森林草莓FvM4K1基因的克隆及表达分析

【目的】旨在探究促分裂原活化蛋白激酶FvM4K1在森林草莓生长发育中的作用。【方法】从森林草莓(Fragaria vesca)‘Hawaii 4’中克隆FvM4K1基因编码区序列,对其进行生物信息学分析,然后利用荧光定量PCR分析FvM4K1在草莓不同器官中的相对表达量以及在1μmol/L生长素处理下基因相对表达量的变化趋势。【结果】在森林草莓‘Hawaii 4’的cDNA中克隆到FvM4K1基因,全长2 466 bp,共编码821个氨基酸,具有典型的激酶结构域,且其在根、茎、叶片、花朵、果实中皆有表达,尤其是在叶片、花朵和果实中的表达量相对较高。1μmol/L生长素处理使得FvM4K1的表达量呈现先增加后降低至初始水平的趋势。【结论】FvM4K1基因对生长素有响应,进一步推测其可能对草莓的生长发育产生影响。     

草莓果实查尔酮异构酶基因克隆及表达分析

【目的】探明查尔酮异构酶基因对草莓果实着色的影响。【方法】从八倍体草莓(Fragaria×ananassa)转录组数据筛选比对出差异表达基因查尔酮异构酶(chalcone isomerase)基因FaCHI,利用RTPCR技术从‘红颜’草莓克隆出CHI基因,测序得到其编码序列并进行生物信息学分析,实时荧光定量qRTPCR分析在草莓着色过程中该基因的表达水平。【结果】FaCHI基因开放阅读框714bp,编码氨基酸237个。生物信息学分析表明:分子量约为25.4kDa,理论等电点(pI)为5.31,该基因具有一个查尔酮合酶超家族保守序列,进化树分析表明‘红颜’草莓FaCHI与八倍体草莓(登录号:Q4AE12.1)亲缘关系最近。qRT-PCR结果显示:FaCHI基因在草莓果实大绿期(花后14d)到白果期(花后21d)表达量下调,随着果实颜色的加深表达量逐渐升高,全红期(花后28d)表达量最高。【结论】FaCHI基因在草莓果实着色过程中发挥重要作用。     

草莓果实中FaSAMDC基因的克隆、生物信息学及表达分析

【目的】为明确S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶(SAMDC)在非呼吸跃变型草莓果实成熟中的作用。【方法】以‘北农香’草莓果实为试验材料,首先通过RT-PCR克隆FaSAMDC基因,其次通过SqRT-PCR分析发育果实(小绿、大绿、褪绿、白果、片红、全红)中的FaSAMDC基因的表达量。【结果】结果表明,FaSAMDC基因含有1 116bp开放阅读框,编码371个氨基酸,含有典型的脱羧酶保守功能结构域。随着草莓的果实发育,FaSAMDC表达量呈明显下降趋势并且在白果时期达到最低值,此后随着果实着色,表达量迅速上升并且成熟期达到最高。【结论】以上研究结果证实,S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶可能参与草莓果实的成熟调控。     

FaPYL2在草莓果实成熟过程中发挥重要作用

【目的】为了验证脱落酸候选受体FaPYL2在草莓果实成熟过程中的作用。【方法】以八倍体‘蒙特瑞’草莓(Fragaria×ananassa cv.‘Monterey’)果实作为研究对象，利用农杆菌介导法瞬时果实侵染、亚细胞定位及等温滴定量热仪试验对FaPYL2进行功能鉴定。【结果】FaPYL2基因的表达随着草莓果实成熟而增加，并在片红期达到峰值。过表达FaPYL2基因促进果实成熟，增加花色苷和可溶性固形物积累，降低果实硬度，而沉默FaPYL2基因结果相反。另外，定位于细胞质中的FaPYL2直接与脱落酸结合，解离常数为67.56μmol/L,符合受体结合特性。【结论】FaPYL2作为一个潜在的脱落酸受体，正调控草莓果实的成熟。     

