6个小麦抗叶锈病近等基因系的cDNA-AFLP差异表达分析

应用cDNA-AFLP技术对小麦抗叶锈病近等基因系TcLr9、TcLr15、TcLr19、TcLr25、TcLr38、TcLr45和感病亲本Thatcher间的表达差异进行分析,共选用226对引物组合对其进行筛选,检测出7 554条条带,平均每对引物可获得33条扩增条带。筛选出68对引物能够在小麦抗叶锈病近等基因系TcLr9、TcLr15、TcLr19、TcLr25、TcLr38、TcLr45和感病亲本Thatcher之间扩增出特异表达条带,特异表达检出率为30.1%。68对引物共扩增出84条特异表达条带,并根据基因表达与否及表达量划分为9种不同的特异表达类型(I~IX)。其中,I、V和VII型特异表达类型为组成型表达,共49条;II、IV、VI和VIII型特异表达类型表达上调,共21条;III和IX型特异表达类型表达下调,共14条。有5种特异表达类型(IV、V、VI、VII、VIII型)可能与小麦的抗病反应相关,并且这5种特异表达类型又分为两类亚型,第一类亚型是小麦抗叶锈病近等基因系与小麦叶锈菌互作时特异表达(I V型)或者表达量明显增加(VI、VIII型),为诱导性特异表达类型;第二类亚型为组成型特异表达类型(V、VII型)。     

小麦NBS-LRR类抗病基因同源cDNA序列的克隆与表达分析

为获得小麦抗叶锈病相关基因,以小麦近等基因系TcLr19所构建的非亲和cDNA文库中获得的EST序列(Contig 914)为靶序列,用RT-PCR方法和cDNA末端快速扩增技术,分离克隆到片段为3 042bp的全长cDNA序列。序列分析表明该序列符合典型单子叶植物的CC-NBS-LRR结构模式,命名为TaNLR。该基因包含一个完整的2 739bp的开放阅读框(ORF),具有连续的Poly A尾和典型的加尾信号AATTAA。ProtParam程序预测表明该基因编码912个氨基酸。发育树分析显示该氨基酸序列与大麦的NBS-LRR类抗病基因蛋白同源性最高达89%。荧光定量PCR分析表明,在小麦与叶锈菌互作中,TaNLR基因受叶锈菌诱导下调表达。本研究在TcLr19小麦中成功获得了抗病同源基因,这为明确NBS-LRR在小麦抗叶锈病中的作用奠定了基础。     

小麦类受体蛋白基因TaRLP19 cDNA序列克隆及分析

为筛选小麦叶锈病抗病相关基因,以从小麦近等基因系TcLr19中获得的特异表达的168 bp cDNA-AFLP片段为靶序列,通过cDNA末端快速扩增(RACE)的方法获得2545 bp的cDNA序列,并在接菌的TcLr19叶片中进行RT-PCR验证,测序结果与RACE结果一致.tBLASTn比对发现该序列与预测的二穗短柄草的Receptor-like protein 2-like (LOC100825532)有67％的一致性(Expect=0.0).该基因包含一个2136 bp的开放阅读框,编码711个氨基酸;SMART分析表明其含有6个LRR结构域,属LRR-TM类型,推测其为假定的富含亮氨酸的类受体蛋白基因,暂命名为TaRLP19,GenBank登录号为(JN872563).半定量RT-PCR分析表明,该基因属组成型特异表达类型.为进一步研究叶锈菌与小麦TcLr19非亲和反应中类受体蛋白TaRLP19的功能及其表达调控机制等奠定基础.     

