褪黑素对大鼠胰岛瘤细胞INS-1胰岛素和Gαi/o蛋白基因表达的影响

【目的】研究褪黑素对大鼠胰岛瘤细胞INS-1中胰岛素和Gαi/o蛋白基因表达的影响,探究褪黑素在m RNA水平对Gαi/o和Insulin1调节作用中可能存在的分子机制。褪黑素(melatonin,MT)是松果腺分泌的一种吲哚类神经内分泌激素,在机体内可调节胰岛素的分泌而使其呈现昼夜节律性分泌,影响葡萄糖昼夜代谢水平的变化进而维持机体血糖的相对恒定,故对于褪黑素影响胰岛素表达的研究可能会对褪黑素在胰岛素昼夜节律性分泌中的调控作用提供依据。【方法】将冻存的INS-1细胞复苏培养至第三代,INS-1细胞传代后,用RPMI1640培养基培养INS-1细胞约24—48 h,当细胞密度达60%—70%时,使用无血清无葡萄糖的RPMI1640洗2次,然后在INS-1细胞培养外液中分别加入不同浓度(0、10、20、30、50 mmol·L-1)的葡萄糖及100 nmol·L-1褪黑素和不同浓度葡萄糖孵育INS-1细胞12 h,观察和统计INS-1细胞的形态学变化。利用Easy Pure?RNA Kit提取INS-1细胞的总RNA,核酸蛋白测定仪测定细胞总RNA的浓度和纯度,其次利用甲醛变性琼脂糖凝胶电泳检测细胞的总RNA质量,Trans Script One-Step g DNA Removal and c DNA Synthesis Super Mix反转录合成c DNA。利用Primer Premier5.0引物设计软件,参考Gen Bank上已登录的基因序列进行Insulin1、Gαi1、Gαi2、Gαo、PKA和PKCα引物的设计。应用q RT-PCR法进行检测处理后的INS-1细胞Insulin1、Gαi1、Gαi2、Gαo、PKA和PKCαm RNA水平的变化。【结果】用含不同浓度葡萄糖培养液孵育INS-1细胞后,观察发现随着培养基中葡萄糖浓度含量的增加INS-1细胞突触的增长呈现先增加后减少的趋势,其中20 mmol·L-1葡萄糖处理组INS-1细胞突触的增长明显,而20 mmol·L-1葡萄糖和100 nmol·L-1褪黑素处理组INS-1细胞表面积增大,但突触增长却不明显;培养基中含不同浓度葡萄糖的处理组中,Insulin1 m RNA水平呈现先升后降的趋势,Gαi1 m RNA水平则呈现先降后升的趋势,其中20 mmol·L-1葡萄糖处理组,Insulin1 m RNA水平显著增加(P0.05),Gαi1 m RNA水平显著减少(P0.05),而Gαi2和Gαo则无显著变化(P0.05),因而Gαi1表现出与Insulin1 m RNA水平呈现负相关性而非Gαi2、Gαo与Insulin1 m RNA水平呈现负相关性;20 mmol·L-1葡萄糖和褪黑素处理组和20 mmol·L-1葡萄糖处理组相比,20 mmol·L-1葡萄糖和褪黑素处理组的Gαi1 m RNA水平显著增高(P0.05),且Insulin1和PKCαm RNA水平显著减少(P0.05),PKA m RNA水平则减少不显著(P0.05)。【结论】褪黑素能够抑制INS-1细胞Insulin1的表达,减少胰岛素的分泌导致INS-1细胞适应性增生。褪黑素与其受体结合后可促进Gαi1 m RNA水平增高而抑制PKCα的表达,使得Insulin1的表达受到抑制,胰岛素分泌减少,使血糖在夜间得以维持相对恒定。     

袖状胃切除术对2型糖尿病大鼠骨骼肌GLUT4表达的影响

目的:探讨袖状胃切除术对2型糖尿病大鼠骨骼肌葡萄糖转运蛋白4(Glucose transporters 4,GLUT4)表达的影响。方法:将30只2型糖尿病建模成功的大鼠分为空白对照组、假手术组和手术组,检测术前及术后第1、4、8、12周各组大鼠体质量、空腹血糖,术后第12周测定糖耐量、血清胰岛素的水平。取大鼠骨骼肌组织,采用荧光实时定量PCR技术检测骨骼肌组织中GLUT4 mRNA的表达。结果:与假手术组和空白对照组比较,手术组大鼠术后第1周体质量开始下降(p0.05)、空腹血糖逐渐降低(p0.05)。术后12周口服糖耐量实验明显改善、胰岛素水平升高、胰岛素抵抗指数降低、骨骼肌组织中GLUT4 mRNA的表达显著升高(p0.01)。结论:袖状胃切除术能改善2型糖尿病大鼠糖代谢可能与提高骨骼肌组织中GLUT4 mRNA的表达、缓解胰岛素抵抗有关。     

