紫花苜蓿MsWRKY42的分离、鉴定及其对非生物胁迫的响应

【目的】WRKY是转录因子大家族,在植物生长发育及逆境胁迫应答中发挥着核心调控作用。通过分析转录因子MsWRKY42在紫花苜蓿抗逆境过程中的作用,为进一步研究WRKY转录因子在紫花苜蓿抗逆分子调控中的作用奠定基础。【方法】通过同源比对方法从紫花苜蓿转录组基础数据库中获得MsWRKY42序列。使用MEGA-X对MsWRKY42蛋白序列及拟南芥序列进行多序列比对,构建系统发育树。通过PlantCARE预测分析MsWRKY42启动子的顺式作用元件。采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)方法分析MsWRKY42在紫花苜蓿不同组织中的表达量及其在NaCl(0.3 mol·L~(-1))、PEG(15%)、4℃、40℃、低磷以及ABA(0.1×10~(-3) mol·L~(-1))处理后的表达量变化。构建pCAMBIA1300-WRKY-GFP融合表达载体,通过农杆菌转化本氏烟草(Nicotiana benthamiana),确定MsWRKY42蛋白的亚细胞定位。利用酵母单杂交系统检测MsWRKY42和启动子区域顺式作用元件W-box的体外结合活性。【结果】该基因包含1个1 692 bp的开放阅读框,编码563个氨基酸。多序列比对及系统进化树分析表明,该蛋白属于Ⅱb类WRKY家族成员,含有1个WRKY保守结构域和1个C2H2锌指基序,与拟南芥WRKY家族中的At WRKY42相似度最高,故将其命名为MsWRKY42。在紫花苜蓿MsWRKY42启动子区域鉴定到多个顺式作用元件,主要包括胁迫响应、激素响应、生长发育等不同生命活动相关的调控作用元件。实时荧光定量PCR结果表明,MsWRKY42在紫花苜蓿各组织中均有不同程度的表达,其中根、叶中的表达量最高,茎、花、荚果中次之,芽中最低。经NaCl、PEG、低温、高温、低磷和ABA处理后的MsWRKY42表达量均有不同程度的上调。亚细胞定位结果显示,MsWRKY42蛋白定位在细胞核上。酵母单杂交系统检测结果显示,MsWRKY42能够与W-box顺式作用元件特异性结合。【结论】MsWRKY42为典型的WRKY转录因子,蛋白质定位在细胞核,能够与W-box顺式作用元件特异性结合;该基因在紫花苜蓿不同组织部位中均有表达,在根和叶中的表达量最高,且表达受NaCl、PEG、低温、高温胁迫和ABA激素的正向诱导。在紫花苜蓿中,该基因可能参与多种非生物胁迫反应。     

茶树CsWRKYIIcs转录因子的克隆及功能分析

【目的】以‘陕茶1号’为材料,克隆CsWRKYIIcs转录因子并分析序列特征,了解其在不同组织和非生物胁迫下的表达模式以及转录活性,为深入研究茶树在逆境胁迫中的功能提供理论依据。【方法】根据茶树基因组数据库注释的WRKY序列设计特异性引物,采用RT-PCR技术从‘陕茶1号’中扩增CsWRKYIIcs的cDNA序列,用生物信息工具分析序列的特点,实时荧光定量PCR（qRT-PCR）研究基因的表达模式,用酵母试验验证其转录活性。【结果】获得9条CsWRKYIIcs的cDNA序列,开放阅读框长度分别为561、960、936、978、897、912、720、1 008和969 bp,分别编码186、319、311、325、298、303、239、335、322个氨基酸。除了CsWRKYIIc7缺少锌指序列外,其他CsWRKYIIcs均含有1个WRKY保守结构域和典型的C₂H₂型锌指结构。不同物种中的WRKYIIcs具有相似的保守基序,而茶树CsWRKYIIcs和拟南芥、葡萄等双子叶植物的WRKYIIcs氨基酸序列相似性更高。另外,CsWRKYIIcs启动子区域均预测到多个与非生物胁迫相关的顺式作用元件,意味着其可能参与非生物胁迫响应。qRT-PCR结果表明,9个CsWRKYIIcs在根和花中的表达量高于茎和叶,具有一定的特异性。同时,在干旱、ABA、高温和高盐胁迫下被不同程度的诱导表达,其中CsWRKYIIc1和CsWRKYIIc7的表达量变化显著,与推定的顺式作用元件结果相符。酵母试验表明9个茶树CsWRKYIIcs均具有转录激活活性。【结论】克隆获得9个茶树CsWRKYIIcs转录因子,它们参与了茶树对ABA、干旱、高温和高盐胁迫的响应,也可能发挥转录激活因子的调控作用。CsWRKYIIc1和CsWRKYIIc7可作为候选基因深入研究茶树的抗逆功能。     