小麦抗叶锈病基因Lr24的TRAP分析

 【目的】获得与Lr24基因紧密连锁并可能作为探针的TRAP分子标记。【方法】应用TRAP技术,选用90对引物组合对小麦抗叶锈病基因Lr24、感病亲本Thatcher及其F2代抗感各10株组成的抗、感基因池（Br、Bs）的扩增带型差异进行分析,用筛选获得的多态性引物对TcLr24×Thatcher F2群体进一步筛选,进而用获得的特异引物对45个小麦抗叶锈病近等基因系和30个小麦二倍体材料进行分析。【结果】获得10对能够在TcLr24、Br与Thatcher、Bs间产生多态性的引物,多态性引物检出率为11.11%。其中1对在F2抗感群体中有差异且稳定扩增的TRAP引物ARBI1/RGA-2F,其161bp 扩增产物仅在F2抗病单株中出现,感病单株中缺失。用该引物对45个近等基因系和30个二倍体材料检测发现,近等基因系TcLr19、TcLr29、TcLr38、Lr42和TcLr44中有相同大小片段的扩增产物,30个二倍体材料中未出现相应扩增产物。【结论】本研究获得的一个与Lr24紧密连锁的TRAP标记,该标记可筛选含有Lr24基因的育种后代群体,可作为探针用于文库的筛选。     

小麦抗叶锈基因Lr38 差异表达的初步研究

小麦叶锈病是一种世界性发生的小麦病害,利用抗病品种是防治该病害最经济、安全、有效的方法.目前已经正式定名的56个小麦抗叶锈基因中,有许多表现出抗锈性的丧失.来自中间偃麦草的小麦抗叶锈基因Lr38则表现出优良的抗锈性.利用DDRT-PCR技术,分析了小麦抗叶锈近等基因系材料TcLr38与感病对照Thatcher间的表达差异.通过对差异片段的克隆测序,获得一条425 bp的差异表达序列,推测可能为一与抗病相关的基因片段.     

小麦抗叶锈基因Lr38差异表达的初步研究

小麦叶锈病是一种世界性发生的小麦病害,利用抗病品种是防治该病害最经济、安全、有效的方法。目前已经正式定名的56个小麦抗叶锈基因中,有许多表现出抗锈性的丧失。来自中间偃麦草的小麦抗叶锈基因Lr38则表现出优良的抗锈性。利用DDRT-PCR技术,分析了小麦抗叶锈近等基因系材料TcLr38与感病对照Thatcher间的表达差异。通过对差异片段的克隆测序,获得一条425bp的差异表达序列,推测可能为一与抗病相关的基因片段。     

小麦抗叶锈病基因Lr19 的SSR标记

 选取小麦感叶锈病亲本Thatcher、6个以Thatcher为遗传背景的小麦抗叶锈近等基因系及TcLr19与Thatcher杂交F2代为材料，开展了小麦抗叶锈基因Lr19的微卫星分子标记研究；从13对微卫星引物中筛选出了1对在亲本及TcLr19×Thatcher F2抗感群体间揭示多态性的引物Xgwm44，并获得了1个与小麦抗叶锈基因Lr19紧密连锁的SSR标记Xgwm44139bp，此标记位点与Lr19基因之间的遗传距离为0.9cM。该研究可为分子标记辅助育种及构建遗传图谱、物理图谱和基因克隆奠定了基础。     

叶锈菌与‘TcLr19’小麦互作体系中PR1基因的克隆及分析

利用RT-PCR和cDNA末端快速扩增技术(RACE),从被小麦叶锈菌诱导的抗叶锈病近等基因系材料TcLr19中获得1个病程相关蛋白1(Pathogenesis-related proteins 1,PR1)基因,暂命名为TcLr19PR1。该基因长度为810bp,包含495bp ORF区,编码164个氨基酸,基因产物具有植物防御体系中病程相关蛋白SCP保守结构域,与多个植物病程相关蛋白1基因具有较高同源性。利用半定量分析表明,TcLr19PR1基因受叶锈菌诱导后表达量变化明显,非亲和组合表达高于亲和组合。Southern杂交验证说明TcLr19PR1在小麦基因组中为低拷贝。利用‘中国春’缺体-四体系成功将该基因定位在小麦7D染色体上,为进一步明确叶锈菌与‘TcLr19’小麦互作体系中病程相关蛋白1基因的抗叶锈相关性奠定了基础。     

