山东省植物上冰核活性细菌种类与分布研究

从山东省25种植物上分离到60株冰核活性细菌，鉴定结果为：假单胞菌属有37株，其中非荧光假单胞菌10株，占16.7%；丁香假单胞菌11株，占18.3%；荧光假单胞菌2株，占3.3%；菜豆荚斑假单胞菌14株，占23.3%。欧文氏菌属有23株，其中菠萝欧文氏菌21株，占355；草生欧文氏菌2株，占3.3%。INA细菌的种类和分布受季节、环境、地域和植物种类等多种因素的影响，这是山东省关于冰核细菌研究的首次报道。     

我国冰核活性细菌种类及其分布的初步研究

70年代以来,国外研究证明,在植物体上广泛存在的一些细菌种类如丁香假单胞菌(P·S)、草生欧文氏菌(E·h)和荧光假单胞菌(P·f)等,均具有诱发植物细胞水结冰的作用,这类细菌被称为冰核活性细菌(简称INA)。它们可以诱发许多植物在-2-- 5℃条件下发生霜冻害。我们的研究也证明,玉米和大豆幼苗接种INA的     

利用转座子Tn5诱变冰核细菌获得无冰核活性菌株

 以云南省冰核细菌的优势种类丁香假单胞菌Pseudomonas syringae和菠萝泛菌Pantoea ananas为重组基因工程菌的受体菌,采用Tn5转座子诱变技术,以大肠杆菌Escherichia coli S17／pZJ25∶∶Tn5作为转座子诱变的供体菌,使Tn5插入并整合到冰核细菌基因组中,使冰核基因的线性连续性被破坏,失去冰核活性。大量筛选接合子,获得157株丧失冰核活性的菌株。     

利用悬液沉降率区分黄单胞菌与其它细菌

黄单胞菌的悬液通过血球沉降管（２０ｃｍ）的沉降率为１０￣２５ｓ，而欧文氏菌和假单胞菌分别为６￣１０ｓ和８￣１２ｓ。据此可将黄单胞菌与其它细菌加以鉴别。     

杨树冰核细菌溃疡病发病的主导因素

在我国东北地区、杨树上普遍存在的冰核活性（INA）细菌，能在温度-4℃以下产生冰核活性，主要种类为：成团泛氏菌[Pantoea agglomeransGavinietal=Erwinia herbicola]、菠萝泛氏菌[Pantoea ananas(Serrano)Mergaert et al=E.ananas]、大黄欧文氏菌[Erwinia rhapontici(Millard)Burkholder]、噬夏孢欧文氏菌[Erwinia uredovara(Pon.et al)Dye]和丁香假单胞菌[Pseudomonas syringae pv.syringue Van Hall]。它们主要分布于感病寄主的冻枝、冻死芽、枝干肿包、溃疡瘤、病枝、真菌溃疡病斑等部位，春秋两季为活动期和侵染期，出现频率最高，占细菌分离数的50%以上，泛氏菌占优势，在病部内外均有分布，内部较多，杨树冰核活性细菌在春秋季节霜冻条件下能造成杨树冻达，并引起肿茎型细菌溃疡病，是病害发生的主导因素，研究还证明，杨树冰核活性细菌能增强真菌溃疡病菌的侵染，促进真菌溃疡病的发生。     

遵义市冰核细菌分离鉴定及拮抗细菌筛选

为了解遵义市霜冻植物上冰核细菌的种类以及筛选对冰核细菌有拮抗作用的细菌,采用小液滴冻结法鉴定冰核细菌的冰核活性,并用双层平板法筛选冰核细菌的拮抗细菌;采用形态学特征、生理生化鉴定以及16S rDNA序列对比分析等方法确定冰核细菌和拮抗细菌种类。结果显示,从遵义市采集到35种植物冻害标本,共分离到4株冰核细菌Z-A、Z-B、Z-C、Z-QCH;从遵义市采集到23种土样,共分离出3株拮抗细菌XH、XM、XL。经鉴定,Z-A、Z-B是菠萝泛菌(Pantoea ananatis),Z-C是成团泛菌(Pantoea agglomerans),Z-QCH是绿黄假单胞(Pseudomonas viridiflava)。拮抗细菌XH、XM是解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens),XL是甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)。初步了解了遵义市冰核细菌的种类,为遵义市霜冻植物生物防治奠定了一定基础。     