紫花苜蓿MsGAI的克隆、表达及遗传转化

【目的】 DELLA蛋白属于GRAS家族,是赤霉素信号转导途径中重要的转录因子,负向调节GA转导途径。克隆获得紫花苜蓿GAI,分析其基因生物信息学特征并预测蛋白结构域。明确紫花苜蓿GAI组织表达特征及不同处理下的表达模式,构建该基因超表达载体并转入紫花苜蓿,以探究DELLA蛋白基因在紫花苜蓿赤霉素（GA）信号转导途径及胁迫条件下的作用机理。【方法】 利用同源克隆的方法,从紫花苜蓿中克隆得到MsGAI。利用生物信息学方法分析该基因的序列特征,使用MEGA7.0对MsGAI蛋白序列及同源序列进行多序列比对,构建同源物种间的系统发育树。利用实时荧光定量PCR检测紫花苜蓿各组织GAI表达量以及在PEG、NaCl、GA、ABA和黑暗处理下,GAI的表达变化。同时对转基因GAI株系表达水平进行分析,选择表达量高、中、低株系（L5、L8、L11）分别进行PEG和NaCl处理,分析GAI的表达变化。以pBI121为基础载体,采用双酶切-连接的方法构建植物超表达载体35S:MsGAI-gus。将重组载体转入农杆菌GV3101菌株中,以紫花苜蓿叶片为外植体,采用农杆菌介导的愈伤组织转化法转化紫花苜蓿,经PCR检测和GUS组织化学染色,得到转基因阳性苗。【结果】 该基因序列包含有一个1 818 bp的开放阅读框,编码605个氨基酸。生物信息学分析结果显示,MsGAI蛋白具有GRAS家族的典型结构域和保守区,其中包含N端保守结构域DELLA和TVHYNP,C端保守结构域SAW。多序列比对及系统进化树分析表明,该序列与其他物种的DELLA蛋白序列相似度均高达80%以上,将其命名为MsGAI。该基因与蒺藜苜蓿GAI亲缘关系最近,其次与鹰嘴豆、红三叶等双子叶豆科植物亲缘关系较近,与大麦等单子叶植物较远。实时荧光定量PCR分析表明,MsGAI在紫花苜蓿各组织中均有表达,根中的表达量最高。经PEG、NaCl、GA以及ABA处理后,均有明显响应;黑暗处理显著抑制MsGAI的表达。转基因株系经PEG、NaCl处理后,GAI表达量均上调。对构建完善的35S:MsGAI-gus植物超表达载体进行双酶切检测,琼脂糖凝胶电泳显示,条带大小与预期一致。对转基因植株进行GUS组织染色验证,结果表明,阳性植株呈现蓝色,对照组为白色。对超表达载体携带的MsGAI和GUS序列进行PCR检测均呈阳性。【结论】 紫花苜蓿DELLA蛋白基因的克隆和超表达载体构建成功,MsGAI对逆境胁迫有响应。     

谷子WRKY36转录因子的分子特性及功能鉴定

【目的】干旱等非生物胁迫严重影响了植物的生长和作物的产量。WRKY转录因子广泛参与了植物生长发育、形态建成和代谢调控等过程,在调控非生物胁迫响应中也扮演着十分重要的角色。分析谷子SiWRKY36的分子特性和功能,解析谷子转录因子的抗逆调控机制。【方法】通过对干旱胁迫谷子转录组测序结果分析,获得了一个WRKY转录因子SiWRKY36;利用生物信息学的方法分析谷子SiWRKY36的分子特性;根据SiWRKY36蛋白序列进行同源性搜索,得到与谷子SiWRKY36蛋白序列相似度较高的其他物种的蛋白序列;使用MEGA5对谷子SiWRKY36蛋白序列及其同源序列进行多序列比对分析并构建同源物种间系统进化树;利用MEME和SMART在线工具进行蛋白序列分析;利用GSDS和PHYRE2在线工具分别对谷子SiWRKY36基因结构和三级结构进行分析;从谷子基因组数据库Phytozome获取谷子SiWRKY36上游2 000 bp作为启动子;用PLACE数据库对SiWRKY36启动子顺式作用元件进行分析;利用实时荧光定量PCR检测SiWRKY36在不同胁迫条件下（PEG、低温、NaCl、MeJA、ABA、GA和SA、H₂O₂）的表达模式;分别以8种胁迫处理的谷子cDNA作为模板,以谷子Si001873m.g为内参,以SYBR Green染料法进行real-time PCR。用实时荧光定量PCR仪进行PCR扩增;将SiWRKY36的cDNA序列连入带有CaMV 35S启动子的pBI121表达载体中,构建表达载体pBI121-SiWRKY36,转入农杆菌,侵染野生型拟南芥得到转基因株系。用T₃转SiWRKY36拟南芥植株进行抗性鉴定。【结果】谷子SiWRKY36全长1 485 bp,基因编码区包含UTR区和3个内含子以及4个外显子,与柳枝稷亲缘性最高,属于WRKY转录因子家族的第一类。SiWRKY36编码蛋白包含2个WRKY保守域,预测的SiWRKY36蛋白三级结构包含2个α螺旋结构和3个β折叠结构。启动子元件分析表明SiWRKY36包含ABA-responsive element（ABRE）、MYB、MYC、low-temperature-responsive element（LTRE）、GT-1等多种逆境胁迫应答元件。实时荧光定量PCR结果显示SiWRKY36对多种非生物胁迫和激素均有不同程度的响应,但在H₂O₂和低温处理下基因表达量无明显变化;亚细胞定位结果表明SiWRKY36蛋白主要定位于细胞核中。抗性鉴定结果显示,在不进行任何处理的MS培养基上,野生型拟南芥和过表达株系拟南芥的长势基本一致;在2% PEG的处理条件下,3个转基因株系的根长、根的总表面积和根的总体积要大于野生型拟南芥。【结论】SiWRKY36转基因植株可能对轻度干旱有一定的抗性。     

