人工雌核发育红草金鱼体色的定向发育研究

[目的]探讨人工雌核发育红草金鱼F1代的体色发育方向及其与母本的差异性,为观赏鱼类优质体色的定向培育奠定基础.[方法]采集兴国红鲤和黄锦鲤的精子,经紫外光照射失活后,分别刺激红草金鱼成熟卵细胞,受精卵经冷冻休克、染色体加倍处理后进行人工孵化,即获得雌核发育的二倍体,并以兴国红鲤(♂)、黄锦鲤(♂)与红草金鱼(♀)杂交的二倍体为对照,分别计算其孵化时长和孵化率,统计F1代体色和体形的表型及比例.[结果]以兴国红鲤和黄锦鲤的失活精子诱导红草金鱼雌核发育产生F1代个体,其孵化率分别为8.1％和1.7％,孵化时长分别为92和97 h;且均以红色个体(含桔红色和淡红色)为主,分别占98.6％和99.3％,夹杂有少量青灰色和黄灰色个体.雌核发育F1代红色个体均显母本形态,呈鲫鱼型;青灰色和黄灰色个体则略带父本形态,形体介于鲫鲤之间.根据生长发育过程中鱼体体色发生生理的转变进程,可将红草金鱼雌核发育F1代鱼苗的体色转变进程划分成5个阶段.[结论]异源失活精子诱导红草金鱼雌核发育的F1代个体可定向发育成母本体色,因此应用人工雌核发育技术结合体色选育技术,可定向培育高档观赏鱼类的优质花色.     

用团头鲂精子诱导红白锦鲤雌核发育研究

[目的]研究用团头鲂（Megalobrama amblycephala）精子诱导红白锦鲤（Cyprinus carpioL.）雌核发育。[方法]用紫外线灭活的团头鲂精子刺激性成熟的红白锦鲤卵子,进行雌核发育,并采用热休克方法诱导染色体加倍。[结果]成功获得了红白锦鲤雌核发育二倍体鱼苗28尾。诱导红白锦鲤雌核发育的最佳条件为：团头鲂精子采用紫外线照射20min后,在孵化水温20~22℃条件下,与红白锦鲤卵子授精后3min进行热休克处理,41℃水温下持续处理2min,此时雌核发育率最高（1.78%）。形态学比较表明,单倍体与雌核发育F1代二倍体和正常二倍体在发育过程中存在明显差异,从肌节开始沉积大量黑色素,胚体扭曲严重,呈＂C＂型;而雌核发育二倍体与正常二倍体对照组相比,在体长、体高、体色和卵黄囊长等方面都极为相似。[结论]该研究为进一步探讨红白锦鲤色素遗传机制及定向培育优良新品种奠定了基础。     

冷休克诱导红鳍东方鲀雄核发育单倍体的条件优化

为探索无需卵子失活仅用冷休克方法诱导雄核发育单倍体,以红鳍东方鲀Takifugu rubripes为研究对象,试验选用L_9(3~4)设计,进行3因素3水平的正交试验,处理温度设为0、2、4℃,处理持续时间设为30、45、60 min,处理起始时间设为2、5、8 min,共9个试验组,并对其后代采用单个胚胎染色体计数法进行染色体数目统计及微卫星分析。结果表明:冷休克诱导得到的单倍体率最高为第7试验组和第9试验组,分别为受精后8 min在4℃下处理30 min和受精后5 min在4℃下处理60 min,单倍体率分别为86.7%和80.0%;根据正交试验直观分析结果,得出冷休克诱导红鳍东方鲀雄核发育单倍体的3因素最优组合为处理温度4℃、处理持续时间60 min、处理起始时间8 min;影响冷休克诱导单倍体的3因素主次顺序为处理温度处理起始时间处理持续时间;微卫星分析结果表明,单倍体携带的遗传基因全部为父本的遗传基因。研究表明,仅用冷休克方法可以成功诱导红鳍东方鲀雄核发育单倍体,雄核发育单倍体率高达86.7%,为进一步研究诱导红鳍东方鲀雄核发育二倍体奠定了基础。     

