转hFat-1基因猪外源基因整合分析及拷贝数测定

对转人源化Fat-1基因猪的15头传代仔猪进行PCR检测,发现有7头阳性猪,其断奶后成活5头仔猪。对这5头仔猪进行Southern印迹杂交试验,确认3头仔猪整合有hFat-1基因。采用荧光实时定量PCR法测定原代转hFat-1基因公猪及3头阳性仔猪外源基因的拷贝数,分别是2、1、1、2个拷贝。转hFat-1基因猪能够将外源基因遗传到下代仔猪,但外源基因具有遗传不稳定的趋向。     

转Fat-1基因猪外源基因遗传稳定性分析

测定转Fat-1基因猪外源基因遗传稳定性,为转基因猪育种选择优质新材料提供基础数据。采用PCR和Southern印迹杂交方法对转Fat-1基因传代生产仔猪进行检测,了解Fat-1基因在猪基因组中的整合情况,统计传代猪转基因阳性比率,与自然基因单等位基因正常遗传比率进行差异显著性分析。结果显示,F2代传代仔猪Fat-1基因阳性比率为57.14%,F3代传代仔猪阳性比率为46.67%。F1代公猪外源Fat-1基因是1拷贝基因,传代配种母猪使用非转基因母猪,仔猪阳性比率与自然基因单等位基因正常遗传比率(50%)差异不显著。Fat-1基因在猪育种传代过程中遗传力没有下降,转Fat-1基因公猪能够稳定遗传生产后代猪。     

sFat-1转基因猪的遗传特性及基因漂移研究

采用PCR检测方法和Southern印迹杂交试验,研究了转sFat-1基因猪的遗传特性及基因漂移情况。结果表明:F1代转sFat-1基因猪能够将外源基因遗传到F2代,F2代仔猪的sFat-1基因阳性比例为32%。F1代及F2代转sFat-1基因猪均没有对同一生产场的猪群产生sFat-1基因漂移。     

转绿色荧光蛋白标记基因猪整合检测的研究

[目的]为转基因猪生产的整合效率、外源目的基因表达水平、目的基因在猪体内组织特异性表达分布等相关领域的进一步研究奠定基础。[方法]用显微注射法将GFP标记的转基因猪表达载体PM1导入湖北白猪和通湖猪1-细胞、2-细胞胚胎中,胚胎移植妊娠后生产仔猪,取耳或尾组织样提取基因组总DNA,用PCR法检测PM1在猪基因组中的整合情况。[结果]在所有生产的78头仔猪中,有6头猪用PCR检测为转PM1基因阳性猪,这6头猪在3次PCR扩增反应中都得到650 bp目的扩增片段。其他样品没有得到目的扩增片段的为阴性猪。[结论]载体PM1可以用于携带外源基因进行转基因猪生产。     

精子介导生产转hCD59基因猪

为研究精子介导法生产异种器官移植用转基因猪的效率,将人膜反应性溶解抑制物(hCD59)基因与脂质体混合制成基因/脂质体复合物,分别采用睾丸注射法和基因脂质体复合物/精子共孵育法制备转人hCD59基因猪,其中睾丸注射法处理公猪1头,44 d后配母猪8头,7头受孕(受孕率87.5%),产仔73头,PCR阳性猪3头(阳性率4.3%);外源基因/精子共孵育法处理公猪4头,处理母猪4头,1头受孕(受孕率25%),产仔11头,PCR阳性猪1头(阳性率9%)。从15头受孕母猪共获得84只仔猪,经PCR初步检测,其中4只仔猪为转基因阳性,阳性率4.8%。研究结果表明:通过精子介导法可以获得转基因猪。     

Dot-blot对转DAF基因猪外源基因整合的检测

衰变加速因子(DAF)是补体激活途径中的一个重要膜调节蛋白，转人DAF基因猪可以作为人器官移植的供体。采用斑点杂交试验(Dot-blot)，对经显微注射导入了hDAF质粒片段、用聚合酶链反应(PCR)鉴定的阳性猪所产仔猪32头进行了整合检测，获得转基因阳性仔猪14头。说明了Dot-blot可作为转基因动物外源基因整合检测的一种手段。     

sFat-1转基因猪遗传稳定性和7种疾病易感性测试(英文)

[目的]测试sFat-1转基因猪的遗传稳定性,以及对7种疾病的易感性差别。[方法]采用PCR法检测传代仔猪sFat-1基因整合情况,并用ELISA和PCR法检测转基因猪对伪狂犬病、钩端螺旋体病、猪密螺旋体痢疾、布鲁氏菌病、轮状病毒、结核杆菌病和猪支原体肺炎的感染情况。[结果]sFat-1转基因猪F3代仔猪阳性比例为18.5%,转基因阳性猪和阴性猪对7种疾病的易感性没有明显差别。[结论]sFat-1转基因猪外源基因遗传不稳定,转基因阳性和阴性猪体质整体情况接近。     

精子与慢病毒孵育制备转基因猪的分子检测及遗传分析

【目的】在前期精子与慢病毒孵育法制备的转基因猪基础上,进一步探讨外源基因在转基因猪上的遗传状况.【方法】通过转基因猪与野生猪交配扩繁后,运用PCR和Southern-blot法对转基因G_1和G_2代进行外源基因的检测与遗传分析.【结果和结论】采用PCR法检测,G_1代PCR阳性率为25.42%(15/59);G_2代PCR阳性率为46.67%(7/15).在12头阳性转基因猪的13种组织中,外源基因在多种组织中均有存在;对阳性转基因猪的胃、垂体、下丘脑组织的RT-PCR检测结果显示,外源基因在66.67%(24/36)的组织样品中均有表达.表明在精子与慢病毒共孵育法制备的转基因猪中,外源基因能整合到猪的基因组,并遗传给后代.     

异种器官移植转基因猪检测系统的建立

以 PCR、免疫荧光、细胞毒试验在 DNA、表达、功能水平对转 h DAF基因猪进行了检测。结果表明 :转基因猪的整合率为 19.35 % ( 18/ 93) ;在 14头转基因阳性猪中 ,有 7头动脉肌肉层表达了外源 h DAF基因 ,6头猪的外源基因表达产物可以抑制猪淋巴细胞的裂解     

异种器官移植转基因猪检测系统的建立

以PCR、免疫荧光、细胞毒试验在DNA、表达、功能水平对转hDAF基因猪进行了检测。结果表明：转基因猪的整合率为19．35％（18／93）；在14头转基因阳性猪中，有7头动脉肌肉层表达了外源hDAF基因，6头猪的外源基因表达产物可以抑制猪淋巴细胞的裂解。