小麦抗叶锈近等基因系TcLr38的SRAP-SSR(eSSR)分析

小麦抗叶锈基因Lr38在我国高抗叶锈病,直到目前该基因的分子标记开发较少,开发其分子标记对于该基因的研究与利用具有重要意义。利用594对SRAP-SSR(eSSR)引物组合对以Thatcher为背景小麦抗叶锈近等基因系材料TcLr38和Thatcher进行PCR扩增。引物组合ARBI8-Xcwem8R和ARBI2-Xgwm497F在TcLr38中分别扩增出300和400bp多态性条带。利用47个小麦抗叶锈近等基因系进一步检测,引物ARBI8-Xcwem8R仅在TcLr38中扩增出特异条带。经TcLr38×Thatcher F2代分离群体验证,该标记与Lr38遗传距离较远。对该片段克隆测序,片段长度为277bp,BLAST比对与GenBank中所收录序列无相似性,该片段为与Lr38相关的新的序列。     

TcLr24小麦NBS-LRR同源基因的克隆与分析

目前已克隆的小麦抗叶锈病基因多数含有NBS类保守结构域,为克隆高抗叶锈病Lr24基因及其抗病相关基因,根据NBS保守结构域设计引物,对小麦抗叶锈病近等基因系TcLr24cDNA进行扩增,得到534bp的抗病基因同源序列。对该序列进行同源性检索并验证,获得1 408bp的电子延伸序列。以此通过RACE技术分别获取2 797bp和3 466bp的cDNA与gDNA全长产物,其翻译的蛋白质序列含有NBS保守区的P-loop、Kinase 2a、Kinase 3a、HD和LRR保守结构,与大麦等单子叶植物NBS类蛋白序列同源性较高,生物信息学分析表明其为稳定的亲水性蛋白,分子质量104.28ku,理论等电点6.15。半定量RT-PCR表明该片段所在基因序列为组成型表达。     

小麦NBS-LRR类抗病基因同源序列的分离与鉴定

【目的】拟利用同源序列法分离小麦抗病基因同源片段。【方法】根据已克隆植物抗病（R）基因NBS-LRR保守区段设计两对引物，采用RT-PCR方法对小麦抗叶锈病近等基因系材料TcLr35 的RNA进行扩增。【结果】 获得了3个通读的小麦抗病基因NBS-LRR类抗病基因同源片段PS13-1、PS13-2和S2A2，长度分别为239bp、289bp和539bp，编码78、84和177个氨基酸。核苷酸比较分析表明，PS13-1和PS13-2与已克隆小麦抗白粉病基因PM3b同源性为91%；S2A2与大麦一个来源于mRNA的同源片段同源性为91%；经BLASTp比较，3个片段均含有NB-ARC保守结构域，与已知抗病基因I2C-1，L6，RPS2等相应区域相一致，具有抗病基因NBS特征结构域（P环、激酶2a等）。Northern杂交分析表明，3个同源片段在小麦叶片中为低丰度组成型表达。【结论】本研究在TcLr35小麦中成功获得了抗病基因同源序列，为最终克隆小麦抗叶锈病基因奠定了基础。     

小麦抗叶锈病基因Lr24的TRAP分析

 【目的】获得与Lr24基因紧密连锁并可能作为探针的TRAP分子标记。【方法】应用TRAP技术,选用90对引物组合对小麦抗叶锈病基因Lr24、感病亲本Thatcher及其F2代抗感各10株组成的抗、感基因池（Br、Bs）的扩增带型差异进行分析,用筛选获得的多态性引物对TcLr24×Thatcher F2群体进一步筛选,进而用获得的特异引物对45个小麦抗叶锈病近等基因系和30个小麦二倍体材料进行分析。【结果】获得10对能够在TcLr24、Br与Thatcher、Bs间产生多态性的引物,多态性引物检出率为11.11%。其中1对在F2抗感群体中有差异且稳定扩增的TRAP引物ARBI1/RGA-2F,其161bp 扩增产物仅在F2抗病单株中出现,感病单株中缺失。用该引物对45个近等基因系和30个二倍体材料检测发现,近等基因系TcLr19、TcLr29、TcLr38、Lr42和TcLr44中有相同大小片段的扩增产物,30个二倍体材料中未出现相应扩增产物。【结论】本研究获得的一个与Lr24紧密连锁的TRAP标记,该标记可筛选含有Lr24基因的育种后代群体,可作为探针用于文库的筛选。     