团头鲂雌核发育后代的微卫星标记分析

采用松浦镜鲤(Cyprinus carpio Songpu carp)的紫外线遗传灭活精子刺激团头鲂(Megalobrama amblycephala)卵子后冷休克抑制卵子第二极体释放方法,获得团头鲂雌核发育个体。流式细胞仪检测雌核发育个体的DNA含量与正常团头鲂二倍体的DNA含量并没有显著性差异,表明雌核发育个体为二倍体。通过引物优化,筛选父母本具有特异性的8对微卫星引物,对雌核发育后代进行检测,结果表明雌核发育个体的遗传物质均来自母本,没有父本的遗传物质渗入。筛选出母本为杂合的10对微卫星引物对子代的纯合性进行评价,结果显示雌核发育后代在TTF-EST46、TTF-EST61、TTF-EST851位点全部为纯合,而TTF-EST12座位上的重组率为86.4%,其他6个位点的重组率为100%,这10个位点的平均重组率为68.64%。试验结果表明,通过抑制第二极体并不能获得纯合性较高的团头鲂雌核发育个体,但具有与母本较高的遗传同质性,可以作为良好的育种材料使用。     

单倍体诱导系在玉米育种研究中的初探

利用3个单倍体诱导系与8个不同基因型母本(普通玉米、甜玉米、糯玉米和甜糯玉米)杂交诱导,根据籽粒颜色、根尖染色体压片、气孔密度并结合田间植株表现鉴定单倍体,并利用秋水仙素处理加倍.结果表明,不同诱导系间诱导率存在差异,MT041 平均单倍体诱导率显著高于其他 2个诱导系,诱导率为4.17％;不同基因型母本间也存在显著差异,糯玉米和普通玉米材料单倍体率显著高于甜玉米,甜糯玉米杂交种对甜玉米单倍体提高有利.0.06％秋水仙素溶液浸根加倍效果显著高于0.02％浓度,但高浓度的秋水仙素处理成苗率不高,结果表明加倍技术仍然是制约DH育种技术广泛应用的瓶颈.     

不同生态条件下玉米单倍体诱导率和加倍率研究

以8个不同基因型组合为母本、玉米单倍体诱导系JS6-1为父本,在三亚、长春和长岭3种生态环境下研究了单倍体的诱导率、自然加倍率和秋水仙素加倍率。结果表明:不同地点和不同基因型材料的玉米单倍体诱导率、自然加倍率和秋水仙素加倍率之间差异显著。在三亚的单倍体诱导率、自然加倍率和秋水仙素加倍率显著高于长春和长岭,长春的自然加倍率和秋水仙素加倍率显著高于长岭,但单倍体诱导率无显著差异,三亚更适合玉米单倍体诱导和加倍。不同基因型组合的诱导率和加倍率也存在显著差异,由DH系L16所配组合J13×L16(先锋父本×先锋父本DH系)的诱导率和加倍率均显著高于其他组合。选择合适生态条件和基础材料,加强田间管理是提高单倍体育种效率的关键措施。     

水稻单倍体植株体细胞培养诱导二倍体植株的研究

水稻花药培养——单倍体育种,已成为水稻育种的一项新技术.但目前花粉单倍体植株仍依赖于自然加倍,加倍率一般仅30～50%左右,以致大量单倍体植株不能得到充分利用.金聿等仿照菸草上适用的组织法,在水稻叶鞘上曾获得过二倍体植株,但诱导频率低、诱导期长,实践上应用尚有一定困难.因此,进一步探讨单倍体植株体细胞培养染色体加倍技术,在理论和实践上都具有一定的意义.     

水稻单倍体离体自然加倍因素的研究

以籼爪杂交稻F2花粉单倍体幼穗为材料，对山梨醇，蔗糖，2，4－D和NAA作了不同浓度配比的矩阵图法设计试验，获得高达91．7％的二倍体自然加倍率，试验结果表明，附加山梨醇20－80克／升无蔗糖的N6培养基对单倍体的自然加倍有明显的促进作用；培养基中附加1－4毫克／升2，4－D亦可大大提高加倍率，形成2，4－D→愈伤组织→自然加倍正相关关系，水稻单倍体具有绿苗诱导率高和倍性不稳定的特点。     