水翁花提取物的PPARγ配体活性鉴定

[目的]鉴定水翁花提取物2,4-二羟基-6-甲氧基-3,5-二甲基查耳酮(DMC)的PPARγ配体结合活性及其特点。[方法]用GAL4嵌合体报告基因试验检测DMC的PPARγ配体结合活性;用油红O染色法检测DMC对3T3-L1前脂肪细胞分化的影响;用[3H]-2-脱氧葡萄糖摄取试验检测DMC对3T3-L1脂肪细胞葡萄糖摄取的影响;用荧光实时定量PCR检测经DMC处理的3T3-L1脂肪细胞中PPARγ靶基因的表达情况。[结果]DMC能以剂量依赖型的方式对PPARγ产生激活作用,促进脂肪细胞的分化,显著提高脂肪细胞的葡萄糖摄取率,并且提高脂肪细胞中一些PPARγ靶基因的表达量。[结论]DMC能通过激活PPARγ促进脂肪细胞的葡萄糖摄取。     

甘丙肽受体1正性调节胰岛素敏感性的作用

将36只大鼠分3组,高脂饮食对照组、2型糖尿病模型对照组(模型组)、2型糖尿病模型大鼠侧脑室注射甘丙肽受体1(GALR1)激动剂M617[10nmol·(kg·d)-1]组(试验组),每组12只。侧脑室注射处理20d后,采用ELISA法检测血清胰岛素抵抗分子表达指标、正糖钳试验检测葡萄糖输注速率及RT-PCR检测脂肪细胞GLUT4表达量,探讨M617通过激活GALR1能否提高糖尿病大鼠的胰岛素敏感性。结果表明:侧脑室注射M617能显著增加糖尿病模型大鼠的体重、降低血糖、抑制胰岛素分泌、抑制sCD36及CRP表达;同时,侧脑室注射M617能显著增加糖尿病模型大鼠的正糖钳的葡萄糖输注速率和脂肪细胞GLUT4mRNA表达水平。说明侧脑室注射M617通过激活GALR1可显著促进外周组织的葡萄糖摄取,增加胰岛素敏感性。     

siRNA-CyclinE对家蚕细胞增殖的影响

【目的】研究小干扰RNA(Small interfering RNA,siRNA)对家蚕卵巢细胞系(BmN)细胞CyclinE基因表达及细胞周期的影响。【方法】合成针对CyclinE基因1 252和568位点的siRNA片段,并利用脂质体法转染家蚕BmN细胞,于共聚焦荧光显微镜下观察转染情况;应用实时荧光定量PCR法检测CyclinE mRNA的表达情况,流式细胞仪检测细胞周期。【结果】siRNA对家蚕BmN细胞的转染效率达80%左右。转染1252-siRNA-CyclinE和568-siRNA-CyclinE 48h后,分别使家蚕BmN细胞CyclinE mRNA表达量降低了68%和90%;流式细胞仪检测结果显示,2个转染组G0/G1期细胞比例显著增大,S期和G2/M期细胞比例显著减小。【结论】在家蚕BmN细胞中导入针对CyclinE的siRNA,可有效抑制CyclinE基因的表达,使细胞周期阻滞于G1期,进而抑制细胞增殖。     