小麦抗叶锈病基因Lr19 的SSR标记

 选取小麦感叶锈病亲本Thatcher、6个以Thatcher为遗传背景的小麦抗叶锈近等基因系及TcLr19与Thatcher杂交F2代为材料，开展了小麦抗叶锈基因Lr19的微卫星分子标记研究；从13对微卫星引物中筛选出了1对在亲本及TcLr19×Thatcher F2抗感群体间揭示多态性的引物Xgwm44，并获得了1个与小麦抗叶锈基因Lr19紧密连锁的SSR标记Xgwm44139bp，此标记位点与Lr19基因之间的遗传距离为0.9cM。该研究可为分子标记辅助育种及构建遗传图谱、物理图谱和基因克隆奠定了基础。     

小麦抗叶锈基因Lr45的SCAR标记

 【目的】建立小麦抗叶锈基因Lr45 SCAR（sequenced characterized amplified region序列特征扩增区域）标记。【方法】以小麦抗叶锈病基因材料TcLr45和感病材料Thatcher为亲本,利用黑麦基因组特异的RAPD标记引物OPH20进行PCR扩增,对获得的与预期大小相同的1.5kb的特异片段进行克隆测序,并根据该序列设计一对特异PCR引物LRYR和LRYF,对TcLr45×Thatcher F2代单株构建的分离群体进行扩增,验证该标记与Lr45的连锁关系,Mapmaker 3.0软件绘制遗传连锁图。【结果】该标记在TcLr45中扩增出单一条带,片段大小为1 272 bp（命名为Ypsc20H1272）,而在感病亲本中则无扩增条带。F2代分离群体进行连锁分析,遗传距离为8.2 cM,该标记为与Lr45连锁的SCAR标记。【结论】将Lr45的RAPD标记转化成SCAR标记。     

小麦抗叶锈基因Lr38的一个新标记

【目的】建立小麦抗叶锈近等基因系材料TcLr38特异的PCR标记。【方法】以Thatcher为对照,以TcLr38和TcLr38×Thatcher F2代单株构建的分离群体为材料,利用TcLr38远缘亲本中间偃麦草特异的SCAR标记引物进行PCR扩增获得单一条带,并以50个小麦抗叶锈近等基因系材料对该标记特异性进行检测,Mapmaker 3.0软件计算该标记与Lr38的遗传连锁距离。【结果】中间偃麦草特异的SCAR标记引物在TcLr38中获得单一扩增片段大小为982 bp,50个小麦抗叶锈近等基因系检测表明为TcLr38的特有条带,F2代分离群体验证表明为与Lr38共分离的分子标记,命名为Y38SCAR982。【结论】Y38SCAR982可以作为Lr38的分子标记,并证实该基因由中间偃麦草向普通小麦转移的事实。     