‘红颜’草莓体细胞胚发生过程中AP2/EREBP家族转录因子的表达分析及FaEREBP基因的克隆

【目的】筛选并克隆‘红颜’草莓(Fragaria×ananassa Duch.cv.‘Benihopp’)体细胞胚发生过程中AP2/EREBP家族特异性表达的基因,以期为草莓体细胞胚发生的分子调控机理研究提供理论依据。【方法】以‘红颜’草莓非胚性愈伤组织、胚性愈伤组织以及体细胞胚为试验材料,应用RNA-seq测序技术,筛选出差异表达的AP2/EREBP转录因子,并通过qRT-PCR技术,检测上调转录因子在非胚性愈伤组织、胚性愈伤组织、体细胞胚以及幼苗根、茎、叶等组织中的表达量,以同源克隆技术获得特异性表达的转录因子FaEREBP。【结果】FaEREBP编码区核苷酸序列全长822bp,编码273个氨基酸,其表达水平在胚性愈伤组织和体细胞胚中显著高于其他组织。【结论】FaEREBP是‘红颜’草莓体细胞胚发生潜在的重要转录因子。     

‘西伯利亚’百合丙二烯氧化物环化酶基因LsAOC的克隆及其表达分析

【目的】研究茉莉酸(JA)信号途径在花香的形成及释放中的作用。【方法】以‘西伯利亚’百合(Lilium ‘Siberia’)为试验材料,通过RACE技术克隆得到了丙二烯环化酶基因(allene oxide cyclase,AOC),并将其命名为LsAOC。【结果】该基因全长741bp,编码246个氨基酸,与麝香百合和岷江百合的序列极为相似。在不同花期与器官中基因相对表达量存在差异。在花朵不同开放阶段,盛开期表达量最低,在其他3个时期表达量无显著差异。LsAOC在内花被片、叶片、子房和外瓣中的表达水平较高。【结论】AOC基因可能通过JA信号途径在花朵发育中发挥调控作用。     

葡萄VviSEP2基因的克隆及表达分析

【目的】克隆葡萄VviSEP2基因的完整开放阅读框(ORF)序列,明确其与胚珠败育型无核葡萄胚珠败育的关系。【方法】通过RT-PCR技术在‘无核白’葡萄中克隆葡萄VviSEP2基因的完整ORF序列,并对该序列及其编码产物进行生物信息学分析,采用半定量RT-PCR和实时荧光定量PCR技术分析VviSEP2的表达模式。【结果】克隆得到一个无核葡萄胚珠发育相关基因,该基因cDNA序列长度为1 132bp,ORF为741bp,编码246个氨基酸。氨基酸多序列比对和进化树分析确认,该基因是E类MADS-box基因家族成员,命名为VviSEP2。表达分析结果表明,VviSEP2只在花蕾、花和胚珠中有表达,而在根、茎、叶中无表达,并且该基因在有核葡萄‘黑比诺’花与花蕾中的相对表达水平明显高于无核葡萄‘无核白’,同时VviSEP2基因在‘黑比诺’胚珠发育各时期的相对表达水平均高于‘无核白’,为后者的3~5倍。【结论】VviSEP2基因与无核葡萄的胚败育可能存在一定关系。     

核桃内果皮苯丙氨酸解氨酶基因克隆及表达分析

【目的】苯丙氨酸解氨酶(PAL)为木质素单体生物合成途径中的关键酶。采用RT-PCR技术克隆露仁核桃WJ-PAL基因和硬壳完整核桃ZJ-PAL基因,研究PAL基因在硬壳完整和露仁核桃内果皮中发育过程中的表达特性。【方法】以‘温138’核桃为材料,‘纸皮’核桃作为对照,利用反转录PCR(RT-PCR)方法克隆WJ-PAL、ZJ-PAL基因、通过生物信息学方法分析,采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析WJ-PAL、ZJ-PAL在核桃硬核过程8个不同时期的表达特性。【结果】WJ-PAL基因cDNA序列包括600 bp ORF,编码200个氨基酸,分子量21.11 k D,理论等电点8.44; ZJ-PAL基因包含690 bp ORF,编码230个氨基酸,分子量24.10 kD,理论等电点7.44。实时荧光定量PCR分析表明,露仁核桃PAL基因在花后100 d的相对表达量为花后51 d相对表达量的117倍,硬壳完整核桃PAL基因在花后65 d相对表达量为花后72 d相对表达量的5倍,初步证明PAL基因在硬壳完整和露仁核桃的不同发育时期表达量存在明显差异。【结论】结果表明该基因参与核桃内果皮(硬壳)硬化过程,影响内果皮木质素的合成,从而造成核桃内果皮发育不全,出现露仁。     

