盐胁迫下水稻体内miRNA表达谱分析

miRNA是生物体内起重要调控作用的一类非编码小RNA分子,在转录后水平调控基因表达,参与生长发育、抗逆等生物学过程。高通量测序法是鉴定植物中miRNA最有效的方法之一。提取盐胁迫处理不同时间的水稻根、茎和叶部的总RNA,从中分离18~30 nt小分子RNA构建文库,进行高通量测序,对miRNA表达谱特性进行了分析。结果表明,所有样品共检测到248个已知的miRNA,来源于132个不同的家族,根、茎、叶中分别有31、11、9个差异表达miRNA,分属于29个家族,靶向592个功能基因,并对其中5个差异显著且与非生物胁迫相关的重要miRNA进行了qPCR分析检测,结果显示Osa-miR166h、Osa-miR166k上调表达,Osa-miR169h、Osa-miR530下调表达,针对Osa-miR169h的4个靶基因进一步定量检测,其中的3个靶基因上调表达,这与Osa-miR169h的下调表达结果相一致,以上结果说明miRNA在植物抵御非生物逆境胁迫的过程中扮演重要角色。     

2020-06ml 目录

目的异形叶性是植物为适应环境在同一植株上产生多种形态成熟叶片的现象。胡杨是典型的木本异形叶植物，前人研究发现，胡杨异形叶片间展现出不同的生理特性及环境适应性。本研究拟通过对胡杨异形叶差异表达miRNA及其靶基因功能的分析，揭示胡杨叶片形态及其生理变化的分子调控机制。方法以成年胡杨披针形叶和锯齿卵圆形叶为实验材料，通过高通量测序对其miRNA的表达模式及差异表达miRNA的靶基因功能进行比较研究。结果共获得6个高质量的sRNA文库，各文库有效序列占原始序列的56% ~ 81%。通过比对，共鉴定517个已知miRNA和127个新预测miRNA，主要长度分布区间为20 ~ 22 nt，其中的389个miRNA匹配至54个已知的miRNA家族。两种形态叶片共同检出的miRNA有369个，与披针形叶片相比，锯齿卵圆形叶中7个miRNA上调表达，15个下调表达。通过靶基因预测及功能分析，发现差异表达miRNA参与调控胡杨异形叶的抗逆相关途径，如对盐胁迫的响应，磷酸肌醇代谢，角质、软木脂和蜡的生物合成，碱基切除修复和RNA降解等代谢途径。利用实时荧光定量PCR验证了5个差异表达miRNA的表达趋势与高通量测序结果一致，通过PCR检测发现差异表达miRNA与其靶基因存在一定的负调控关系。结论胡杨异形叶中miRNA表达模式存在差异。其中，调控植物生长发育的保守的miR167、miR166及调控植物抗逆性的miR172在锯齿卵圆形叶中表达量上调，参与植物逆境响应的保守的miR169、miR396在锯齿卵圆形叶中下调表达，推测差异表达miRNA引起了异形叶间形态的差异，同时使锯齿卵圆形叶对不利环境具有较强的耐受性。这与我们前期有关胡杨异形叶形态与生理特性的研究结果相一致。      

盐胁迫下水稻体内miRNA表达谱分析

miRNA是生物体内起重要调控作用的一类非编码小RNA分子，在转录后水平调控基因表达，参与生长发育、抗逆等生物学过程。高通量测序法是鉴定植物中miRNA最有效的方法之一。提取盐胁迫处理不同时间的水稻根、茎和叶部的总RNA，从中分离18~30 nt小分子RNA构建文库，进行高通量测序，对miRNA表达谱特性进行了分析。结果表明，所有样品共检测到248个已知的miRNA，来源于132个不同的家族，根、茎、叶中分别有31、11、9个差异表达miRNA，分属于29个家族，靶向592个功能基因，并对其中5个差异显著且与非生物胁迫相关的重要miRNA进行了qPCR分析检测，结果显示Osa-miR166h、Osa-miR166k上调表达，Osa-miR169h、Osa-miR530下调表达，针对Osa-miR169h的4个靶基因进一步定量检测，其中的3个靶基因上调表达，这与Osa-miR169h的下调表达结果相一致，以上结果说明miRNA在植物抵御非生物逆境胁迫的过程中扮演重要角色。     

陆地棉胚珠及纤维发育过程中miRNA分离与鉴定

microRNA(miRNA)是生物中一类起负调控作用的非编码的小分子RNA,主要在转录后水平上调节生物体的生长与发育。直接克隆法是鉴定植物中miRNA最常用也是最有效的方法之一。利用直接克隆法分离了陆地棉开花后0~10 d(days post anthesis, DPA)胚珠中总RNA,从中筛选17~24 nt小分子RNA构建cDNA文库,对初筛得到的阳性克隆进行测序。通过与miRNA数据库比对,最终获得4个保守的miRNA。进一步对他们的转录表达进行分析,发现所有miRNA在棉花胚珠纤维不同发育时期均能表达。其中miR167a、miR172c和miR394b在棉花幼苗的根茎叶中有不同程度的表达。预测得到55个miRNA的靶基因,多数靶基因编码转录因子、代谢酶类以及发育相关蛋白,进一步证明miRNA参与调控棉花纤维的形态建成、发育等各项生理活动。     