通草提取物对奶牛乳腺上皮细胞乳糖合成及相关基因表达的影响

为探讨通草对奶牛乳腺上皮细胞乳糖合成及相关基因表达的影响,采用不同剂量通草提取物处理奶牛乳腺上皮细胞,利用四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测乳腺上皮细胞增殖能力,乳糖/半乳糖检测试剂盒(Lactose/D-Galactose (Rapid) Assay Kit)检测乳腺上皮细胞培养液中乳糖含量,实时荧光定量PCR技术检测乳腺上皮细胞乳糖合成相关基因葡萄糖转运蛋白1(GLUT1)、葡萄糖转运蛋白4(GLUT4)、葡萄糖转运蛋白8(GLUT8)、葡萄糖转运蛋白12(GLUT12)、己糖激酶Ⅰ(HKⅠ)、己糖激酶Ⅱ(HKⅡ)、β-1,4-半乳糖基转移酶-1(β-4GALT1)和α-乳清白蛋白(α-LA)基因mRNA表达水平。结果表明,200、400、600μg(生药)·mL-1通草提取物提高奶牛乳腺上皮细胞增殖能力(P<0.05),促进奶牛乳腺上皮细胞合成分泌乳糖(P<0.05),并显著上调细胞GLUT1、GLUT8、HKⅡ、β-4GALT1及α-LA mRNA表达水平(P<0.05),但对GLUT4、GLUT12和HKⅠmRNA表达水平无显著影响(P>0.05)。研究表明,适当浓度通草提取物可提高奶牛乳腺上皮细胞增殖能力,并通过上调乳腺上皮细胞GLUT1、GLUT8、HKⅡ、β-4GALT1和α-LA的mRNA表达,促进乳腺上皮细胞合成乳糖。     

家蚕细胞cyclinA基因的干涉对家蚕细胞增殖的影响

[目的]研究小干扰RNA (small interfering RNA,siRNA)对家蚕卵巢细胞系(BmN)细胞cyclinA基因表达及细胞周期的影响.[方法]通过脂质体转染试剂将针对cyclinA基因的特异性siRNA片段转入家蚕BmN细胞,采用SYBR荧光定量PCR法检测cyclinA mRNA的表达,流式细胞技术检测细胞周期变化.[结果]转染siRNA-cyclinA可有效下调cyclinA基因的表达,转染48 h后,cyclinA mRNA表达量降低到对照的37.4％;流式细胞仪分析表明:与对照组相比,转染组Go/G1期细胞比例显著增加,细胞周期阻滞于G1期.[结论]靶向cyclinA基因的siRNA片段,通过下调cyclinA基因表达能有效抑制细胞增殖.     

翘嘴鳜快肌和慢肌糖代谢相关基因的表达分析

采用荧光定量PCR技术,检测翘嘴鳜(Siniperca chuatsi)快肌和慢肌中与糖代谢相关的16个基因的表达情况,并比较其表达差异性,分析翘嘴鳜肌肉糖代谢调控特点。结果显示:在快肌和慢肌中,与葡萄糖摄取和磷酸化相关的基因存在显著性差异表达的各有4个;与糖原代谢相关的基因有显著性差异表达的有2个;PI3K、MAPK5、MAPK63个基因在快肌中的相对表达量极显著高于在慢肌中的,表明与这3个基因相关的葡萄糖的摄取和利用快肌强于慢肌;而MEF2α、PGC–1α、PGC–1β、PDK1、MAPK4、GYS1、GSK3β7个基因在慢肌中的相对表达量显著高于快肌,表明与这7个基因相关的葡萄糖的摄取和利用慢肌强于快肌。     

印楝素对min6细胞增殖及胰岛素分泌的影响

【目的】研究印楝素对min6细胞增殖、葡萄糖摄取及胰岛素分泌的影响,并探讨其作用机制。【方法】不同浓度印楝素处理min6细胞48 h,检测细胞增殖量。在5.5和25.0 mmol·L~(-1)葡萄糖条件下,检测印楝素处理细胞的葡萄糖摄取水平,胰岛素ELISA检测试剂盒检测细胞胰岛素的分泌。【结果】与对照组相比,在5.5和25.0mmol·L~(-1)葡萄糖条件下,印楝素均表现促进细胞增殖活性。印楝素处理下,与25.0 mmol·L~(-1)葡萄糖条件相比,5.5 mmol·L~(-1)葡萄糖表现出更显著地促进葡萄糖摄取和胰岛素分泌的作用。【结论】印楝素可能通过调控葡萄糖水平影响胰岛素的分泌。     

蜂胶中4种黄酮对HepG2细胞胰岛素抵抗的改善作用

为探究蜂胶中4种黄酮成分(高良姜素、短叶松素、松属素、柯因)对胰岛素抵抗的改善作用。通过高浓度胰岛素诱导的方式建立胰岛素抵抗HepG2细胞模型;设立正常组、模型组、高良姜素处理组、短叶松素处理组、松属素处理组、柯因处理组,测定各试验组对HepG2细胞增殖、葡萄糖消耗量、糖原含量、已糖激酶(hexokinase,HK)和丙酮酸激酶(pyruvate kinase,PK)的影响。结果显示:4种黄酮成分在有效浓度范围内对胰岛素抵抗HepG2细胞增殖均无显著影响(P0.05);柯因、短叶松素作用效果不明显(P0.05);高良姜素和松属素均能不同程度地提高IR-HepG2细胞葡萄糖消耗量(glucose consumption,GC)、肝糖原含量、HK和PK活力(P0.05)。上述结果表明蜂胶中高良姜素和松属素能较好地调节IR-HepG2糖代谢,改善胰岛素抵抗,为蜂胶产品的深度开发提供参考。     