草莓miR156靶基因SPL9的克隆与表达分析

 【目的】从草莓中克隆SPL(SQUAMOSA promoter binding protein-like)转录因子基因SPL9，并分析其在草莓植株不同生长时期的表达水平及与miR156的表达关系，探讨SPL9在草莓植株生长发育中的作用。【方法】根据苹果SPL基因家族的保守序列设计简并引物，以草莓叶片为试材，利用RT-PCR克隆草莓SPL9基因片段，在此基础上利用RACE方法克隆SPL9的cDNA全长。利用实时定量RT-PCR技术分析草莓叶片中SPL9及miR156的表达水平。【结果】从草莓（Fragaria×ananassa）品种‘全明星’中克隆出SPL9基因的cDNA全长序列，命名为FaSPL9。其CDS长度为1 143 bp，编码381个氨基酸，与拟南芥AtSPL9、葡萄VvSPL9、枳PtSPL9、苹果MdSPL9以及玉米ZmSPL9的氨基酸序列同源性分别为：40.30%、64.57%、56.09%、70.33%，38.35%。FaSPL9有着高度保守的SBP结构域和一个双向核定位信号KRXXXRRRK。FaSPL9基因序列中包含miR156的靶位点，实时定量RT-PCR结果表明，在草莓植株的不同生长时期FaSPL9的表达量不同，且与miR156呈现相反的表达模式。【结论】从草莓中分离出FaSPL9基因，其作为miR156的靶基因，推测FaSPL9对草莓植株的生长发育具有重要的调控作用。     

菊花CmLhcb1基因的克隆及其转基因植株的筛选

【目的】克隆CmLhcb1基因并转到拟南芥中,从而探索此基因的功能。【方法】以菊花品种‘清露’幼苗为试验材料,采用RT-PCR和RACE技术克隆获得其叶绿素a/b结合蛋白基因CmLhcb1,并进一步构建表达载pEarleyGate103-CmLhcb1,经农杆菌介导法,筛选获得3个T3代阳性转基因拟南芥植株。【结果】该基因序列编码的蛋白与其他物种相似度高,主要差异存在于C端前50个氨基酸。基因表达特征分析表明,该基因在15%光照和赤霉素条件下,表达量明显增加(P<0.05),叶片中表达量最大,根中表达量最低,白天的表达量比晚上的高30倍。【结论】菊花CmLhcb1基因受光和赤霉素诱导,有组织表达特异性。     

草莓annfaf基因反义融合表达载体构建及转基因植株的获得

 【目的】建立研究草莓果实膜联蛋白基因annfaf功能体系。【方法】利用反义基因技术将从草莓成熟果实中分离克隆的annfaf基因定向克隆至植物中间表达载体pROKⅡ，构建了annfaf反义融合基因植物表达载体pRRJ4，通过根癌农杆菌EHA105将其导入草莓基因组。对获得的抗性植株进行PCR和Southern检测分析。【结果】表明该反义基因已整合到草莓基因组中。【结论】可进一步筛选annfaf基因表达缺陷型植株，用于探讨annfaf在非跃变型果实草莓成熟中的调控作用，为培育草莓新品种提供中间材料。     

草莓果实酯类合成关键酶基因SAATB2和VAATW2表达特性分析

利用RT-PCR的方法,分别从凤梨草莓栽培品种‘红颜’和森林草莓白果类型的成熟果实中克隆酯类合成关键酶基因SAATB2和VAATW2。利用半定量RT-PCR和酶活性测定分别对SAATB2、VAATW2在不同组织和花后不同发育时间果实中的表达情况进行分析。结果发现,SAATB2主要在果实中表达,而VAATW2则在叶片和果实中都有表达,说明AAT在草莓组织中的表达特性存在种间差异。而SAATB2和VAATW2在果实发育期间具有相同的表达趋势,表达量随果实发育先升高后降低,最大表达量均出现在完全成熟前后,但达到最大值的时间略有不同。‘红颜’和森林草莓的果实挥发性酯类质量分数随果实发育升高,完全成熟时达到最大质量分数,与AAT基因表达量的变化基本一致。     

