制性长度多态性(T-RFLP)、高通量测序技术及宏基因组等微生物分子生物学技术在土壤微生物多样性研究中的应用,并对未来的发展趋势进行了展望。     

利用DGGE指纹图谱技术考察不同营养条件下土壤微生物群落结构的变化

利用现代分子生物学技术,结合经典方法,克服传统的分离培养缺陷,探讨在不同营养条件下土壤微生物群落的基因多样性。经过直接从土壤中抽提总DNA,并对总DNA中16S rDNA及其中V6~V8可变区序列作PCR扩增、变性梯度凝胶电泳(DGGE)分析等,发现不同处理条件下的土壤微生物的基因多样性变化与土壤微生物量的波动并不一致,说明微生物群落多样性与微生物量的关系并非线形。同时发现秸秆的添加更有利于土壤微生物群落的稳定。     

喷施Bt杀虫剂对土壤微生物生物量和多样性的影响

应用氯仿熏蒸法和聚合酶链式反应?鄄变性梯度凝胶电泳（PCR-DGGE）技术研究了菜地土和松林土喷施苏云金杆菌Bacillus thuringiensis（Bt）杀虫剂后,土壤微生物量和细菌群落结构及多样性的变化特征。研究结果表明:菜地土喷施Bt杀虫剂后,土壤微生物量呈现先减少后增加再减少的变化趋势;松林土喷施Bt杀虫剂后,土壤微生物量碳则呈现出增加的趋势;2种土壤均在喷施1 315 ghm－2的Bt杀虫剂后,微生物量碳达到最大值。微生物群落结构分析表明,菜地与松林土壤变性梯度凝胶电泳（DGGE）图谱带型有较大的差异,菜地土壤细菌群落具有更高的丰富度。土壤类型是决定微生物群落结构相似性的关键因素,Bt杀虫剂梯度喷施并不足以形成新的群落结构。菜地土喷施Bt杀虫剂后微生物多样性指数显著上升（P＜0.05）,而松林土则表现出显著下降（P＜0.05）或不变的趋势。图3表3参20     

三种杀菌剂对土壤细菌群落多样性影响

利用PCR-DGGE技术研究百菌清、代森锰锌和霜霉威对土壤细菌群落结构影响。运用16S rDNA特异引物,将土壤中提取的总DNA进行PCR扩增后,通过DGGE技术对PCR产物进行分析,得到施加农药的土壤细菌群落遗传多样性变化情况。结果表明,土壤细菌在高浓度霜霉威的诱导下增加新种群,使细菌多样性增加,这些种群逐渐变为优势种群,低浓度霜霉威对土壤细菌微生物群落的影响很大,其他农药处理对于外来农药的污染敏感性较弱,影响不显著,尤其是低浓度处理的百菌清对土壤细菌群落无影响。     

氯氰菊酯与铜复合污染对土壤微生物群落的影响

采用常规手段研究了土壤在受氯氰菊酯、铜及二者复合污染后土壤呼吸率及微生物量碳的变化,采用了分离效果较好的双变性梯度凝胶电泳(DG-DGGE)技术研究微生物群落的变化.结果表明,低浓度的铜与高浓度的氯氰菊酯复合污染更能促进微生物量碳及土壤呼吸率的增加,微生物的群落结构也会受到明显影响.而两种污染物分别单独作用时,铜对微生物的胁迫更大,有铜组和无铜组在DGGE条带上差异较大,Shannon指数上也有明显不同.当铜的浓度较高时,加入高浓度的氯氰菊酯在较长的时间后(60d)对土壤呼吸作用、微生物量碳有一定影响,可能高浓度氯氰菊酯的加入在一定程度上减弱了高浓度铜对微生物的胁迫,而微生物群落并无显著的变化.     

十溴联苯醚对土壤中微生物群落结构及土壤潜在硝化功能的影响

采用变性梯度凝胶电泳(DGGE)和寡聚核苷酸探针-荧光原位杂交(FISH)方法研究了十溴联苯醚(BDE209)对土壤中微生物群落的影响作用.结果表明,1 mg·kg-1BDE209对土壤中微生物群落多样性以及总细菌数有明显的促进作用,土壤中的氨氧化细菌以及亚硝酸氧化菌的数量有显著增长.BDE209浓度达到100mg·kg-1时,土壤微生物的总数和群落多样性则显著降低,同时氨氧化细菌以及亚硝酸氧化菌的生长也受到明显的抑制.暗室培养45 d内,BDE209虽未被降解,但高浓度的十溴联苯醚会对土壤中的微生物群落结构及土壤潜在的硝化作用产生较大影响.     