鸡树条荚蒾果多酚改善胰岛素抵抗HepG2细胞的糖代谢效应

目的探讨鸡树条荚蒾果多酚对HepG2细胞胰岛素抵抗（IR）模型的改善作用，以评价其降血糖活性。方法本研究采用高浓度胰岛素诱导，建立体外IR模型，并进行模型稳定性（细胞活性法）及可靠性（Z因子法）评估。试验设空白组、IR模型组、阳性对照（二甲双胍）组和荚蒾果多酚组，MTT法检测细胞活性；葡萄糖氧化酶法检测培养液葡萄糖含量，计算葡萄糖消 耗量；蒽酮法测定糖原含量；比色法检测细胞己糖激酶（HK）、丙酮酸激酶（PK）活性，酶联免疫吸附试验（ELISA）检测细胞磷酸烯醇式丙酮酸激酶（PEPCK）、葡萄糖六磷酸酶（G6PC）活性。结果10? 6 mol/L的胰岛素诱导处理HepG2细胞24 h是产生胰岛素抵抗模型的最适条件，且IR模型在12 ~ 36 h内有较高的稳定性和可靠性。0.10 ~ 1.00 mg/mL 荚蒾果多酚组的葡萄糖消耗量显著高于模型组（P < 0.05），24 h、0.50 mg/mL组的糖消耗量最高，为（3.49 ± 0.11）mmol/L，消耗率可达88.81%（P < 0.01）。与模型组对比，荚蒾果多酚可提高糖原的含量33.65%（P < 0.01），HK、PK活性可分别提高43.36%（P < 0.05）、48.41%（P < 0.01），对G6PC、PEPCK活性抑制率为分别为22.86%（P < 0.01）、17.33%（P < 0.05）。结论鸡树条荚蒾果多酚可提高IR- HepG2细胞的HK、PK活性，加快糖酵解，增加糖原含量；抑制G6PC、PEPCK活性，从而减少细胞内源性葡萄糖的产生。所以鸡树条荚蒾果多酚对胰岛素抵抗细胞的治疗具有一定效果。      

定点突变FGF21提高表达量研究

FGF21是一类具有重要糖脂代谢调节功能因子,是治疗2型糖尿病候选药物。但其在大肠杆菌中表达量低且主要以包涵体形式表达,为此根据FGF21与FGF家族同源序列差异,对FGF21进行定点突变以提高其表达量。以pSUMO-FGF21表达载体为模板,在突变位点两端设计引物,采用定点突变方法,将FGF21141位甘氨酸(G)突变为苯丙氨酸(F),构建突变FGF21表达载体pSUMO-mutFGF21;在大肠杆菌中进行表达,纯化mutFGF21蛋白。利用SDS-PAGE和Western blot鉴定分析突变蛋白,HepG2细胞糖吸收试验检测突变蛋白活性。结果成功对pSUMO-hFGF21进行突变,突变蛋白在大肠杆菌中成功表达,经SDS-PAGE分析,主要以可溶形式表达;与野生型FGF21(hFGF21)相比,表达量提高50%。Western blot表明mutFGF21可与FGF21抗体特异性反应。糖吸收试验显示mutFGF21具有与hFGF21一样生物活性并存在剂量依赖性,相比hFGF21,mutFGF21活性略有提高,说明定点突变FGF21(141位G突变为F)可显著提高FGF21表达量。     