P-cadherin在‘高山美利奴羊’胚胎皮肤毛囊基板形成过程中的表达规律

【目的】研究P-cadherin在‘高山美利奴羊’皮肤毛囊(hair follicle,HF)基板形成过程中的分布及表达情况,初步探讨P-cadherin是否可以作为‘高山美利奴’羊毛囊基板的标记物.【方法】以90-114d胎龄的‘高山美利奴羊’腹部皮肤作为材料,通过冰冻切片、HE染色、荧光定量PCR、免疫组化技术研究P-cadherin在毛囊基板形成过程中的表达规律.【结果】免疫组化结果显示,P-cadherin在胚胎毛囊形成时期的表皮、表皮基底层、真皮、隆突基底层、基板以及毛芽中都呈现阳性表达.荧光定量结果显示,在胎龄90、96、102、108、114d的相对表达量分别为(0.016 7±0.008 4)(0.113 4±0.052 9)(0.937 8±0.245 3)(0.068 4±0.026 8)(0.062 3±0.045 6).90d与96d相比差异显著(P=0.049 30.05),96d与102d相比差异不显著(P=0.088 90.05),102d与108d相比差异显著(P=0.023 50.05),108d与114d相比差异不显著(P=0.512 40.05).96d以后的相对表达量高于90d的相对表达量.90d到102d相对表达量逐渐升高,102d以后相对表达量逐渐降低,108d以后相对表达量趋于平稳,但是略高于114d的相对表达量,有降低的趋势.【结论】初步可以断定P-cadherin可以作为‘高山美利奴羊’毛囊基板的标记物.     

草莓八氢番茄红素合成酶基因的克隆及其表达特性

 【目的】分离和克隆草莓果实八氢番茄红素合成酶基因psy,分析其序列特征,了解其在不同组织部位的表达情况。【方法】采用RT-PCR和RACE技术从草莓果实中克隆草莓类胡萝卜素合成途径中关键基因psy,用生物信息学方法对获得的cDNA序列及推定氨基酸序列进行分析,并用半定量PCR法研究psy基因在不同组织中的表达。【结果】分离到psy基因,GenBank登录号为FJ784889。该cDNA全长1 458 bp,具有1个1 194 bp的完整开放阅读框(ORF),编码398个氨基酸。序列分析表明,psy编码的氨基酸序列与其它植物的PSY蛋白有很高的相似性。系统进化树分析显示,草莓PSY与胡萝卜和玉米的PSY蛋白亲缘关系比较近。原核表达结果表明psy基因在大肠杆菌中获得高效表达。利用半定量RT-PCR技术进行组织表达模式分析发现,psy基因在草莓的花、叶片和果实中均有表达。表达量为花＞红果＞粉红果＞白果＞青果＞老叶＞新叶。【结论】从草莓中克隆到类胡萝卜素生物合成的关键酶基因psy,该基因可能参与调控类胡萝卜素的合成。     

草鱼BAC文库中TLR3基因的筛选及表达特征的研究

【目的】从草鱼的BAC文库中筛选TLR3基因的阳性克隆,研究该基因在草鱼体内的表达规律,为进一步研究奠定基础。【方法】用同位素P32标记的探针,对53 216个BAC克隆以双份平行形式制备的DNA尼龙膜进行杂交筛选,用半定量方法检测TLR3在草鱼不同组织(鳃、心脏、肠、肝胰脏、肌肉、皮肤、脾脏、头肾和中肾)中的表达模式,用实时荧光定量RT-PCR研究草鱼感染呼肠孤病毒后不同时间TLR3的表达规律。【结果】获得了2个TLR3基因的阳性BAC克隆,该基因在被检测的9个组织中都有表达,其中在脾脏、皮肤中的表达量较高。在感染呼肠孤病毒后24 h,草鱼肝胰脏中TLR3的相对表达量显著升高(P0.05);感染后48 h,其相对表达量恢复到正常水平(P0.05)。【结论】成功筛选到草鱼TLR3的BAC克隆,该基因在草鱼体内不同组织中有广泛表达,并且参与了草鱼抗呼肠孤病毒的过程。     

森林草莓糖基转移酶基因家族生物信息学及其表达分析

【目的】对森林草莓糖基转移酶基因（FvUGT）家族进行生物信息学分析及基因表达分析,为深入研究森林草莓UGT基因功能和探索UGT调控草莓果实发育及花色苷及品质形成提供理论依据。【方法】基于Phytozome数据库鉴定得出138个FvUGT基因家族基因,运用生物信息学方法分析其蛋白理化性质、基因结构、保守结构域和进化关系,并采用实时荧光定量PCR对UFGT候选基因在森林草莓（红果和白果2个类型）各组织（根、叶柄、叶和果实）中的表达量进行分析。【结果】FvUGT基因家族可分为12个类群（A、C、D、E、F、G、H、I、J、K、L和N）,每个类群分别包含16、2、23、32、8、1、5、5、7、3、21和4个成员;染色体定位发现FvUGT基因家族成员在除2号染色体之外的其他染色体上均有分布,且分布不均;FvUGT基因内含子长度、外显子位置和数目在不同成员间均存在差异,FvUGT基因家族在进化过程中产生较强的分化。实时荧光定量PCR检测结果表明,FvUFGT70基因在森林草莓白果和红果的叶和叶柄中有较高表达;FvUFGT94基因在各组织中均有表达;FvUFGT67和FvUFGT68基因在根中有较高表达;而FvUFGT95和FvUFGT96基因在果实中有表达,且显著高于其他组织（P<0.05,下同）。同时,在果实的小绿期、转色期和成熟期的表达表现为,成熟期FvUFGT33和FvUFGT95这2个基因在森林草莓红果类型的表达量显著高于白果类型。【结论】7个FvUFGT基因表现出明显的组织差异性,其中FvUFGT33和FvUFGT95基因在果实中有较高表达量,且在森林草莓红果类型表达量显著高于白果类型,故推测其在花色苷合成中发挥作用。     