基于PCR-DGGE的中江丹参轮作期间土壤细菌遗传多样性变化特征

为了解四川中江丹参轮作期间土壤细菌遗传多样性变化特征,分离提取土壤微生物DNA,以细菌通用引物PCR扩增,DGGE分离,切割条带、回收并测序,在GenBank中查得菌种。结果表明,中江丹参轮作期间,土壤细菌主要群落包括:Alpha proteobacterium,Sphingomonas sp.,Uncultured bacterium isolate LH2-12,Uncultured bacterium isolate DGGE gel band h,Uncultured Arthrobacter sp.,Uncultured bacterium isolate DGGE gel band a1-11,Uncultured Sphingomonas sp.。休种1年与当年种植丹参土壤细菌多样性相似,而与休种3年土壤细菌种群结构有明显差异;休种第2年属于过渡。说明中江丹参轮作期休种为其土壤细菌群落遗传多样性逐渐恢复平衡过程;且休地第2年是关键时期,与笔者前期采用培养法及土壤真菌群落结构相关的研究结果一致。     

克拉玛依油田内源微生物选择性激活条件研究

[目的]优化从5份克拉玛依原油污染土壤样品中分离得到的六类细菌选择性激活条件,筛选最佳激活剂配方,借助DGGE技术对激活前后菌群的结构变化进行比较,更精确的揭示油藏微生物的物种和遗传多样性.[方法]针对筛选到的六类细菌,以降粘率及菌群增长率的变化为依据,通过正交试验进行激活剂及其最佳浓度的选择,利用DGGE技术进行微生物群落结构分析.[结果]所采原油污染土壤样品间微生物群落结构基本相同,既含有有益菌群如石油烃降解菌、产甲烷菌、脱氮菌等,又含有有害菌群如硫酸盐还原菌、硫细菌、铁细菌等.根据样品中微生物生长率及降粘率的变化,筛选出最佳选择性激活剂配方:0.8;蔗糖,0.4;硝酸钠,0.15; K2HPO4/KH2PO4.加入该激活剂可使原油的降粘率由7.9;升至46.00;.经DGGE分析,激活后样品间微生物群落结构的相似性在53;～76;,高于激活前的相似性41; ～61;,这表明通过激活剂的选择性激活作用,可提高微生物的降粘效果,并使有益菌的生长占据优势,在一定程度上使群落结构趋于稳定.[结论]所选激活剂明显改变了原油微生物的群落结构,有效而有选择性地激活了内源微生物的生长,使样品间微生物群落结构相似性增强.     

变性梯度凝胶电泳在瘤胃微生物多态性研究中的应用

介绍了变性梯度凝胶电泳（DGGE）技术的基本原理及优缺点,并综述了国内外利用DGGE技术在反刍动物瘤胃微生物群落多态性和动态性分析方面应用及其发展前景。     

PCR-DGGE技术在土壤微生物多态性研究中的应用

实验室中传统的微生物分离、培养和分类方法,在反映土壤微生物的基因信息上有很大的局限性,将逐步被分子生物学方法所替代。本文在阐述PCR-DGGE方法原理的基础上,分析了其在微生物多样性研究中的具体运用、方法缺陷及改进措施。     

研究土壤微生物多样性的PCR条件优化(英文)

[目的]对PCR-DGGE法的试验条件进行优化,以更好地分析土壤微生物遗传多样性。[方法]改良高盐法提取土壤DNA,改进引物设计,改变PCR反应过程中退火温度、扩增体系,比较PCR扩增结果。[结果]经过改良的高盐法提取的土壤微生物DNA效果更好。PCR扩增选择20μl体系条带单一,易于操作。退火温度选择在55℃时无非特异性扩增,35个循环次数易于后续DGGE分析。[结论]已经优化的PCR基因扩增体系特异性高且稳定可靠。     