紫花苜蓿MsDWF4的表达特性及耐盐性效应

【目的】分离紫花苜蓿（Medicago sativa L.）油菜素内酯（brassionsterinds,BRs）合成酶基因MsDWF4,分析基因表达特性,开展基因的耐盐性研究,为揭示MsDWF4对紫花苜蓿非生物胁迫的调控机制提供参考。【方法】根据已知的拟南芥DWF4序列,应用同源克隆技术获得紫花苜蓿MsDWF4,对序列进行生物信息学分析。利用qRT-PCR技术分析MsDWF4的组织表达特异性,及其在多种非生物胁迫（高温、冷害、干旱和高盐）和激素（生长素、油菜素内酯、脱落酸和茉莉酸）处理下的表达模式;构建MsDWF4超表达载体,利用农杆菌介导遗传转化法转化紫花苜蓿,获得超表达MsDWF4的紫花苜蓿株系,用高盐（200 mmol·L ^-1 NaCl）处理紫花苜蓿转基因株系并结合抗氧化酶活性分析,研究MsDWF4是否提高紫花苜蓿的耐盐性。【结果】获得MsDWF4的cDNA序列,其CDS全长1 470 bp,编码489个氨基酸,该基因编码的蛋白质为P450超家族成员,共含有67个激酶磷酸化位点。序列分析和系统发育树分析表明紫花苜蓿MsDWF4与蒺藜苜蓿DWF4的亲缘关系最近,与禾本科的亲缘关系最远。组织特异性表达分析表明,MsDWF4在根尖中表达量最高,花和叶中次之。高温、冷、PEG、NaCl、ABA和IAA均诱导该基因在植株地上部和根部的表达;在BR处理下,MsDWF4在地上部下调表达,而在根部先被诱导后被抑制;JA处理下,MsDWF4在地上部和根中皆被抑制。构建35S∷MsDWF4超表达载体,并通过农杆菌介导的方式转化紫花苜蓿,PCR鉴定结果显示MsDWF4已经成功转入紫花苜蓿,并获得6个转基因阳性株系。盐胁迫处理下,转基因株系MsDWF4的表达量和抗氧化酶活性均显著高于对照。【结论】获得紫花苜蓿油菜素内酯合成酶基因MsDWF4的CDS序列;该基因在根尖等生长旺盛部位表达最高,基因表达响应多种逆境胁迫和外源激素处理;MsDWF4提高转基因紫花苜蓿对盐胁迫的抗性。MsDWF4可能参与转基因紫花苜蓿的多种逆境响应过程,并且正向调控紫花苜蓿的耐盐性。     

苹果磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶基因（PEPCKs）的克隆与表达分析

【目的】克隆苹果（Malus×domestica Borkh.）多个代谢途径中的关键酶磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶（phosphoenolpyruvate carboxykinase,PEPCK）基因MdPCKs,研究其在不同组织器官及不同胁迫处理条件下的表达特性,为解析该基因在多个代谢途径中的功能奠定基础。【方法】利用同源比对和RT-PCR技术,克隆获得MdPCK1和MdPCK2全长cDNA序列并进行生物信息学分析;克隆MdPCKs的启动子序列,利用PlantCARE软件在线分析启动子上的顺式作用元件;采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测MdPCKs在不同组织中的表达以及在水杨酸（SA）、茉莉酸（JA）、脱落酸（ABA）、模拟干旱（PEG）、高温（40℃）和低温（8℃）处理条件下的表达特性。【结果】获得2个苹果磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶基因（MdPCK1和MdPCK2;GenBank登录号分别为KT454964和KT454965）,其开放阅读框（open reading frame,ORF）分别为2 001 bp和2 028 bp,分别编码666和675个氨基酸残基;基因结构和进化分析表明,MdPCK1和MdPCK2均由12个外显子组成,且序列结构进化高度保守;氨基酸序列和结构分析显示,二者均含有保守的PEPCK ATP domain区域;启动子分析显示,MdPCK1和MdPCK2启动子区域含有多个顺式作用元件,包括光响应元件、昼夜节律相关顺式作用元件、JA响应元件、SA响应元件、ABA响应元件、防御及逆境响应元件、低温响应元件和热激响应元件等;qRT-PCR结果显示,MdPCKs在被检测的组织中均有表达。在‘泰山嘎啦’苹果果实不同发育阶段,MdPCK1和MdPCK2具有相似的表达模式。在多种非生物胁迫处理下,MdPCK1受到100 μmol·L^-1 ABA和100 g·L^-1 PEG胁迫诱导;MdPCK2受到150 μmol·L^-1 SA、100 μmol·L^-1 ABA、100 g·L^-1 PEG和低温胁迫诱导。【结论】MdPCK1和MdPCK2属于植物PEPCK家族,非生物逆境胁迫可诱导MdPCK1和MdPCK2表达。     