冰核活性细菌的冰核基因克隆及其在大肠杆菌中的表达

广泛存在于自然界的冰核活性细菌,是诱发和加重植物霜冻的重要因素。在已查明我国冰核细菌种类、分布、成冰活性、影响成冰活性因素及其诱发植物霜冻机理等研究基础上,又采用分子生物学技术对冰核细菌进行不研究。我们克隆了冰核基因,并使其在大肠杆菌中进行表达。 我们选用丁香假单胞菌强冰核活性菌株IS-24(P.syringae)和黄单胞菌中等活性菌株Xt-4(X.campestrts pv.hordel),株的基因文库,经Sau3A部分消解DNA,回收一定长度范围的片断,插入到BamHI位点,转化大肠杆菌,(转化率为1.8×10~4)。大量筛选阳性克隆,再转板培养以充分表     

1株高冰核活性细菌的分离与鉴定

从发生冻害的植物组织中分离到1株冰核细菌MB03,该菌株在-3℃时在2 min内的冻结率达到96.5%,而产生1个冰核所需要的细胞数约为2.9×103个,其冰核活性明显高于冰核细菌标准菌株和其它分离菌株.进一步对MB03进行了鉴定,经个体形态与培养特征观测、部分生理生化反应、G C摩尔分数测定、16SrDNA序列对比分析、菌落原位杂交探测特异性基因和PCR扩增冰核基因等鉴定,确定该菌为丁香假单胞菌(P5eudomonas syringae).     

杨树冰核活性细菌溃疡病血清学的检测技术

用从感病杨树上分离纯化得到的4种冰核活性细菌；成团泛氏菌[Pamfoea agglomerans(E.herbicola)]，菠萝泛氏菌[P.tnanas(E.ananas)]，大黄欧文氏菌[Erwinia rhapontici]和丁香假单胞菌致病变种[Pseudomonas syringae pv.syringae]作为抗原，分别免疫家兔，获得较高滴度的专化抗血清，经试管沉淀试验测得滴度分别为：1/1024、1/2048、1/1024、1/1024；专化性反应率为95.8%，在检测技术研究中，进行了试管沉淀法、玻片凝集法、环状办面凝集法和对流免疫电泳4种试验，通过比较证明，环状界面凝集法用于检测带菌苗木最为6方便和可靠，对已知病原菌的检出率达98%以上。     