红花miR397a基因表达及对靶基因LAC2的调控作用

【目的】研究红花miR397a前体基因及成熟基因在红花不同组织中的表达水平,并对miR397a基因序列、靶基因及基因功能进行分析,为深入研究红花抗逆机制提供参考。【方法】提取红花籽粒、花瓣、茎、根、叶片等5个组织材料的总RNA,使用荧光定量PCR鉴定miR397a在不同组织中的表达水平;利用生物信息学方法分析红花miR397a基因序列,用原生质体转化方法验证红花miR397a调控的靶基因LAC2,并利用转基因拟南芥表型研究miR397a基因的功能。【结果】miR397a前体基因和成熟基因均能在红花不同组织中表达,且均以叶片组织中的表达量最高,分别是籽粒组织的2.5与1.9倍,差异达极显著水平;miR397a序列在不同物种间高度保守,序列中仅存在1~2个碱基的错配或缺失;miR397a对LAC2基因有调控作用,miR397a的过表达可引起LAC2表达水平降低,红花miR397a表达引起植物对NaCl的敏感性增加。【结论】红花miR397a在叶片组织中的表达量最高,基因序列保守,且红花miR397a表达可增强植物对NaCl的敏感性。     

植物低温胁迫响应miRNAs在植物抗寒研究中的应用前景

对植物低温胁迫调控机制、miRNAs的生物合成及作用方式,及其在低温调控网络中的相关作用进行了综述,并运用生物信息学对植物miRNAs在低温胁迫下参与的调控以及3类低温胁迫相应miRNAs进行了分析。结果表明:第一类miRNAs中,miR156家族、miR169家族、miR172家族和miR396家族成熟序列碱基保守性相对较高;第二类miRNAs中,整体miRNAs家族碱基保守性都较高;第三类miRNAs中,miR397家族和miR408家族成熟序列碱基保守性相对较低。以期利用miRNAs成熟序列保守性特征,从miRNA角度分析植物的耐寒机制,为进一步开展植物抗寒机理研究提供新思路。     

拟南芥miR395d基因的克隆和过表达载体构建及其在油菜中的转化

MicroRNAs(miRNAs)是一类内源性长度约为21～24个核苷酸,在基因表达、生长发育、细胞周期及环境胁迫等方面起着重要作用的单链非编码小分子RNA。研究表明:植物miRNAs通过转录后以切割的方式对其靶基因的表达起着负调控作用。miR395的靶基因分别为ATP硫酸化酶和硫转运体SULTR2;1,两者在硫同化及转运中起着重要的作用。为了进一步探究miR395的功能,本研究利用PCR法从拟南芥中克隆了miR395d前体基因,并与pCAMBIA1304载体连接,构建了miR395d前体基因的过量表达载体,通过根癌农杆菌介导法将其转化到甘蓝型油菜特选4号中,目前已获得了转基因植株。     

miRNA调控植物抗逆机制的研究现状

逆境胁迫会对植物的生长发育产生负面影响,在漫长的进化中,植物拥有了一套复杂的调控网络以应对不良环境,在这一套调控网络中miRNA起到了重要作用。本文对近几年关于miRNA及其靶基因调控作用的研究进行了总结,并对miRNA的形成过程和作用机制进行了概括,介绍了与抗逆相关的miRNA及其靶基因,包括以靶基因为抗逆相关转录因子的miRNA(miR160/miR167、miR159、miR156和miR164)以及以靶基因为抗逆相关结构基因的miRNA(miR398和miR395),可为利用基因工程手段增强植物的抗逆性提供更有效的改良途径。     

小麦TaCYP78A5基因的克隆及生物信息学分析

细胞色素P450(Cytochromes P450)蛋白家族含有硫羟基和血红素结构域,参与多种生物合成,CYP78A家族成员对籽粒大小形成有重要的功能。利用同源克隆的方法,分别从小麦大粒品系‘P271’和小粒材料‘中国春’中扩增到位于2AS、2BS、2DS上的TaCYP78A5-2A、TaCYP78A5-2B和TaCYP78A5-2D基因,编码534、544、549个氨基酸。通过分析发现在‘P271’和‘中国春’克隆到的TaCYP78A5序列一致,说明TaCYP78A5基因在这2个粒型的小麦中是保守的。CYP78A家族在水稻和拟南芥中具有非自主性细胞表达模式,结合对CYP78A家族的生物进化关系研究发现,CYP78A家族的各个基因在单子叶植物中是保守的。‘P271’和‘中国春’籽粒大小的差异,可能是TaCYP78A5基因在‘P271’中的基因表达量高于‘中国春’,引起种子发育过程中内表皮细胞的增殖,从而促进种子表皮增大,使得‘P271’种子大小和质量增加。     

椰子保守microRNA 预测和特征分析

根据释放的椰子转录组序列和miRBase数据库中的microRNA（miRNA）序列信息,分析椰子中保守miRNA 及其相应靶基因的特征遥。根据miRBase数据库中植物miRNA序列,共预测了41个miRNA,分别属于22个miRNA家族。这些miRNA家族中13个家族在植物中非常保守,miRBase至少在19个物种中检测到,而miR902、miR2673和miR414这3个家族不保守,仅在1~2个物种中检测到。这些预测的miRNA的成熟序列长度大多为21个碱基（59.5%）,而前体序列的长度大多为50~100个碱基（61.9%）。分析miR396家族前体序列时发现,成熟miRNA和成熟miRNA*（成熟miRNA形成发卡结构互补的序列）序列很保守,但是中间的序列变异很大。此外,预测miRNA的靶基因发现保守的miRNA家族的靶基因为一些重要的转录因子家族,与植物的生长发育相关,而不太保守的miRNA家族的靶基因编码与表型控制相关的蛋白。