库尔勒香梨kfpSPL及其启动子克隆分析

【目的】 研究库尔勒香梨萼片脱落、宿存与kfpSPL基因之间存在的关系,并克隆该基因及其启动子。【方法】以库尔勒香梨花器官作为材料,库尔勒香梨kfpSPL基因的cDNA序列以及梨基因组信息为模板设计引物,通过PCR获得该基因及其启动子,进行上游调控序列顺式作用元件的预测分析(PLACE数据库和PlantCare数据库)。【结果】克隆获得kfpSPL基因的基因组DNA序列长度为3 320 bp和2 332 bp的上游启动子调控序列,kfpSPL基因的基因组DNA与Pyrus bretschneideri 数据库中的一段长度相同的序列具有99%的同源性,E值为0,并发现该基因有三段内含子,将克隆得到的启动子序列在梨全基因组序列数据库中进行相似性搜索,发现克隆得到的上游启动子序列的1~796 nt和1 042~2 332 nt分别与scaffold291.0中290 783~289 988 nt和289 990~288 701 nt的同源性为96%和97%,E值均为0。以生物信息学分析为依据,kfpSPL启动子序列中存在一些相关的调控元件,赤霉素响应元件GARE-motif、P-box,光响应中的顺式作用元件ACE、 Box II、CATT-motif、G-box、TCT-motif、Box 4,防御和应激反应中的顺式作用元件TC-rich repeats, 启动子和增强子区的共同顺式作用元件CAAT-box等,转录起始的核心启动子元件TATA-box等。【结论】kfpSPL基因启动子序列中存在与赤霉素、脱落酸、水杨酸等激素相关的顺式作用元件,不同生长调节剂处理脱萼果和宿萼果的花器官可以调控kfpSPL基因的表达水平。     

番茄DIR基因家族鉴定及其对非生物胁迫响应的分析

【目的】鉴定番茄DIR基因家族所有成员,并对其基因结构、编码蛋白的理化性质、系统进化、染色体定位、共线性、启动子元件、表达模式、互作转录因子及内源竞争RNA预测等进行了解析,为探究DIR在番茄生长发育和逆境胁迫中的作用提供参考。【方法】采用生物信息学方法,基于全基因组数据对番茄DIR基因家族成员进行鉴定,运用Phytozome、MEME、PlantCARE、opsRNATarget和plantcircnet等在线网站获取染色体位置、保守基序、顺式作用元件、存在互作的转录因子、miRNA和circRNA等信息。利用Mapteace、TBtools、Cytoscape、OmicShare等作图软件及工具绘制染色体定位图、进化树、DIR与转录因子关系图、ceRNA网络等。采用NCBI的基因数据库结合转录组测序及qRT-PCR试验研究DIR基因家族在逆境下的表达情况。【结果】共鉴定到番茄中27个DIR基因,将其命名为SlDIR1—SlDIR27,分别位于12条染色体上,且大部分基因位于染色体末端,其基因结构、基序和结构域相对保守,其中22个SlDIR具有一个外显子的经典结构。番茄DIR基因家族同拟南芥的共线性关系远高于水稻和大豆。基于系统进化关系将27个番茄DIR成员分为3个不同的亚家族。转录组数据表明大部分DIR基因在番茄根部具有较高的表达量。此外,DIR基因的启动子区域含有多个与干旱、低温等非生物胁迫,以及MeJA、ABA、SA等激素诱导相关的顺式作用元件,且预测到与激素、生长发育、非生物胁迫相关的ERF、E2F/DP、MYB等互作转录因子。结合转录组数据分析,分别有5、10、10和13个SlDIR在农药、干旱、盐和冷胁迫后显著上调表达,其中,SlDIR23受到以上4种胁迫的诱导表达,而SlDIR8、SlDIR13和SlDIR20特异性响应冷胁迫的诱导,SlDIR17特异性响应盐胁迫。番茄DIR的ceRNA调控表明,miR-156与靶基因SlDIR8可能共同作用调控番茄的逆境胁迫。【结论】共鉴定出番茄DIR家族基因27个,不均匀地分布在12条染色体上,在根部有较高的表达量。SlDIR1、SlDIR13和SlDIR14等具有MeJA、ABA、SA等激素响应元件,其中,SlDIR6仅具有MeJA元件,SlDIR27仅具有SA响应元件。另外,SlDIR2、SlDIR14、SlDIR23等参与干旱、盐、低温等多种逆境胁迫,其中SlDIR23在不同胁迫处理下均可被激活。此外,DIR基因和转录因子、非编码RNA相互作用,共同参与调控番茄植株的逆境胁迫。     