番茄根内生细菌的促生及其优势种群的筛选和分析

以从番茄植株分离出的46株内生细菌为研究对象,采用番茄根内生细菌单独侵染番茄种子,并研究其对番茄植株生长的影响,进一步利用测试内生细菌的16S r DNA序列结合之前公开番茄根内核心OTU (Operational Taxonomic Unit)序列构建系统发育树,分析主要促生长内生细菌的种类与丰度。促生试验表明,测试内生细菌均对番茄植株鲜重均有促进作用,其中芽孢杆菌(3株)、假单胞菌(2株)、黄单胞菌(1株)以及根瘤菌(2株)对番茄植株的鲜重具有显著性促进(P 0. 05),而GF12与对照相比对鲜重的促进最为显著(P 0. 01),GF12内生细菌对番茄植株鲜重的增加为对照的1. 69倍;对株高具有显著性促进的内生菌株共有9株,分属芽孢杆菌(5株)、假单胞菌(2株)、黄单胞菌(1株)以及根瘤菌(1株),与对照相比CZ29在促进株高伸长极显著(P 0. 01),CZ29侵染后番茄株高为对照组的1. 46倍;此外,测试内生细菌中8株促进番茄根的伸长,其中MR56、GF12和CZ29侵染后的番茄根长比对照组根长超出15%以上。对46株内生细菌16S r DNA序列与番茄根内生细菌前100核心OTU序列进行系统发育分析结果表明,测试内生细菌聚类到假单胞菌目、肠杆菌目、根瘤菌目、伯克氏菌目、芽孢杆菌目、黄单胞菌目以及黄杆菌目。此外聚类到假单胞菌目和根瘤菌目的内生细菌分别与番茄根内高丰度的OTU_3 (Pseudomonas)和OTU_23 (Rhizobium)聚在一起,表明测试假单胞菌以及根瘤菌是番茄根内主要促生效果的核心类微生物。分离到的具有促生的芽孢杆菌种类最多,但假单胞菌和根瘤菌在根内丰度较高,作为健康番茄根内生微生物组中最主要的群体,因此芽孢杆菌、假单胞菌以及根瘤菌具有巨大促生潜力,可以作为生物菌肥探索为宿主提供营养,并合理开发利用微生物资源以更好发展农业。     

冰核细菌的定量分离研究

 冰核细菌可能是自然界中诱发和加重霜冻敏感植物发生霜冻害的重要原因之一。由于单个的冰核细菌细胞并不具有冰核活性,因此,研究植物上冰核细菌的种群数量或密度是研究冰核细菌与植物霜冻害关系的关键。从云南省的元江、寻甸、河口、呈贡、临沧、陆良、宣威、曲靖、富民、昆明市官渡区及越南老街等地采集到108种植物共166个标样中,有45个标样分离共到71株冰核细菌,标样中冰核细菌的检出率为27.1％,最低密度为6.0×10⁴ CFU/g,最高密度为5.12×10⁹ CFU/g。其余121个标样经再次分离未检测冰核细菌,占总标样数的72.9％。在云南植物上,用稀释平板法可检测冰核细菌的最低密度为2.0×10⁴ CFU／g.     

北京地区杏树冰核活性细菌种类及其消长动态规律的研究

 【目的】弄清冰核活性细菌（INA细菌）在杏树上分布种类及分布与年消长动态规律，对于通过防治INA细菌防御杏树晚霜冻害具有重要的意义。【方法】对北京杏主产区27个杏栽培品种及山杏进行调查，采用形态及生理生化方法进行种类鉴定，采用小液滴冻结法测定冰核活性。【结果】共分离到22株-5℃有活性INA细菌菌株，被确定为2个属中的3个种： 假单胞菌丁香致病变种（Pseudomonas syringae pv.syringae）10株，占45.5%；成团泛生菌（Pantoea agglomerans）9株，占40.9%；凤梨泛生菌噬夏孢子致病变种（Pantoea ananas pv.uredovora）3株，占13.6%。成团泛生菌为杏树上首次发现的INA细菌，‘玉巴达’杏树上的INA细菌（P. agglomerans）数量分布存在3个高峰期：花期（3月末至4月初）、果实发育期（5至6月初）、越冬初期（12月），夏秋季及寒冬难以分离到INA细菌。【结论】INA细菌分布数量与杏树所处地理位置及生态条件有关，杏不同器官上分离到的INA细菌的频率也存在差异。     

INA细菌种类及其冰核活性与“不知火”果实霜冻关系的研究

根据四川省杂柑上采集受冻标本20份,分离到16株冰核细菌菌株,经细菌学鉴定确认属于2个属3个种:E.ananas Serrano1928,6株,占37.5%;P.syringaevan Hall1902,6株,占37.5%;P.viridiflava(Burkholder1930)Dowson1939,4株,占25%。且E.ananas的冰核活性小于P.syringae和P.viridiflava。这是杂柑上关于INA细菌的首次报道。并且通过研究INA细菌与"不知火"果实霜冻关系结果表明,在低温胁迫下,INA细菌能较大幅度提高果皮相对电导率,增大细胞原生质膜渗透性,是诱发和加重"不知火"果实霜冻的重要因素。     