高效生物诱导玉米单倍体及加倍方法的研究

【目的】探讨高效的玉米单倍体诱导和加倍方法。【方法】以北方春玉米区高抗茎腐病的自交系Z99和高感茎腐病的自交系R120的杂交F1代为母本,以5个诱导系(Y601~Y605)为父本,进行单倍体杂交诱导试验;以秋水仙素作为玉米单倍体人工染色体加倍药剂,采取4种处理方法(浸种法、浸芽法、滴心叶法、注射法),每种方法设置3个质量浓度梯度(0.1,0.3和0.5mg/mL)进行单倍体加倍试验。【结果】单倍体诱导试验表明,延迟授粉(长花丝≥8cm)的平均单倍体诱导率为17.4%,约为正常授粉(短花丝≤4cm)条件下的3.3倍;伏后授粉的诱导率平均为18.9%,约为伏期授粉的3.3倍。秋水仙素加倍试验中浸种法对植株伤害较严重,存活率低于50%;注射法(0.5mg/mL)和滴心叶法(0.3mg/mL)的散粉率较高(46.9%,28.3%),相应的结实率也较高(14.6%,10.9%)。【结论】花丝长短和授粉时间对玉米单倍体诱导率有重要影响,延迟授粉时间和较低的温度有利于提高单倍体诱导率;秋水仙素加倍玉米单倍体时注射法处理效果最好,滴心叶法次之。     

单倍体诱导创建二倍体技术在油菜遗传育种中的研究进展

单倍体诱导创建二倍体的技术体系主要包括2种类型。(1)对植物中雄性或者雌性生殖器官进行培养获得具有单套染色体组的组织,经过天然或者加倍剂处理获得二倍体;(2)对CENH3基因进行修饰获得单倍体诱导系,利用单倍体诱导系与不同材料杂交获得后者的单倍体,进而加倍成二倍体。在油菜中应用最广泛的单倍体诱导创建二倍体植株的技术是小孢子培养方法,其过程受到3个因素的影响,分别为小孢子胚发生能力、小孢子天然加倍和加倍剂处理后的加倍效率、从胚再生成完整植株的能力。经过多年研究,在油菜中建立的小孢子诱导创建二倍体的技术为油菜遗传育种研究提供了重要的技术支持。小孢子和小孢子培养得到的胚均能用于创造突变体及遗传转化试验。通过遗传学方法定位了决定油菜小孢子胚发生、天然加倍以及胚状体直接成苗的数量性状基因座(QTLs),可在不同群体中验证候选基因。深入挖掘调控小孢子胚发生和再生成苗的分子机制,分析胚性细胞发育的转变、起始细胞的分化以及胚形态发生的基因调控网络,进而为理解油菜单倍体诱导以及二倍体发生的作用机制提供依据。随着植物单倍体诱导发生的分子机制被逐步揭示,在油菜中对与拟南芥染色体减数分裂相关的同源基因进行修饰能够获得单倍体诱导系,将其与待改良的父母本进行杂交可快速获得具有不同亲本背景的单倍体,经过加倍剂处理可快速获得纯系,单倍体诱导技术能够用于反向育种研究以及品种的遗传改良。     

黄姑鱼正常二倍体和雌核发育体胚胎发育及早期生长的比较研究

对黄姑鱼正常二倍体（N）、雌核发育二倍体（G）和单倍体（H）的胚胎发育进行观察,并对其早期生长情况进行比较。结果显示：（1）受精率N>H>G,孵化率N>G>H,畸形率H>G>N,72 h成活率N>G>H;（2）正常二倍体胚胎经21 h 10 min孵化出膜,雌核发育二倍体和单倍体孵化出膜分别用时23 h 10 min和23 h 30 min;雌核发育二倍体发育滞后主要出现于原肠早期和孵出期,单倍体滞后出现于原肠晚期。从形态上看,单倍体胚胎呈现典型的单倍体综合症,雌核发育二倍体和正常二倍体胚胎发育形态正常且两者无明显差异。各组死亡高峰均出现在原肠晚期,单倍体组开口前全部死亡;（3）60日龄之前雌核发育二倍体生长速度明显慢于正常二倍体且个体间差异较大。     