西瓜枯萎病抗性及其嫁接对根际土壤微生物数量及群落结构的影响

 【目的】揭示不同枯萎病抗性西瓜品种根际土壤微生物的差异及嫁接提高抗病性的土壤微生物学基础。【方法】以抗枯萎病西瓜品种‘甜妞’和感枯萎病西瓜品种‘天使’为试材,以南瓜（博强1号）为嫁接砧木,采用平板计数及PCR-DGGE技术,研究抗感枯萎病西瓜品种自根苗、嫁接苗和砧木不同生育期根际土壤微生物数量及群落结构的变化。【结果】抗性品种根际土壤细菌数量在生育期的中后期显著高于感病品种,根际土壤真菌数量显著低于感病品种;感病品种嫁接后根际土壤细菌和放线菌数量均高于非嫁接处理,而镰孢菌除苗期外均低于非嫁接处理;PCR-DGGE结果表明,不同处理根际土壤细菌、真菌群落结构存在差异,且随生育期的变化而变化。对差异条带测序分析说明不同西瓜品种及嫁接砧木南瓜根际分布不同的细菌和真菌群。【结论】西瓜抗病品种的根际土壤细菌和放线菌的数量显著高于感病品种,而真菌和镰孢菌数量显著低于感病品种,品种的抗性与根际土壤微生物的种群和数量密切相关;嫁接提高了感病品种根际土壤细菌、放线菌微生物数量,抑制了枯萎病菌的积聚,改变了根际土壤微生物群落结构。植物基因型对根际土壤微生物群落结构有显著影响,而根际微生物群落结构的不同将导致植物对病原菌的抗性差异及品种差异。     

赤松根际土壤微生物PCR—DGGE反应体系优化

为建立赤松根际土壤微生物的PCR-DGGE反应体系,以赤松根际土壤为材料,利用PCR—DGGE技术,对反应体系中的几个重要因素不同梯度进行优化,包括模板DNA、dNTPs、引物及Mg2＋的用量。在25μL PCR反应体系中,模板DNA浓度为10ng,dNTPs浓度为0．15mM,引物浓度为0．32μM,Mg2＋浓度为1．0mM时,其PCR效果最佳。用该反应体系扩增出来的PCR产物,在DGGE凝胶上能够清晰地分辨出赤松根际土壤细菌和真菌多样性。这为进一步研究赤松根际土壤微生物,特别是研究赤松外生菌根奠定了基础。     

转cry1Ah基因玉米对根际土壤微生物群落结构的影响

采用传统的平板计数法分析根际土壤可培养细菌、真菌和放线菌数量;同时用聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳(PCR-DGGE)和BIOLOG方法,对转cry1Ah基因抗虫玉米根部土壤微生物群落结构进行了研究.结果表明,在玉米的整个生长过程中,根部可培养的微生物随时间变化有一定的消长,但同一时间内转基因玉米与非转基因玉米二者根...     

DGGE技术检测中华绒螯蟹线粒体Cytb基因遗传多样性的实验条件探讨

目前,变性梯度凝胶电泳技术（DGGE）多用于微生物和临床医学检测,而用于水产动物基因片段检测的报道甚少。相关研究显示,针对不同的目的基因,其PCR条件、变性剂浓度梯度和电泳时间是DGGE检测实验成败的关键。因此,为应用DGGE技术分析中华绒螯蟹线粒体Cytb基因片段的遗传多样性,探讨了DGGE技术的关键因子,确定了PCR反应体系和循环参数、电泳时PCR产物的上样量、变性剂浓度范围和电泳的最适时间。     

不同栽培环境下有机与常规蔬菜土壤的细菌群落多样性差异

土壤细菌群落在蔬菜栽培中发挥着重要作用.基于DNA和RNA水平,利用PCR-DGGE技术研究了不同栽培环境下有机与常规蔬菜土壤细菌群落多样性差异,以及土壤理化性质与细菌群落多样性的关系.结果表明:不同栽培方式下土壤细菌多样性存在明显差异,土壤微生物的优势种群和数量受有机、常规栽培和季节影响,有机栽培较之常规栽培能够显著增加土壤细菌群落多样性;聚类分析表明,16S rDNA细菌群落多样性与季节相关,而16S rRNA细菌群落多样性与栽培方式相关;差异条带测序显示,大多细菌与不可培养细菌种属有较高同源性,其余9种推测属于假单胞菌属;CCA分析说明pH是影响土壤细菌群落多样性的主要因素,有机栽培土壤中微生物生物量C、N以及有机质含量显著高于常规栽培土壤.综上,有机栽培能够丰富活性细菌群落多样性,具有土壤优化效应.     