观赏海棠中McmiR160a的克隆及调控红叶着色的功能分析

【目的】为了验证观赏海棠叶片McmiR160a对花色素苷代谢的调控作用。【方法】以观赏海棠常色红叶品种‘王族’为试验材料,确定miR160a的前体基因序列并对其靶基因进行预测,克隆McmiR160a前体序列并构建过表达载体并瞬时转入‘王族’组培苗。通过高效液相色谱和qRT-PCR分析瞬时侵染植株中花色素苷的含量及其合成途径中结构基因的表达量。【结果】结果表明,在观赏海棠中过表达McmiR160a可以降低花色素苷的含量,同时降低其靶基因和花色素苷代谢途径关键基因表达水平。【结论】研究结果表明,观赏海棠中McmiR160a对花色素苷的合成具有负调控作用。     

观赏海棠中McmiR160a的克隆及调控红叶着色的功能分析

【目的】为了验证观赏海棠叶片McmiR160a对花色素苷代谢的调控作用。【方法】以观赏海棠常色红叶品种‘王族’为试验材料,确定miR160a的前体基因序列并对其靶基因进行预测,克隆McmiR160a前体序列并构建过表达载体并瞬时转入‘王族’组培苗。通过高效液相色谱和qRT-PCR分析瞬时侵染植株中花色素苷的含量及其合成途径中结构基因的表达量。【结果】结果表明,在观赏海棠中过表达McmiR160a可以降低花色素苷的含量,同时降低其靶基因和花色素苷代谢途径关键基因表达水平。【结论】研究结果表明,观赏海棠中McmiR160a对花色素苷的合成具有负调控作用。     

观赏海棠中McmiR160a的克隆及调控红叶着色的功能分析

【目的】为了验证观赏海棠叶片McmiR160a对花色素苷代谢的调控作用。【方法】以观赏海棠常色红叶品种‘王族’为试验材料，确定miR160a的前体基因序列并对其靶基因进行预测，克隆McmiR160a前体序列并构建过表达载体并瞬时转入‘王族’组培苗。通过高效液相色谱和qRT-PCR分析瞬时侵染植株中花色素苷的含量及其合成途径中结构基因的表达量。【结果】结果表明，在观赏海棠中过表达McmiR160a可以降低花色素苷的含量，同时降低其靶基因和花色素苷代谢途径关键基因表达水平。【结论】研究结果表明,观赏海棠中McmiR160a对花色素苷的合成具有负调控作用。     

草莓果实基因表达与花色苷代谢的关系

为进一步探究草莓果实花色苷合成过程中各个酶的作用,明确草莓果实花色苷的代谢机制,以‘阿尔比’草莓(Fragaria×ananassa‘Albion’)为试材,利用RT-PCR从草莓果实中克隆到DFR、ANS和LAR基因的编码序列,对预测的氨基酸序列进行分析,结果表明:各基因与NCBI(美国国立生物技术信息中心)上已有的草莓品种‘Queen Elisa’及‘Korona’(Fragaria×ananassa)所对应基因的同源性高达99％～100％.半定量RT-PCR分析表明,DFR基因依次在幼果期、白熟期和红熟期出现了3个表达峰值,其中红熟期最大;ANS基因的表达量在白熟期后迅速增加,红熟期达最大值;LAR基因的最大表达量出现在幼果期,后呈降低趋势.草莓果实发育过程中,DFR基因在幼果期和红熟期的表达峰值分别与黄烷-3-醇类和花色苷的合成峰值相一致,ANS及LAR分别与花色苷和黄烷-3-醇类的合成密切相关.