雌核发育翘嘴鲌胚胎发育和形态特征的研究

在成功获得翘嘴鲌减数分裂型雌核发育鱼的基础上,观察比较了雌核发育胚胎与单倍体胚胎和普通胚胎的发育特征及时序差异,探讨了冷休克处理对胚胎发育的影响及完善雌核发育胚胎孵化管理的措施,并对雌核发育翘嘴鲌成鱼进行了形态学特征分析。结果表明:(1)与普通胚胎相比,雌核发育胚胎受精率较低且仔鱼畸形率较高,单倍体孵化率极低。(2)雌核发育组胚胎出现不规则细胞分裂、卵膜破裂、卵黄囊凝集及单倍体综合征等现象,其中原肠期和出膜前期为胚胎死亡高峰期。(3)雌核发育二倍体与普通胚胎的发育特征相似,卵裂至原肠期阶段发育特别缓慢,原肠期以后,各期发育所用时间与普通胚胎基本相同;单倍体胚胎卵裂开始至囊胚阶段,发育速度与普通胚胎无明显差异,在原肠期阶段发育滞后,其他时期一直处于缓慢状态,仔鱼具有明显的单倍体综合症。(4)雌核发育系体型较普通翘嘴鲌已经发生了一定的变化。     

精子膜蛋白在异精雌核发育银鲫中的作用

通过对雄性银鲫的新鲜精液进行分级抽提得到精子的不同组份，包括精浆、精头的膜、鞭毛和脱膜精头等，在荷包红鲤和雌性银鲫杂交时加入其中的可溶性精头膜蛋白组分，研究精子膜蛋白在雌核发育银鲫异源受精中的作用。研究发现，加入同源精子膜蛋白后的雌核发育银鲫异源受精卵的孵化率比对照组低很多，并且在子代培育过程中，发现了生长速度快、表型和父本相似、基因型基本和父本基因型相同的特殊子代。在某种程度上表明：精子膜蛋白可能是雌核发育银鲫卵子进行雄核发育的关键因素。     

精子膜蛋白在异精雌核发育银鲫中的作用

通过对雄性银鲫的新鲜精液进行分级抽提得到精子的不同组份，包括精浆、精头的膜、鞭毛和脱膜精头等，在荷包红鲤和雌性银鲫杂交时加入其中的可溶性精头膜蛋白组分，研究精子膜蛋白在雌核发育银鲫异源受精中的作用。研究发现，加入同源精子膜蛋白后的雌核发育银鲫异源受精卵的孵化率比对照组低很多，并且在子代培育过程中，发现了生长速度快、表型和父本相似、基因型基本和父本基因型相同的特殊子代。在某种程度上表明：精子膜蛋白可能是雌核发育银鲫卵子进行雄核发育的关键因素。     

德国镜鲤和不同倍性泥鳅银染核型的比较研究

采用PHA体内二次注射法及快速银染法对德国镜鲤和不同倍性的泥鳅进行银染核型的比较研究。结果表明,德国镜鲤中期分裂相及间期核中呈现出Ag-NORs的数目为1～2个,含有2个Ag-NORs频率最高,分别为80%和56%。二倍体泥鳅中期分裂相及间期核中呈现出Ag-NORs的数目为1～2个,含有2个Ag-NORs频率最高,分别为72%和60%。四倍体泥鳅中期分裂相及间期核中呈现出Ag-NORs的数目为1～4个,中期分裂相中含有3个Ag-NORs,频率最高为36%,间期核中含有2个Ag-NORs,频率最高为40%。德国镜鲤2n=100,核型组成为30m+26sm+30st+14t,NF=156。NOR的染色体在核型中位置和NORs在染色体上的位置是:sm组第8号染色体的短臂末端。二倍体和四倍体泥鳅NOR的染色体在核型中位置和NORs在染色体上的位置均是:m组第1号染色体的短臂末端。研究结果证实德国镜鲤与中国鲤鱼一样,是多倍化后经历二倍化过程演变而来,是二倍化的四倍体,即染色体数目为2n=100。四倍体泥鳅进行加倍后未发生二倍化或在二倍过程中,是遗传四倍体,染色体数目为4n=100。     