褐飞虱GSK-3调控糖原与海藻糖代谢的潜在功能

【目的】昆虫胰岛素信号途径能够介导糖原合成酶激酶3（glycogen synthase kinase 3,简称GSK-3或GSK3）调控体内糖原及海藻糖等糖代谢过程,从而控制昆虫的各项生命活动。论文旨在探究糖原合成酶激酶在褐飞虱（Nilaparvata lugens）体内对糖原与海藻糖代谢的调控作用。【方法】首先,基于GSK-3的cDNA编码序列,利用ExPASy工具翻译GSK-3氨基酸序列,预测蛋白分子量大小及等电点（pI）;然后利用SignaIP4.1Server对其信号肽进行分析。其次,以笔者实验室饲养的褐飞虱为研究对象,从4龄开始,每12 h取材,取至成虫48 h。利用Trizol法提取褐飞虱总RNA,根据反转录试剂盒合成第一链DNA,以18S作为内参基因,通过实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测褐飞虱GSK-3在不同龄期mRNA水平上的相对表达量。然后利用RNAi技术,向褐飞虱体内显微注射双链RNA(dsRNA)抑制GSK-3,以注射dsGFP的褐飞虱作为对照组。注射后48 h利用qRT-PCR技术检测GSK-3的表达情况,确定抑制效果。另外,取注射后48 h虫体,分别测定褐飞虱体内海藻糖、葡萄糖、糖原含量及海藻糖酶（trehalase,TRE）活性变化。最后采用qRT-PCR检测胰岛素信号通路胰岛素受体基因(insulin receptor,InR)、类胰岛素多肽基因(insulin-like peptides,Ilps)及海藻糖代谢途径TRE、海藻糖合成酶基因(trehalose-6-phophate synthase,TPS)、糖原磷酸化酶基因(glycogen phosphorylase,GP)、糖原合成酶基因(glycogen synthase,GS)中相关基因的表达,分析GSK-3在胰岛素信号通路及海藻糖代谢途径中的调控作用。【结果】褐飞虱GSK-3开放阅读框为1 914 bp,编码637个氨基酸;预测蛋白分子量为69.25 kD,等电点为9.15,为偏碱性蛋白,无信号肽结构,序列高度保守。发育表达模式结果显示GSK-3在不同发育阶段表达不一致,5龄若虫蜕皮前后低表达。GSK-3的dsRNA注射后48 h,与对照组dsGFP相比,GSK-3表达极显著下降,表明RNA干扰效果明显。糖原含量和两类海藻糖酶活性显著下降,而海藻糖含量显著上升,推测糖原和葡萄糖转化为海藻糖,作为其生理活动的能量来源。qRT-PCR检测发现,当GSK-3表达抑制后48 h,TRE1-2的表达量显著下降,而TRE1-1和TRE2的表达量极显著下降。另外,2个TPS基因、GS以及GP的表达量均极显著下降;胰岛素信号通路的2个InR基因和4个Ilps基因的表达同样被抑制,间接表明InR能够调控GSK-3的表达。【结论】褐飞虱GSK-3低表达后能够通过调控胰岛素信号通路及海藻糖代谢途径相关基因表达来调控糖原及海藻糖代谢。相关研究结果有助于更加全面地探索褐飞虱等昆虫糖原合成酶激酶调控海藻糖及糖类物质平衡的潜在分子机理。     

沙蒿多糖及其衍生物的体外降血糖作用

采用HepG2细胞研究沙蒿多糖(ASP)及其衍生物的体外降血糖作用,检测24 h的葡萄糖摄取量(GU),并用MTT法检测细胞毒性.结果表明:在高糖环境下,ASP及其硫酸化衍生物(SASP)、磷酸化衍生物(PASP)和硒酸化衍生物(SeASP)可不同程度地促进细胞的葡萄糖消耗,其中以SASP的促进作用最为显著;四甲基偶氮...     

不同剂量胰岛素、胰高血糖素和甲状腺素处理对奶牛乳腺上皮细胞FcRn mRNA表达的影响

 【目的】采用real-time PCR方法检测体外激素处理对奶牛乳腺上皮细胞FcRn（neonatal Fc receptor,FcRn）mRNA表达的影响。【方法】在乳腺上皮细胞培养液中添加不同浓度胰高血糖素（0.01、0.1和1 μmol•L-1）、胰岛素（0.005、0.1和0.5 μmol•L-1）、甲状腺素T4（0.01、0.1和1 μmol•L-1）,体外培养并收集细胞,提取细胞mRNA后,利用real-time PCR检测FcRn mRNA的相对丰度。【结果】在一定添加剂量范围内,随着添加剂量的增加,甲状腺素和胰高血糖素能够显著地促进FcRn mRNA表达量升高（P＜0.05）,胰岛素在添加量为0.005 μmol•L-1和0.5 μmol•L-1时FcRn mRNA的表达量低,但在0.1 μmol•L-1添加时表达量显著升高（P＜0.05）。【结论】添加外源胰岛素、胰高血糖素和甲状腺素能够影响FcRn mRNA的表达,为进一步研究乳腺内FcRn受体变化以及影响因素提供了依据。