23个小麦抗叶锈病近等基因系SRAP多态性

 【目的】分析以Thatcher为遗传背景的小麦抗叶锈病近等基因系的遗传多样性,探讨SRAP技术在小麦抗叶锈病基因标记及基因克隆研究中应用的可行性。【方法】采用SRAP（sequence-related amplified polymorphism）技术对23个以Thatcher为遗传背景的小麦抗叶锈病近等基因系和感病对照Thatcher进行分析。【结果】从128对引物中筛选得到41对具有多态性引物,每个引物组合产生6～41个多态性条带,共产生537个多态性条带,多态性条带率达49.5%,平均每个引物组合产生13.1个多态性条带;每个引物组合产生1～13个特异性条带,共产生115个特异性条带,特异性条带率为10.6%,平均每个引物组合产生2.8个特异性条带。聚类分析将23个小麦抗叶锈病近等基因系和Thatcher在相似系数0.72处分为A、B两大类,其中96%的个体归入B类。B类又分为Ⅰ、Ⅱ两个亚类,95%的个体聚在第Ⅱ亚类。第Ⅱ亚类在相似系数为0.785附近分为4小类。【结论】23个小麦抗叶锈病近等基因系间存在一定的差异。SRAP技术是一种简单有效的分子标记系统,可在小麦叶锈病抗病基因的研究中应用。     

小麦抗叶锈基因Lr37 ISSR分子标记的初步研究

利用ISSR(内部简单重复序列)技术对感病品种Thatcher及20个以Thatcher为轮回亲本的小麦抗叶锈病近等基因系进行分析,找到1个与Lr37基因连锁的ISSR标记。经过多次重复发现,在一套ISSR引物中,引物UBC812在小麦抗叶锈基因Lr37近等基因系间表现多态性。当用这个引物对已知含Lr37基因的3个抗病材料及其它不含Lr37基因的感病材料进行检测时,多态性标记UBC812-1200可以从3个含Lr37基因的抗病材料中检测到1条1200bp的多态性带,而在其它感病材料中均未出现。     

小麦抗叶锈病基因Lr19的AFLP标记

 以Thatcher和23个以Thatcher为遗传背景的小麦抗叶锈病近等基因系及TcLr19与Thatcher杂交F2代植株为材料，利用AFLP技术开展了小麦抗叶锈病基因Lr19的分子标记研究。共获得7个与小麦抗叶锈病基因连锁的分子标记：P-AGT/M-GAG289bp（3.3cM）、P-ACA/M-GGT102bp（4.1cM）、P-ACA/M-GGT106bp（4.1cM）、P-AAC/M-CAG123bp（4.9cM）、P-AAC/M-GGT203bp（5.0cM）、P-ACA/M-GGT290bp（5.7cM）和P-ATC/M-GAG293bp（9.6cM）。这些特异性片段经回收、克隆、测序得出了特异带的序列。该研究可促进遗传图谱、物理图谱的构建和小麦抗叶锈病基因Lr19的克隆。     

小麦NBS类序列的分离与特征分析

[目的]获得小麦近等基因系TcLr24中NBS类抗病基因同源序列。[方法]利用已克隆植物抗病基因NBS序列中的保守结构＂P-loop＂和＂GLPL＂合成简并引物,以小麦近等基因系TcLr24基因组DNA为模板进行PCR扩增。[结果]得到13条具有连续ORF的抗病基因类似物序列,包括P-loop、Kinase-2、Kinase-3a、GLPL抗病基因所共有的保守结构,相应推测的氨基酸序列间的相似性系数在36.1%～98.3%,同时对分离的RGAs的氨基酸序列和5个已克隆植物NBS的氨基酸序列进行聚类分析表明,与Xa1、RPS2亲缘关系较近,而与Lr21亲缘关系较远。[结论]TcLr24中NBS类RGAs可能会有与Lr21不同机制的抗病功能。     

小麦抗叶锈病基因Lr45的AFLP分子标记

 利用AFLP技术对小麦抗叶锈基因Lr45进行了标记，从60对AFLP引物中筛选出2对在亲本及TcLr45×Thatcher F2抗感群体间揭示多态性的引物P-AGG/M-GAG和P-ACA/M-GGT。其扩增片段为261 bp和105 bp，2个标记与Lr45的遗传距离分别为0.6 cM和1.3 cM。测序比较261 bp片段与大麦属Vulgare HotrI基因部分序列同源性达86%，105 bp片段与一粒小麦磷脂酰丝氨酸脱羧酶基因部分序列同源性高达96%。2个测序片段均包含开放阅读框（ORF）序列。     