陆地棉GhWRKY33的克隆及抗旱功能分析

【目的】 通过克隆陆地棉GhWRKY33并研究其抗旱功能,为棉花抗旱机制解析及分子育种奠定基础。【方法】 利用同源克隆的方法从陆地棉中棉所10号中克隆GhWRKY33的开放读码框（open reading frame,ORF）,并进行生物信息学分析,分析该基因的二级结构、亲疏水性,预测磷酸化位点和启动子区域的顺式作用元件,在NCBI中通过BLASTP检索同源性高的蛋白序列进行序列比对并构建系统发育树;构建35S::GhWRKY33-GFP融合表达载体,通过农杆菌介导注射烟草叶片,观察荧光信号;利用qRT-PCR检测基因的组织表达特异性,以及干旱、ABA、JA、ET处理下的基因表达模式;构建GhWRKY33过表达载体并转化拟南芥,利用20% PEG6000对野生型和T₃代转基因拟南芥进行干旱处理,观察处理后野生型和转基因拟南芥的表型,并测定脯氨酸和丙二醛含量等生理生化指标,分析目的基因与干旱响应基因AtP5CS、AtRD29A、AtCOR15A的表达水平。【结果】 从陆地棉品种中棉所10号克隆获得GhWRKY33的ORF全长为1 533 bp,编码一个含510个氨基酸残基的蛋白,含有2个WRKY保守结构域和2个C₂H₂型锌指结构,属于第Ⅰ类WRKY转录因子家族;二级结构预测其编码的蛋白主要由无规则卷曲构成,含有26个苏氨酸磷酸化位点,推测可能与磷酸化有密切的关系,亲疏水性预测表明该蛋白属于亲水性蛋白;系统发育树分析显示该蛋白与GrWRKY33同源性最高。亚细胞定位将GhWRKY33定位于细胞核。qRT-PCR显示该基因具有明显的组织表达特异性,在棉花顶芽的表达量最高;干旱、ABA、JA、ET处理后,基因的表达量明显上升。干旱胁迫后,与野生型相比,转基因拟南芥的抗旱性水平明显提高,植株萎蔫程度较轻,其脯氨酸含量显著升高,丙二醛含量显著降低,且目的基因与干旱响应基因AtP5CS、AtRD29A、AtCOR15A的表达水平均明显提高,表明PEG诱导了该基因的表达,进而调控了干旱响应基因表达上调,使转基因拟南芥表现出对干旱胁迫的抗性。【结论】 GhWRKY33响应干旱胁迫,过表达后能明显提高转基因拟南芥的抗旱性。     

马铃薯低温响应的ScmiR390-5p及其靶基因表达与结构分析

【目的】研究马铃薯富含亮氨酸重复序列(leucine-rich repeat receptor-like protein kinase LRR-RLK)类受体蛋白激酶基因SCLRRK1受miR390（ScmiR390-5p）调控响应非生物胁迫的机理。【方法】通过低温响应马铃薯miRNA测序分析与靶基因预测,发现ScmiR390-5p通过调控1个可能的LRR类受体蛋白激酶基因对低温做出响应;利用实时荧光定量PCR技术（Quantitative Real-time PCR,RT-qPCR）验证ScmiR390-5p和SCLRRK1响应低温胁迫的表达情况;利用RLM-5′RACE确定ScmiR390-5p作用于SCLRRK1的切割位点;利用PCR技术克隆得到SCLRRK1的DNA序列和CDS序列,生物信息学分析SCLRRK1的结构和功能;利用RT-qPCR分析ScmiR390-5p/SCLRRK1在马铃薯各组织中的表达情况及其响应各种非生物胁迫的表达情况。【结果】RT-qPCR结果表明,低温诱导ScmiR390-5p表达,SCLRRK1的表达则受到低温的抑制,ScmiR390-5p和SCLRRK1的表达在低温胁迫下呈负相关性;RLM-5′RACE分析表明,ScmiR390-5p作用于SCLRRK1的切割位点是ATTCCT//CCTGAGTT,马铃薯ScmiR390-5p/SCLRRK1调控模块在低温响应中起作用。克隆结果表明SCLRRK1的CDS序列长度为2 685 bp,编码894个氨基酸,DNA序列长度为3 549 bp,含有1个内含子、2个外显子、3′非编码区和5′非编码区,ScmiR390-5p的靶位点位于SCLRRK1 CDS序列内部（960—981 bp,GGAACTATTCCTCCTGAGTTT）。生物信息学显示SCLRRK1是1个富含亮氨酸重复序列(leucine-richrepeat,LRR)的类受体蛋白激酶基因,编码的蛋白属于跨膜分泌蛋白。马铃薯组织表达RT-qPCR分析显示,ScmiR390-5p在叶中的表达量最高,根次之,茎中（地上茎、块茎和匍匐茎）表达量较低;而SCLRRK1的表达情况与ScmiR390-5p相反,其在叶中的表达最低,在茎中表达最高（匍匐茎>块茎>地上茎）。多种非生物胁迫结果显示,ScmiR390-5p和SCLRRK1表达在NaCl胁迫下呈负相关,ScmiR390-5p受到NaCl胁迫诱导表达。与对照相比,ABA和6-BA处理下ScmiR390-5p表达先下降之后呈波浪小幅回调;6-BA处理下SCLRRK1表达持续升高,ABA处理下SCLRRK1表达先上升后下降。GA₃、PEG和IAA处理8 h时,ScmiR390-5p的表达达到峰值,GA₃、PEG和IAA处理都能诱导SCLRRK1表达,但其变化趋势与ScmiR390-5p相关性不强。【结论】SCLRRK1具备编码LRR类受体蛋白激酶的核酸、氨基酸序列和结构基础,是ScmiR390-5p的靶基因;ScmiR390-5p/SCLRRK1调控模块在马铃薯组织器官中具备明显作用;ScmiR390-5p在转录后水平通过抑制马铃薯SCLRRK1的表达对低温胁迫做出响应,同时,马铃薯ScmiR390-5p/SCLRRK1调控模块在NaCl和6-BA胁迫响应中起作用,但不对ABA、GA₃、IAA和PEG胁迫做出响应,ScmiR390-5p和SCLRRK1分别在转录水平受到ABA、GA₃、IAA和PEG胁迫信号调控。     

