缺帘鱼精子超低温保存的初步研究

筛选比较了不同保存液、保护剂、降温方式、解冻方式对缺帘鱼精液超低温保存活力的影响,初步解释了缺帘鱼精子经超低温短期保存后活力明显较鲜精低的原因.结果显示:Ringer's液作为保存液,16%二甲亚砜作为保护剂,选取五步法超低温冷冻保存精子[精子缓慢降温至-150℃→液氮面上3 cm(约-170℃),停留4 min→液氮面(约-190℃),停留1 min→液氮];40℃水浴解冻取得最好的冻后活力,解冻后精子活力为(35.2±4.5)%.     

兴国红鲤精液超低温冷冻保存及效果分析

对兴国红鲤精液的超低温冷冻保存技术进行了研究。以解冻后精子的寿命和运动力为参数,分别探讨了不同组合的稀释液、抗冻剂以及冷冻程序对兴国红鲤精液进行超低温冷冻保存的保护效果。试验结果表明,选用Ringer液为稀释液,8%DMSO为抗冻剂,按照程序-80℃平衡15 min,后保存于-196℃液氮中,37℃水浴100 s解冻,精液解冻激活后镜检,精子活力达到(83±9.6)%,寿命在(86.25±24.7)s,接近鲜精的水平。本研究结果为保护淡水鱼类的种质资源提供了理论基础。     

大鳞副泥鳅精液超低温冷冻保存方法的优化

【目的】优化大鳞副泥鳅精液超低温冷冻保存方法。【方法】以解冻后的精子活力为参数,调控试验条件,筛选最佳精液稀释液和最佳抗冻剂,优化抗冻剂体积分数和精液稀释比例。【结果】5种稀释液中,稀释液Ⅳ效果最好,冻精活力为35.5(±2.7)%;甘油(GLY)、甲醇(METH)、二甲基亚砜(DMSO)等3种抗冻剂中,5%(V/V)DMSO处理的冻精活力为40.7(±2.5)%,显著高于5%GLY和METH处理的冻精活力;优化DMSO的体积分数发现,10%终浓度的DMSO对精液保护效果较好,冻精活力为54.6(±1.5)%;优化稀释液Ⅳ与精液稀释比例发现,稀释液Ⅳ与精液以3∶1体积比稀释时能达到良好效果,冻精活力可达65.4(±2.3)%。【结论】精液稀释液Ⅳ与精液体积比为3∶1,终浓度10% DMSO为抗冻剂,对大鳞副泥鳅精液超低温冷冻保存的效果最佳。     

南美白对虾精子超低温冷冻保存技术研究

【目的】建立一种南美白对虾精子超低温冷冻保存方法,为南美白对虾优良种质的长期保存奠定基础。【方法】利用胰蛋白酶消化法获得游离的南美白对虾精子,分别使用灭菌天然海水、无钙人工海水、3％等渗NaCl溶液和0．9％生理盐水作为基础液,并以不同浓度的二甲基亚砜（DMSO）、甘油、甲醇及其与海藻糖的混合溶液作为抗冻剂,在4种不同降温程序下超低温冷冻保存南美白对虾精子,然后在不同的温度下复苏冷冻精子,以伊红-苯胺黑染色法检测精子存活率。【结果】使用1．00g／L胰蛋白酶消化精荚5min能获得大量游离的南美白对虾精子,以灭菌天然海水为基础液,以10％DMSO和0．25mol／L海藻糖为抗冻剂,在P．1降温程序（4℃平衡30min,以．5℃／min的速率降至-20℃;-20℃平衡5min,以-10℃／min的速率降至-80℃;-80℃平衡5min,然后置于液氮中保存）下超低温冷冻保存南美白对虾精子,经37℃水浴复苏后精子存活率最高。【结论】建立的南美白对虾精子超低温冷冻保存方法具有可行性,为南美白对虾精子冷冻保存库的建立提供了技术支撑。     

马氏珠母贝精子低温保存主要影响因素的研究

采用二甲基亚砜(DMSO)和甘油作为抗冻剂,以海水或体液等为基础液,配制体积分数为6％、8％、10％和12％的抗冻保护液．将马氏珠母贝精液和抗冻保护液以1：2、1：5、1：10和1：20(体积比)混合后,置4℃中平衡30和60min,再于-18℃中冷冻4、24和72h,解冻后观察精子的活动状态和受精率．结果表明,抗冻剂种类、体积分数以及精液与保护液的比例对精子的活动状态有很大的影响;4℃的平衡时间对精子的存活率影响不显著,但对受精率却有明显的影响．在-18℃时,精液和抗冻保护液体积比1：20,DMSO体积分数为10％和12％的两组保存效果较好．精子存活率随着保存时间的增长而降低,但基础液的类型对精子受精率没有明显影响．     