应用PCR-DGGE研究铜冶炼厂附近根际土壤微生物生态变化

应用DGGE指纹图谱技术对重金属污染土壤植物修复过程中根际微生物的生态变化进行了研究。在植物的生长旺季采集根际土壤样品,共采集香根草、油菜、芥菜和对照11个样品,并进行土壤重金属分析和微生物群落结构分析。结果表明,在植物种植后,根际土壤重金属的NH4NO3和EDAT提取态均比对照(未种植植物)低。PCR-DGGE图谱分析不同植物根际土壤微生物DGGE图谱有着明显的差异性。DGGE图谱分析结果显示植物根际微生物的Shannon指数都有所增加,香根草根际微生物多样性程度最高为0.9347,其次为油菜和芥菜,其多样性指数分别为0.7655、0.6940。主成分分析(PCA)结果可以看出,主成分分析能够对不同植物根际和对照分开,并且显示出不同样品之间有着差异性。通过对土壤不同提取态的重金属含量与Shannon指数的相关性分析可以看出,各种不同提取态的重金属都跟Shannon植物有着负相关,但NH4NO3提取态的Cu和Zn与Shannon指数没有显著性的相关性,而EDTA提取态的Cu和Zn则与Shannon指数有显著性的负相关性,其相关系数为0.9539,EDTA提取态的Cu还与Shan-non指数呈极显著性的负相关,其相关系数为0.9931。     

粘虫肠道细菌群落多样性的PCR DGGE指纹图谱分析

研究东方粘虫[ Myth imna se parata (Walker)]肠道细菌的多样性.采用常规分离培养与分子鉴定相结合的方法,并以16S rDNA作为分子标记的变性梯度凝胶电泳(DGGE)对肠道细菌进一步分离,DGGE分离样品是研磨提取粘虫中肠组织DNA、提取培养混合菌DNA及直接以培养混合菌为模板进行PCR扩增的产物.结果表明,共得到DGGE条带19条,其中肠组织研磨提取DNA的DGGE条带最多,为17条;直接以培养混合菌液为模板进行PCR扩增次之,为13条;培养混合菌液提取DNA的条带最少,为12条.传统方法和分子生物学方法相结合研究肠道微生物多样性时能获得更全面的微生物信息,可采用培养混合菌提取DNA再结合其他方法进行后续研究.     

复方陈皮粉对猪胃肠道菌群多样性的影响

将60头试验猪随机分为2组,每组3个重复,每个重复10头猪;对照组和试验组分别饲喂基础日粮和添加0.2%复方陈皮粉的日粮,共计60 d;饲喂过程中定期采集新鲜粪便,采用变性梯度凝胶电泳(DGGE)和末端限制性内切酶片段长度多态性(T-RFLP)指纹图谱技术研究饲喂复方陈皮粉对猪胃肠道菌群多样性的影响.结果表明,试验期间试验组的猪基本不腹泻,对照组有部分猪经常腹泻.分别对两组粪便样品的胃肠道微生物进行16S rDNA V3区扩增,再通过DGGE技术进行条带分离,DGGE图谱显示,猪胃肠道菌群物种丰富,两组样品之间存在明显的条带差异.对两组粪便样品胃肠道微生物16S rDNA全长进行扩增,用MspⅠ和HaeⅢ对扩增产物进行限制性酶切,再运用T-RFLP技术检测.通过RDP数据库查询比对,在两组粪便样品中,相同的T-RFs片段有27个,相对于试验组,对照组样品中差异部分片段对应的菌种多为致病菌.研究结果表明,临床上使用复方陈皮粉能有效预防猪腹泻等胃肠道疾病,这可能与药物能改善胃肠道微生态坏境,调节菌群平衡有关.