小麦抗叶锈近等基因系TcLr38的cDNA-AFLP分析

 【目的】分析经叶锈菌诱导小麦抗叶锈近等基因系TcLr38的基因表达情况,寻找与抗病基因表达相关的片段。【方法】应用cDNA-AFLP技术从mRNA表达水平研究TcLr38和感病对照Thatcher与小麦叶锈菌05-22-65（THTS）互作时基因表达的差异。【结果】76对引物组合检测到约3 800条条带,平均每一对选择性引物可以获得50条条带,其中28对能够在小麦近等基因系TcLr38和感病对照Thatcher之间扩增出特异性条带。多态性条带划分为8种类型,其中3种类型可能与抗病基因相关。最终得到95条小麦抗叶锈近等基因系TcLr38的特异性表达的转录衍生片段（TDF）,其中19条差异TDFs只在接种叶锈菌的TcLr38中出现,为上调表达,而8条差异TDFs为下调表达。对可能与抗病相关的特异TDFs中的21条片段进行序列测定与分析,经BLASTx比较,17个TDFs所推导的蛋白质序列在数据库中找到其所对应的同源序列,15个TDFs为已知功能的基因。【结论】通过对功能已知的基因分析,推测决定蛋白激酶C、ATP结合蛋白、类受体激酶、信号传导组氨酸激酶（HPK）、肽酶家族M23、Dnak抑制蛋白DksA、甲硫氨酸tRNA合成酶、RanGTP酶激活蛋白1、烯酰辅酶A水合酶的TDFs可能与抗病或防御过程相关。     

TcLr35小麦中抗病相关基因S2A2的抗叶锈性分析

NBS-LRR是已克隆植物抗病基因的高度保守氨基酸区域。前期工作中,笔者成功克隆获得了1个通读的NBS类抗病同源基因S2A2的cDNA序列,该序列含有NB-ARC保守结构域和多个LRR结构域,且在小麦叶片中为低丰度组成型表达。进一步根据S2A2基因在TcLr35与Thatcher中扩增获得的基因序列差异位点设计特异性引物,分别以TcLr35、Thatcher为模板进行扩增,筛选出了具有较高稳定性和可重复性的3对引物。利用3个多态性引物对TcLr35、Thatcher及其F2代群体进行扩增和遗传性分析,并用Mapmanager软件计算分子标记与抗叶锈病基因之间的遗传距离,结果发现这3对引物获得的标记与Lr35基因遗传距离较远。利用这3个多态性引物扩增33个不同小麦抗叶锈病近等基因系材料,并回收测序,结果表明该基因序列在不同近等基因系材料中广泛存在。     

小麦抗叶锈基因Lr45的SCAR标记

 【目的】建立小麦抗叶锈基因Lr45 SCAR（sequenced characterized amplified region序列特征扩增区域）标记。【方法】以小麦抗叶锈病基因材料TcLr45和感病材料Thatcher为亲本,利用黑麦基因组特异的RAPD标记引物OPH20进行PCR扩增,对获得的与预期大小相同的1.5kb的特异片段进行克隆测序,并根据该序列设计一对特异PCR引物LRYR和LRYF,对TcLr45×Thatcher F2代单株构建的分离群体进行扩增,验证该标记与Lr45的连锁关系,Mapmaker 3.0软件绘制遗传连锁图。【结果】该标记在TcLr45中扩增出单一条带,片段大小为1 272 bp（命名为Ypsc20H1272）,而在感病亲本中则无扩增条带。F2代分离群体进行连锁分析,遗传距离为8.2 cM,该标记为与Lr45连锁的SCAR标记。【结论】将Lr45的RAPD标记转化成SCAR标记。     

A SSR Marker for Leaf Rust Resistance Gene Lr19 in Wheat

Microsatellite was carded out in Thatcher, six near-isogenic lines and F2 progeny of TcLr19xThatcher to develop molecular markers for leaf rust resistance gene Lr19. Thirteen primer pairs were screened, of which one primer pair Xgwm44 displayed polymorphsim in the population of TcLr 19, Thatcher, and their F2 generations. One marker closed linked to Lr19 resistance trait was obtained, and was named Xgwm44139bp with the genetic distance 0.9 cM. The research shows that Lr19 has more potential in marker-assisted breeding programs in wheat and provides a step stone for mapping genetic map, physical map and the eventual cloning.     