6个小麦抗叶锈病近等基因系的cDNA-AFLP差异表达分析

应用cDNA-AFLP技术对小麦抗叶锈病近等基因系TcLr9、TcLr15、TcLr19、TcLr25、TcLr38、TcLr45和感病亲本Thatcher间的表达差异进行分析,共选用226对引物组合对其进行筛选,检测出7 554条条带,平均每对引物可获得33条扩增条带。筛选出68对引物能够在小麦抗叶锈病近等基因系TcLr9、TcLr15、TcLr19、TcLr25、TcLr38、TcLr45和感病亲本Thatcher之间扩增出特异表达条带,特异表达检出率为30.1%。68对引物共扩增出84条特异表达条带,并根据基因表达与否及表达量划分为9种不同的特异表达类型(I~IX)。其中,I、V和VII型特异表达类型为组成型表达,共49条;II、IV、VI和VIII型特异表达类型表达上调,共21条;III和IX型特异表达类型表达下调,共14条。有5种特异表达类型(IV、V、VI、VII、VIII型)可能与小麦的抗病反应相关,并且这5种特异表达类型又分为两类亚型,第一类亚型是小麦抗叶锈病近等基因系与小麦叶锈菌互作时特异表达(I V型)或者表达量明显增加(VI、VIII型),为诱导性特异表达类型;第二类亚型为组成型特异表达类型(V、VII型)。     

小麦抗叶锈近等基因系TcLr38的cDNA-AFLP分析

 【目的】分析经叶锈菌诱导小麦抗叶锈近等基因系TcLr38的基因表达情况,寻找与抗病基因表达相关的片段。【方法】应用cDNA-AFLP技术从mRNA表达水平研究TcLr38和感病对照Thatcher与小麦叶锈菌05-22-65（THTS）互作时基因表达的差异。【结果】76对引物组合检测到约3 800条条带,平均每一对选择性引物可以获得50条条带,其中28对能够在小麦近等基因系TcLr38和感病对照Thatcher之间扩增出特异性条带。多态性条带划分为8种类型,其中3种类型可能与抗病基因相关。最终得到95条小麦抗叶锈近等基因系TcLr38的特异性表达的转录衍生片段（TDF）,其中19条差异TDFs只在接种叶锈菌的TcLr38中出现,为上调表达,而8条差异TDFs为下调表达。对可能与抗病相关的特异TDFs中的21条片段进行序列测定与分析,经BLASTx比较,17个TDFs所推导的蛋白质序列在数据库中找到其所对应的同源序列,15个TDFs为已知功能的基因。【结论】通过对功能已知的基因分析,推测决定蛋白激酶C、ATP结合蛋白、类受体激酶、信号传导组氨酸激酶（HPK）、肽酶家族M23、Dnak抑制蛋白DksA、甲硫氨酸tRNA合成酶、RanGTP酶激活蛋白1、烯酰辅酶A水合酶的TDFs可能与抗病或防御过程相关。     

小麦NBS-LRR类抗病基因同源cDNA序列的克隆与表达分析

为获得小麦抗叶锈病相关基因,以小麦近等基因系TcLr19所构建的非亲和cDNA文库中获得的EST序列(Contig 914)为靶序列,用RT-PCR方法和cDNA末端快速扩增技术,分离克隆到片段为3 042bp的全长cDNA序列。序列分析表明该序列符合典型单子叶植物的CC-NBS-LRR结构模式,命名为TaNLR。该基因包含一个完整的2 739bp的开放阅读框(ORF),具有连续的Poly A尾和典型的加尾信号AATTAA。ProtParam程序预测表明该基因编码912个氨基酸。发育树分析显示该氨基酸序列与大麦的NBS-LRR类抗病基因蛋白同源性最高达89%。荧光定量PCR分析表明,在小麦与叶锈菌互作中,TaNLR基因受叶锈菌诱导下调表达。本研究在TcLr19小麦中成功获得了抗病同源基因,这为明确NBS-LRR在小麦抗叶锈病中的作用奠定了基础。     