异源精子诱导栉孔扇贝雌核发育早期胚胎发育及其倍性分析

采用紫外线遗传灭活的长牡蛎（Crassostrea gigas）精子作激活源,经6-DMAP加倍诱导栉孔扇贝（Chlamys farreri）第二极体抑制型雌核发育二倍体;运用荧光显微技术,对雌核发育二倍体卵子早期胚胎发育过程中的核相变化进行观察。结果显示,紫外线处理过的精子入卵后发生一次轻微膨胀,形成雄性原核,但不形成染色体,而是浓缩为致密的染色质小体（DCB）,DCB或滞留于两卵裂球的分裂沟上或进入其一的细胞质中,不与雌原核融合;雌核发育胚胎的发育速度明显滞缓,经6-DMAP处理后胚胎发育速度加快,发育同步化;在雌核发育二倍体诱导过程中,还观察到杂交体、异源三倍体、雌核发育单倍体、雌核发育四倍体。结果为异源精子诱导栉孔扇贝雌核发育提供了细胞学证据。     

异源精子诱导栉孔扇贝雌核发育早期胚胎发育及其倍性分析

采用紫外线遗传灭活的长牡蛎（Crassostrea gigas）精子作激活源,经6-DMAP加倍诱导栉孔扇贝（Chlamys farreri）第二极体抑制型雌核发育二倍体;运用荧光显微技术,对雌核发育二倍体卵子早期胚胎发育过程中的核相变化进行观察。结果显示,紫外线处理过的精子入卵后发生一次轻微膨胀,形成雄性原核,但不形成染色体,而是浓缩为致密的染色质小体（DCB）,DCB或滞留于两卵裂球的分裂沟上或进入其一的细胞质中,不与雌原核融合;雌核发育胚胎的发育速度明显滞缓,经6-DMAP处理后胚胎发育速度加快,发育同步化;在雌核发育二倍体诱导过程中,还观察到杂交体、异源三倍体、雌核发育单倍体、雌核发育四倍体。结果为异源精子诱导栉孔扇贝雌核发育提供了细胞学证据。     

兴国红鲤诱导普安银鲫异精雌核发育子代研究

用兴国红鲤原种(父本)作异源精核诱导营天然雌核发育的普安银鲫A型(母本),异精雌核发育普安银鲫子代,投放2.3 g/尾的鱼种,经105 d饲养。结果:出池规格达69.5 g/尾,日增重0.64 g/尾,比普通鲫提高0.27 g/尾;群体增重倍数24.3倍,较对照池提高11.62倍;成活率85.04%,比对照组提高6.54个百分点。异精雌核发育子代在生长速度和抗病性方面较土著鲫显示出显著的养殖效果。     

运用RAPD技术鉴别建鲤雌核发育后代的研究

用紫外线灭活红鲫Carassius auratusvar. red精子,诱导建鲤Cyprinus carpiovar. jian进行人工雌核发育,共获得241尾雌核发育子一代鱼。经形态特征初步分类后,取10尾进行RAPD分析,以鉴别雌核发育鱼。用筛选的10种随机引物,均可扩增出建鲤和红鲫的特征条带。扩增结果发现:部分子一代仅出现建鲤特征条带,未发现红鲫特征条带,为雌核发育鱼;部分子一代既有建鲤特征条带,也出现红鲫特征条带,为鲤、鲫杂交鱼。本试验结果表明,采用RAPD技术可高效、准确地鉴别出异源精子诱导的雌核发育鱼。     

一龄金鱼性成熟及生殖力研究

通过繁殖实践和组织学切片,研究了一龄金鱼的性成熟及生殖力情况。结果表明,繁殖季节的一龄金鱼性腺已发育成熟,雌性个体中卵巢已发育到了第Ⅳ期,主要由Ⅳ时相卵母细胞组成,雄性个体精巢已发育到第Ⅴ期,精细小管中已布满成熟的精子;在自然和人工环境下,一龄金鱼能自行产卵受精并产生存活后代,证明一龄金鱼能够达到性成熟,在此2种条件下并都能够自行繁殖后代。另外,对金鱼产生的单倍体卵子的质量和直径分别与红鲫产生的单倍体卵子及四倍体鲫鲤产生的二倍体卵子的质量和直径进行比较,结果表明,卵子的质量及直径与卵子的倍性存在正向相关关系。