紫花苜蓿MsSQE1的克隆及对皂甙合成的功能分析

【目的】鲨烯环氧酶（squalene epoxidases,SQE）是苜蓿皂甙合成途径中的一种限速酶,与苜蓿皂甙的合成密切相关。通过对苜蓿鲨烯环氧酶（MsSQE1）基因的克隆及在苜蓿中过表达,探究鲨烯环氧酶对皂甙合成的作用机制。【方法】以模式植物蒺藜苜蓿鲨烯环氧酶基因序列设计引物,同源克隆苜蓿MsSQE1。对MsSQE1进行生物信息学分析;通过基因枪轰击技术,使MsSQE1在洋葱表皮瞬时表达,进行亚细胞定位。利用qRT-PCR方法分析该基因在根、茎、叶中的表达水平,以及在紫外辐射、ABA和GA₃条件下的表达模式。在茉莉酸甲酯（MeJA）的诱导下,分析MsSQE1的转录水平,及对苜蓿皂甙含量的影响。利用根癌农杆菌转化体系,获得过表达MsSQE1的阳性转基因植株,并测定转基因植株的皂甙含量。【结果】克隆了MsSQE1的cDNA序列,开放阅读框1 578 bp,编码525个氨基酸,等电点为8.59。同源性比对分析,其氨基酸序列与蒺藜苜蓿中SQE1氨基酸序列同源性为98.6%,与拟南芥的同源性为80%。亚细胞定位显示,MsSQE1可能定位于细胞膜。组织特异性表达分析显示,MsSQE1在叶中的表达量最高,茎中次之,根中的表达量最低。在紫外辐射、ABA和GA₃的诱导表达显示,紫外辐射诱导24 h,叶中表达量最高; GA₃（50 μmol·L ^-1）和 ABA（100 μmol·L ^-1）处理,均为8 h叶中表达量最高;MeJA处理能诱导MsSQE1表达量上调的同时苜蓿总皂甙含量也随着MsSQE1表达的上调而增加。分析过表达MsSQE1转基因苜蓿和转空载体苜蓿株系发现,MsSQE1的表达水平和总皂甙含量均升高,其中MsSQE1的表达水平是对照的3.11—9.45倍,总皂甙含量比对照提高14.26%—28.05%,暗示MsSQE1是苜蓿皂甙合成途径中的一种关键调节酶。【结论】从豆科牧草紫花苜蓿中克隆了MsSQE1并进行功能分析。在苜蓿中过表达MsSQE1能增加苜蓿总皂甙含量,暗示MsSQE1的表达影响苜蓿皂甙的生物合成,可能对皂甙的合成有重要的调节作用。     

利用WGCNA鉴定谷子内源脱落酸响应禾生指梗霉胁迫的共表达基因

【目的】脱落酸（ABA）作为一类逆境激素,在植物生长发育、生物胁迫和非生物胁迫中发挥着重要作用。脱落酸受体蛋白PYR/PYL/PCAR及SNF1相关的蛋白激酶（SnRK2）是介导脱落酸信号转导的重要调控因子。本研究通过预测脱落酸及其信号转导途径中关键基因在谷子白发病致病菌禾生指梗霉（Sclerospora graminicola）中的调控作用,为谷子内源脱落酸响应禾生指梗霉侵染的互作研究提供参考。【方法】通过对禾生指梗霉侵染的晋谷21号谷子进行转录组测序和脱落酸含量测定,基于谷子全基因组对脱落酸信号转导通路上的PYL和SnRK2家族基因进行鉴定、分析,利用测定的转录组构建加权基因共表达网络（WGCNA）,并与禾生指梗霉侵染引起的寄主内源脱落酸含量进行关联,预测脱落酸及其下游信号转导基因PYL和SnRK2在谷子与禾生指梗霉互作调控中的关键核心基因;利用qRT-PCR技术对候选基因进行验证。【结果】谷子中存在禾本科中较为保守的PYL和SnRK2家族基因各11个,且在PYL和SnRK2家族基因的启动子上均预测到脱落酸响应元件。在禾生指梗霉侵染后,寄主内源脱落酸在第一、第二时期大量积累,含量显著高于对照组,分别为22.50和18.08 ng·mL^-1,而在第三、第四和第五时期脱落酸含量下降,低于对照组。在基因共表达网络分析中,利用18 535个基因共构建了34个基因共表达模块。通过对脱落酸含量和PYL、SnRK2家族基因的关联分析,预测到MEpaleturquoise和MEbrown模块为核心候选模块。利用GO功能富集和模块关键基因的挖掘共预测到1个PYL家族基因Seita.1G030500和2个SnRK2家族基因Seita.2G394500、Seita.3G03200,以及3个核心基因Seita.4G105600、Seita.6G218100和Seita.9G138400,共6个基因可能在脱落酸及其信号转导调控过程中参与谷子与禾生指梗霉的互作。对预测到的3个核心基因在水稻和拟南芥数据中进行比对,鉴定到Seita.4G105600为转导蛋白/WD40重复超家族蛋白、Seita.6G218100为WRKY57转录因子、Seita.9G138400为TIFY转录因子。qRT-PCR分析表明Seita.2G394500、Seita.4G105600和Seita.6G218100基因在谷子白发病早期表达均上调。【结论】谷子在受到禾生指梗霉侵染后脱落酸会在体内大量积累,预测到1个PYL家族基因、2个SnRK2家族基因、2个转录因子基因和1个WD40家族蛋白基因参与谷子内源脱落酸响应禾生指梗霉侵染过程。qRT-PCR结果表明1个SnRK2家族基因、1个WD40家族蛋白基因和1个WRKY57转录因子基因共3个基因可能在谷子脱落酸响应禾生指梗霉侵染过程中发挥重要作用。     