小麦抗叶锈近等基因系TcLr38 RGAs分析

为获得Lr38的抗病类似物质,寻找与抗病基因表达相关的目的片段.根据已知植物抗病基因的NBS-LRR(核苷酸结合位点-富含亮氨酸重复)类保守区域设计简并引物,应用RGA技术在小麦的未知基因cDNA中扩增和分离抗病基因同源序列.从小麦抗叶锈近等基因系TcLr38中获得了9个小麦抗病基因同源片段D-8、A-5、B-20、C-6、F-16、A-4、B-9、C-4和D-12.经BLASTp分析,9个片段都含有NB-ARC保守结构域,其中D-8、A-5、B-20、C-6、A-4、B-9、C-4和D-12与已知抗病基因的相应区域相一致,具有抗病基因NBS特征结构域激酶2a(Kinase-2a)、激酶3a(Kinase-3a)和疏水结构域(HD).片段D-8、A-5、B-20、C-6、A-4、B-9、C-4和D-12可能与抗病基因表达相关.     

小麦抗白粉病基因Pm6的RAPD标记和SCAR标记

用 1 8 1条 1 0碱基随机引物扩增感病亲本豫麦 1 3号和含Pm6基因的抗病亲本Tim galen ,有 37条引物在Timgalen中检测到多态性片断 ,经多次重复和F2 验证 ,引物S1 38仍能在Timgalen中扩增出稳定的多态性片断 ,对该多态性片断进行回收、克隆和测序 ,根据其序列合成 1对特异引物 ,成功地将RAPD标记转化成稳定的SCAR标记 ,并用此引物对豫麦 1 3号和Timgalen的杂交F2 单株检测 ,计算出该标记与抗病基因之间的遗传距离为 2 7.1cM。并对含不同抗白粉病基因的载体品种进行了SCAR分析。     

小麦抗白粉病基因Pm4b的RGA分析

为克隆抗性基因和发展Pm4b的特异分子标记奠定基础。利用10对RGA引物,对小麦抗白粉病基因的一些载体品种(系)进行扩增,将引物对R11F/R11R从Pm4b基因的载体品种VPM中扩增出的稳定多态性条带回收、克隆、测序,获得与小麦Pm4b基因的相关抗病基因的同源片段,并对不同的小麦Pm基因载体品系作了检测分析。该稳定多态性条带全长1 321 bp。序列分析表明这个片段属于RGA类序列。用该标记检测小麦不同Pm基因载体品种(系),发现该多态性片段仅出现在Pm4b基因载体品种中。该研究可为分离抗性基因和发展Pm4b的特异分子标记奠定基础。     

小麦抗叶锈基因Lr38 差异表达的初步研究

小麦叶锈病是一种世界性发生的小麦病害,利用抗病品种是防治该病害最经济、安全、有效的方法.目前已经正式定名的56个小麦抗叶锈基因中,有许多表现出抗锈性的丧失.来自中间偃麦草的小麦抗叶锈基因Lr38则表现出优良的抗锈性.利用DDRT-PCR技术,分析了小麦抗叶锈近等基因系材料TcLr38与感病对照Thatcher间的表达差异.通过对差异片段的克隆测序,获得一条425 bp的差异表达序列,推测可能为一与抗病相关的基因片段.     

小麦抗叶锈基因Lr38差异表达的初步研究

小麦叶锈病是一种世界性发生的小麦病害,利用抗病品种是防治该病害最经济、安全、有效的方法。目前已经正式定名的56个小麦抗叶锈基因中,有许多表现出抗锈性的丧失。来自中间偃麦草的小麦抗叶锈基因Lr38则表现出优良的抗锈性。利用DDRT-PCR技术,分析了小麦抗叶锈近等基因系材料TcLr38与感病对照Thatcher间的表达差异。通过对差异片段的克隆测序,获得一条425bp的差异表达序列,推测可能为一与抗病相关的基因片段。