叶锈菌及信号分子诱导小麦TcLr35中β-1,3-葡聚糖酶基因的表达分析

【目的】β-1, 3-葡聚糖酶是一种病程相关（pathogenesis-related,PR）蛋白,了解小麦TcLr35中β-1, 3-葡聚糖酶基因在叶锈菌（Puccinia triticina）与TcLr35小麦互作体系中的表达模式,明确其与TcLr35小麦抗叶锈病相关性,进而探讨PR蛋白介导的小麦成株抗叶锈病的分子机理。【方法】在前期研究基础上,利用生物信息学方法分析已克隆β-1, 3-葡聚糖酶类病程相关蛋白基因TaLr35PR2结构特征,利用半定量RT-PCR方法结合genetools和SPSS软件检测叶锈菌及信号分子诱导后不同时间点该基因表达量,并明确其在小麦根、茎和叶各生长器官及小麦不同生长时期的基因表达模式。【结果】小麦TaLr35PR2含有信号肽,编码定位于液泡的碱性蛋白,蛋白序列与其他物种PR2类蛋白序列具有较高同源性,与普通小麦病程相关蛋白2亲缘关系最近,与水稻病程相关蛋白亲缘关系最远。小麦成株期接种叶锈菌后不同时间点,TaLr35PR2在亲和反应（Thatcher）中表达量变化不大,趋于平缓;而在非亲和反应（TcLr35）中的表达有显著差异,总体上,该基因在非亲和组合中表达量明显高于亲和组合中表达量。检测TaLr35PR2在成株小麦TcLr35各器官中基因表达,该基因在叶片中表达量随接菌时间点延长明显增加,并在接菌后48 h达到表达高峰;而在根中接菌后各时间点均未检测到基因表达;在茎中接菌后48 h开始有少量表达,但表达量变化不大,趋于平缓,总体表达丰度为叶＞茎＞根。在小麦生长发育的不同时期,除1叶期外,该基因在TcLr35和Thatcher中均有表达,Mock（未接菌处理）反应中,TaLr35PR2在小麦不同生长期的表达呈上升趋势;接种叶锈菌后,TaLr35PR2在亲和反应和非亲和反应小麦各生长时期的表达量均高于Mock反应,且在成株期表达稳定。信号分子水杨酸（salicylic acid,SA）、脱落酸（abscisic acid,ABA）均能诱导该基因的表达,信号分子预处理后接种叶锈菌,基因表达量显著上调。【结论】TaLr35PR2的表达受叶锈菌诱导,TaLr35PR2可能参与SA、ABA介导的信号通路,并参与小麦TcLr35成株抗叶锈病防御反应。     

Identification of <Emphasis Type="Italic">Lr24</Emphasis> with targeted region amplified polymorphism (TRAP) analysis in wheat

This research is aimed at developing TRAP markers, as a probe for library screening, closely linked to or co-segregated with Lr24. Ninety TRAP primer pairs were used to test the resistant and susceptible parents, as well as the resistant bulk and the susceptible bulk in our study. The polymorphic TRAP primers of TcLr24 were employed to genotype the F₂ population from TcLr24×Thatcher subsequently. Ten of 90 TRAP primer pairs displayed polymorphism between TcLr24 and Thatcher, accounting for 11.11%. A further study found that primer ARBI1/RGA-2F generated a 161 bp fragment presented only in the resistance plants of F₂ population. Forty-five other wheat leaf rust resistant NILs and 30 diploid materials of wheat were also tested to detect the specificity of the primer. This specific band was amplified in TcLr19, TcLr29, TcLr38, TcLr42 and TcLr44, but absented in all the 30 diploid materials. It was concluded that this marker ARBI1/RGA-2F was closely linked to Lr24, which could be used to detect Lr24 in the F₂ population of TcLr24×Thatcher, and be further used as a probe for cDNA and BAC library screening of TcLr24.