紫花苜蓿MsMAX2的克隆及功能研究

【背景】分枝是重要的产量构成因子,在紫花苜蓿育种中至关重要。发掘紫花苜蓿分枝相关基因并明确其作用机理,有助于加快紫花苜蓿高产优质育种。MAX2是重要的分枝相关基因,参与多种植物的分枝调控。【目的】通过对紫花苜蓿MsMAX2功能的研究,为建立MsMAX2调控紫花苜蓿分枝发育分子机制奠定基础。【方法】利用同源克隆的方法从紫花苜蓿中获得MsMAX2的基因序列。通过Expy Protparatam、DNAMAN和MEGA-X等软件对MsMAX2进行序列分析并构建系统进化树。采用实时荧光定量PCR（qPCR）方法分析MsMAX2在紫花苜蓿中的组织表达特异性。运用烟草瞬时表达系统确定MsMAX2蛋白的亚细胞定位。利用农杆菌介导的转化方法获得转基因拟南芥,以明确MsMAX2的基因功能。用酵母双杂交技术探明与MsMAX2互作的蛋白。【结果】MsMAX2包含长度为2 136 bp的开放阅读框,编码由711个氨基酸构成的蛋白,属于F-box蛋白超家族。系统进化分析表明,MsMAX2及其同源基因的进化与物种的分化高度相似,表明其是一个功能保守的基因。MsMAX2在紫花苜蓿的颈部组织中表达量最高,苗期叶片和授粉当天的花序中表达量较高,根中次之,其他组织表达量相对较低,暗示其在紫花苜蓿多个组织中发挥作用。亚细胞定位试验表明MsMAX2蛋白定位于细胞核中。在拟南芥max2突变体中过表达MsMAX2可互补突变体的多分枝表型。酵母双杂交试验表明MsMAX2与激素受体D14存在依赖于独脚金内酯的相互作用。【结论】获得在紫花苜蓿颈部组织中高水平表达的MsMAX2,其编码的蛋白定位于细胞核中;MsMAX2在拟南芥多分枝突变体max2中过表达时,能够互补突变表型,表明MsMAX2参与植物的分枝调控,其功能保守。     

柑橘U-box基因家族的鉴定及表达分析

目的通过生物信息学分析U-box在柑橘基因组中的分布、结构及进化,研究家族成员在不同组织中的表达特异性以及对非生物胁迫和激素的响应,解析柑橘U-box基因家族的生物学功能。方法 根据已经报道的拟南芥U-box基因,利用Phytozome数据库中的BLASTp工具鉴定柑橘基因组中的U-box基因。采用MEGA6.0、Cello、SMART、GSDS2.0、ExPASy和MapChart等软件构建系统进化树、亚细胞定位预测、预测蛋白的相对分子质量与等电点等理化性质、绘制家族成员Scaffold定位图等,分析U-box基因家族在低温胁迫下表达模式,利用实时荧光定量PCR技术（qRT-PCR）检测柑橘U-box基因家族部分成员在NaCl、PEG6000和不同激素处理下的表达情况。结果 从柑橘克里曼丁（Citrus clementina）全基因组中鉴定出56个CcPUBs基因家族成员,可将其分为7类,即U-box only、U-box+ARM-1、U-box+WD40-1、TPR+U-box、Kinase+U-box、U-box+ARM-2和U-box+WD40-2。该家族蛋白理论等电点分布在5.19—9.14,编码的氨基酸数目介于281—1 441;亚细胞定位预测结果显示该基因家族成员位于细胞不同位置,主要位于细胞核或叶绿体,少数位于质膜;聚类分析发现,柑橘U-box与单子叶植物水稻的亲缘关系较远,柑橘中具有相同结构域的成员和拟南芥具有相同结构域的成员聚在一起,表明柑橘U-box成员具有不同生物学功能;Scaffold定位分析发现,56个U-box成员分布在1—9 Scafflod上且呈不均分布。在冷胁迫下的RNA-Seq分析结果表明,U-box基因家族参与植物对冷胁迫的应答,并表现出4种不同的应答模式;从柑橘U-box基因家族的5个不同簇上分别选取1个代表基因进行qRT-PCR,分析结果表明,CcPUB48在金柑的各个组织中均有表达,CcPUB9和CcPUB4主要在茎和花中表达,CcPUB10主要在花、茎和幼果中表达,CcPUB41主要在叶和茎中表达,体现了不同U-box成员的组织特异性的表达差异。CcPUB4、CcPUB10和CcPUB41在NaCl胁迫下表达均上调,而CcPUB48在盐胁迫下的表达无明显变化。CcPUB4在Na₂CO₃处理下表达明显上调,与NaCl处理存在一致的表达趋势,而CaCl₂处理下的表达与NaCl处理下的表达趋势却存在差异。在PEG6000的处理条件下,CcPUB4的表达量呈现先上升后下降的趋势,CcPUB9、CcPUB41和CcPUB48在PEG6000的处理下无明显变化。在赤霉素（GA₃）处理下,CcPUB4在3 h时明显上调,在生长素（IAA）和脱落酸（ABA）下呈现无规律变化,CcPUB10在ABA处理下表达量表现出逐渐上升。结论 从柑橘克里曼丁全基因组上鉴定出56个U-box基因成员,各成员均含有U-box保守结构域,并位于细胞的不同位置。U-box基因家族参与植物对冷胁迫的应答并表现出4种不同的应答模式,在NaCl、PEG6000和激素处理下,CcPUB4和CcPUB10有不同程度的响应,而CcPUB9、CcPUB41和CcPUB48响应不明显或未响应。     