中间球海胆精子超低温冷冻保存方法的研究

对中间球海胆Strongylocentrotus intermedius精子的超低温保存技术进行了研究。以煮沸消毒海水为基础液,添加体积分数为10%的DMSO、体积分数为6%的甘油以及25 mmol/L海藻糖配制成冷冻保护液,与鲜精液按体积比以1∶1混合,在4℃下平衡15 min,于液氮面上方15、3 cm处分别停留3 min和5 min,然后浸入液氮保存。结果表明：用此方法保存的精子解冻后其存活率可达58.2%,受精率达24.7%;解冻后精子受精时,在受精海水中分别添加0、28、56、112、280 mmol/L的葡萄糖,56 mmol/L组的受精率高于其他组,受精率达26%;精子解冻后受精时,在受精海水中添加适量葡萄糖有助于提高受精率。本试验表明,冷冻过程中降温方式、冷冻保护液、平衡时间对精子的冷冻保存效果均有较大影响,各个因素通过优化组合可以大大提高解冻后精子的存活率和受精率。     

湖羊精液稀释液及冷冻保护剂的筛选

试验旨在研究不同稀释液对湖羊精液的4℃保存效果,同时探讨不同种类及浓度的冷冻保护剂对湖羊精液冷冻保存效果的影响。选择6种常见的绵羊精液稀释液配方,检测湖羊精液稀释后精子活力变化,分析精子存活时间及生存指数;另选取6种常见的精子冷冻保护剂,分3组浓度(5%、10%、15%)添加,检测细管冻精解冻后的精子活率。结果表明,6种稀释液对湖羊精液的4℃保存效果存在显著差异,其中F稀释液保存效果最佳。冷冻保护剂的种类和添加比例对湖羊精液的冷冻保存效果都存在影响,稀释液中添加5%的丙三醇对湖羊精液的冷冻保存效果最佳。     

不同糖类对蓝狐精子常温及冷冻保存特性的影响

人工采取6只优质芬兰雄性蓝狐精液,利用含有不同性质糖成分的Tris-卵黄-柠檬酸钠-甘油稀释液稀释后,常温保存及制成细管冻精,荧光免疫方法检测蓝狐鲜精液常温保存及冷冻复苏后冻融精子的质量,目的在于比较不同性质糖在蓝狐精子常温及低温冷冻保存中的作用。结果表明,常温保存时,果糖、木糖及海藻糖试验组精子活力、质膜完整率及顶体完整率较高,与对照组差异显著(P<0.05)或极显著(P<0.01);超低温冷冻保存时,果糖、海藻糖稀释液有利于提高冻融精子质量,活力(44.6%、43.7%)与对照组(35.6%)差异显著(P<0.05),质膜完整率(50.6%、51.2%)、顶体完整率(53.2%、54.1%)与对照组间(39.6%、43.5%)差异极显著(P<0.01),而其他糖分试验组与无糖对照组差别不显著(P>0.05)。结果提示:果糖、木糖、海藻糖亦可作为蓝狐精液常温保存的稀释液成分,而果糖、海藻糖为蓝狐精液超低温冷冻保存较理想的保护剂     

一种新抗冻剂DMF在淡水鱼类精液超低温保存上的应用

本文首次报导了一种新的抗冻剂——N-N-二甲基甲酰胺(DimethylFormamide,DMF)对淡水鱼类精液超低温冷冻保存具有明显效果,冻精的受精效果优于二甲亚砜(DMSO)。团头鲂、鲤、草鱼、鲢、鳙使用13%DMF抗冻剂,精液液氮保存3—4周,受精率分别为76%、54.03%、68.6%、37.9%和40.60%,而用13%DMSO作为抗冻剂时,则分别为69.1%、42.6%、67.6%、19.4%和37.4%。结果表明10—15%DMF作为抗冻剂,含0.5%NaCl的稀释液稀释精液,精液与稀释液按1:4比例混合冷冻;2%NaCl作为激活剂,以10倍体积激活剂稀释解冻精液进行授精为宜。     

不同抗冻保护剂对鸡精液冷冻效果及基因表达的影响

旨在研究不同抗冻保护剂对鸡精液的冷冻保存效果,并通过比较差异表达基因,以解释不同保护剂的抗冻机制。以海兰褐种公鸡为研究对象,检测了不同抗冻保护剂(保护剂Ⅰ和保护剂Ⅱ)冷冻保存后的精子活性,并利用Affymetrix表达谱芯片检测技术,对差异表达相关基因进行筛选。结果表明:1)保护剂Ⅰ组的精液冻后活力活率(27.05±1.22vs 47.65±5.89)显著高于保护剂Ⅱ组(20.65±1.50vs 35.15±5.15)(P0.05);2)鸡精液冷冻后,2个不同抗冻保护剂处理组共发现1 604个差异表达基因。保护剂Ⅰ组中显著上调的基因1 380个,显著下调的基因224个;3)基因本体(GO)分析表明,包括核糖体亚基、线粒体呼吸链、泛素蛋白连接酶结合和微管蛋白结合,翻译起始以及RNA分解代谢等过程都与精液抗冻性相关;4)KEGG通路富集分析发现,其主要富集在内质网应激通路、氧化磷酸化、蛋白质泛素化、核糖体调控以及线粒体呼吸调控等相关信号通路上;5)挑选CCND1、HSP70、RHOA、HSP90和CIRBP5个差异表达基因并利用荧光定量PCR对芯片结果进行验证,二者吻合。综上,初步研究比较了2种精液保护剂的冷冻效果,并筛选出差异表达基因,发现抗冻保护剂Ⅰ更适合海兰褐种公鸡冷冻精液的保存,为鸡精液冷冻技术提供参考,并为鸡精液抗冻分子机制解析提供方向。