小春作物上冰核细菌种群动态研究

 采用平板稀释分离计数法,在小春作物蚕豆、小麦和油菜生长期间,连续两年定点定期对冰核细菌种群数量动态变化进行检测。结果表明,在云南省昆明地区自然条件下,冰核细菌的数量最大密度出现在2月中旬至3月中旬,可达9.2×10⁹ CFU／g。     

冰核活性真菌的分离与鉴定

 1997～1998年,从蚕豆等植物霜冻害标本中分离到了12株具有冰核活性的真菌,在-5.5℃下具有较强的冰核活性.室温下保存1年转入冰箱中保存半年的菌丝体培养液仍保持原有的强烈成冰核活性,表明其成冰核活性物质与冰核活性细菌有所不同.经鉴定,这12株冰核活性真菌均为燕麦镰刀菌(Fusarium avenaceum Sac.),这是国内有关冰核活性真菌研究的首次报道.     

Phosphatidylinositol as a Component of the Ice Nucleating Site of Pseudomonas syringae and Erwinia herbiola

Phosphatidylinositol has been identified as a major component of the ice nucleating site on the outer surface of two bacteria, Pseudomonas syringae and Erwinia herbicola. Plant lectins binding to inositol and a highly purified phosphatidylinositol-specific hydrolase (a C(II) lipase) inhibited or decreased the efficiency of the ice nucleating activity (INA) of both bacteria. Extracts of these two INA(+) bacteria had phosphatidylinositol synthase activity while extracts from related INA(-) Pseudomonas or Erwinia strains had no detectable synthase activity. An Escherichia coli strain acquired phosphatidylinositol synthase activity when transformed to the INA(+) phenotype with recombinant plasmids containing fragments of P. syringae DNA.     

我国生物冰核研究进展

我国从1986年起开展了冰核活性细菌的研究,已取得一定的进展。查明了我国冰核细菌种类、分布规律、冰核活性强弱程度,明确了影响冰核细菌冰核活性的某些因素和提出了菌种保存方法;验证了冰核细菌是诱发和加重植物霜冻的重要因素,研究揭示冰核细菌、低温强度和植物霜冻害三者的关系,并进行了药剂和生物防霜新技术研究;利用冰核细菌研制成功了冰蛋白降水催化剂,开展了促冻杀虫、克隆了编码冰蛋白的冰核活性基因及有关冰核细菌分子生物学应用技术研究;首次报道了大麦黄矮病毒冰核活性,对揭示未知生物冰核种类有一定意义。     

Species of Ice Nucleation Active Bacteria on the Apricot and the Relationship Between Their Activity and Flower Frost

During 1996- 1997, sixty samples were collected from apricot in Hebei Province, from which nineteen ice nucleation active bacterial strains were isolated. Nine stains were identified as Pseudomonas syringae pv. syringae by bacteriological determination, while the others were Erwinia uredovora. Assay of ice nucleation activity (INA) showed the activity of the Pseudomonas strains was higher than that of the Erwinia.According to the number of bacterial cells required to produce one ice nucleus active at - 3℃, four stains was classified as strong ones, three as medium-strong, the remainder as weak. In general, the INA of these strains were regarded as medium-strong. Under stress of Iow temperatures, treatment of INA bacteria can greatly raised relative electric conductivity of petals and permeability of cell membrane. The treated petals showed symptoms of serious frost at - 3 - - 4℃ and had supercooling points of 2 - 3℃ higher than controls. Our results demon strated that INA bacteria are one major factor to incite frost damage to apricot flowers. We may reduce frost injury to apricot during flowering phage through control of INA bacteria.