普通小麦转录因子基因TaWRKY35的克隆及功能分析

【目的】非生物逆境是制约小麦生产的主要因素。WRKY转录因子是植物特有的转录因子家族,参与对多种非生物逆境胁迫的应答。普通小麦基因组中至少含有200个WRKY,目前仅对少数成员的功能进行了鉴定。通过克隆小麦WRKY转录因子TaWRKY35并揭示其功能,为改良小麦的抗逆性提供基因资源。【方法】利用小麦全长cDNA数据信息,从强抗旱小麦品种旱选10号中克隆逆境胁迫应答转录因子基因TaWRKY35;采用实时定量PCR技术,分析目标基因在不同发育时期、不同组织器官中的表达水平,以及在PEG-6000、NaCl、ABA和低温等逆境胁迫下的表达模式;构建目标基因与GFP融合的表达载体,转化小麦原生质体,以确定目标蛋白在细胞中的作用位置;构建TaWRKY35过表达载体,通过农杆菌介导的方法转化拟南芥,揭示目标基因的功能。【结果】TaWRKY35的开放阅读框全长1 134 bp,编码377个氨基酸的蛋白。TaWRKY35的N端有一个典型的WRKY结构域,C端有一个C₂HC型的锌指结构域,属于WRKY家族第Ⅲ亚家族。测序发现TaWRKY35编码区序列非常保守,在32份多态性较高的六倍体小麦材料中未检测到DNA多态性。TaWRKY35在小麦的不同发育时期、不同组织中均有表达,其中在幼苗根基部表达量最高,约为苗期叶片中表达量的26倍;其次为幼芽根基,约为苗期叶片中表达量的21倍;接下来依次为孕穗期茎节、孕穗期穗、芽期根、孕穗期根、苗期根、胚芽、孕穗期叶片,而在幼苗叶片中表达水平最低;同时在ABA、NaCl、PEG和低温胁迫条件下,小麦幼苗TaWRKY35的表达量均显著上升,表明TaWRKY35参与对4种逆境胁迫的应答,但在不同胁迫条件下表达模式差异显著,其中对盐胁迫最敏感。亚细胞定位发现,TaWRKY35特异定位在细胞核上,是典型的核定位蛋白。在高盐胁迫条件下,TaWRKY35过表达转基因拟南芥子叶白化率显著低于对照,TaWRKY35过表达转基因拟南芥的细胞膜稳定性和幼苗存活率均显著高于野生型对照,表明TaWRKY35能增强植物的耐盐性。【结论】TaWRKY35编码蛋白含有WRKY和C₂HC结构域,为WRKY家族第Ⅲ亚家族成员。TaWRKY35在小麦发育的不同时期、不同组织中均有表达,且受ABA、PEG、NaCl及低温等逆境胁迫诱导。过表达TaWRKY35能显著提高转基因拟南芥的耐盐性。     

独行菜抗冷相关基因的克隆及表达分析

【目的】独行菜在种子萌发和幼苗生长阶段可耐受一定程度的低温胁迫,研究独行菜的低温耐受机制。【方法】设计兼并引物,从独行菜冷诱导叶片的cDNA中克隆获得LaCBF3和LaCOR15a基因核心片段。利用半定量RT-PCR法分析两个基因在不同胁迫处理下的表达情况。【结果】获得442 bp LaCBF3及405 bp LaCOR15a核心片段,经比对与拟南芥CBF3、COR15a基因核心片段相似性分别为84.38%、81.8%。半定量RT-PCR结果显示在独行菜幼苗中,LaCOR15a基因不仅响应低温胁迫,还能迅速响应高盐、干旱及ABA处理,不同条件下表达各有差异。LaCBF3仅对低温胁迫响应迅速。【结论】LaCBF3、LaCOR15a在独行菜幼苗响应低温胁迫的分子机制中具有重要的调控作用,且LaCOR15a基因也应答干旱、高盐等非生物胁迫。