昆虫病原线虫Oscheius myriophila 共生细菌菌株B1 的分离与鉴定

从昆虫病原线虫(Oscheius myriophila)华农种群HN体内分离得到1株共生细菌B1。该菌株在NA培养基上形成的菌落为圆形,白色,表面光滑,不透明,隆起,边缘整齐;革兰氏阴性,短杆状,单鞭毛,有荧光。Biolog检测结果显示B1为沙雷氏菌(Serratia sp.);用引物27F/1492R进行PCR扩增,得到B1的16S rDNA扩增产物大小为1 445 bp。Blast搜寻和比对结果表明,该菌株16S rDNA序列与所选的17个嗜线虫沙雷氏菌(S.nematodiphila)的相似度达97%~100%,并以高置信度(99)与这17个嗜线虫沙雷氏菌种群及4个粘质沙雷氏菌(S.marcescens)种群聚于1个单支系中。综合形态和16S r DNA序列特征以及Biolog检测结果,将共生细菌B1鉴定为嗜线虫沙雷氏菌(Serratia nematodiphila)。     

长针线虫Longidorus pinus的形态和分子鉴定

在传统形态学分类鉴定的基础上,结合18S和28S核糖体(r DNA)序列分析方法,对采自山西介休市枣树根际土样中的线虫进行了种类鉴定。结果表明,雌虫热杀死后呈J型或C型,体长3 480～4 366μm,唇区明显缢缩,齿尖针70～82μm,导环距头前端31～34μm,阴门位于体中部,尾短,圆锥形;雄虫未发现;1龄幼虫的替代口针插入齿托内部,尾短,圆锥形,齿尖针44μm,替代口针长度52μm。其鉴定代码为A23-B1-C23-D4-E1-F2-G23-H23-I1-J2-K6。系统发育研究表明,试验种群的18S和28S区序列与Longidorus pinus相应序列(18S:MF674014～MF674015;28S:MF674016～MF674019)在同一进化枝上,置信度分别达100%和96%。通过形态和分子特征,将该种群鉴定为Longidorus pinus Xu,Ye,Wang&Zhao,2018。Longidorus pinus在枣树上首次报道,枣树为该线虫的新寄主。     

我国黄淮麦区10个短体线虫样品种类的分子鉴定

【目的】短体线虫(Pratylenchus spp.)是植物根系内迁移性寄生线虫,可引起许多作物的根腐线虫病,给世界农业生产造成了极大的危害。为明确我国黄淮麦区与禾谷孢囊线虫复合侵染小麦的短体线虫种类,本研究对采自黄淮4省麦区的10个短体线虫样品进行种类的分子鉴定,分析种群系统进化关系及种内遗传变异,以期为我国小麦根部线虫病害的综合防治提供指导。【方法】对采自江苏、安徽、河南和山东4省小麦孢囊线虫发病田中的10个小麦短体线虫样品进行线虫分离,从各样品中随机挑取5条短体线虫,分别提取单条线虫DNA,扩增r DNA 18S片段并进行测序比对,选取序列有代表性的2个DNA样本进一步扩增其r DNA 28S D2-D3区以及mt DNA-COI基因片段,经序列比对分析后,利用MEGA4.0软件采用邻接法分别构建基于r DNA 18S、28S D2-D3和mt DNA-COI序列的系统进化树,通过聚类关系及相似度分析确定线虫种类,同时利用种特异性引物进行验证。【结果】扩增挑取的50条短体线虫的r DNA 18S区片段,测序得到片段长度在857—935 bp,BLAST比对分析揭示部分样品可能为短体线虫的混合种群;进一步测定的20个代表性DNA样本的r DNA 28S D2-D3区和mt DNA-COI基因的片段长度分别在771—784 bp和415—417 bp;系统进化树以及相似度分析揭示我国黄淮流域4省麦区10个短体线虫样品中有咖啡短体线虫(P.coffeae)、落选短体线虫(P.neglectus)和斯克里布纳短体线虫(P.scribneri),其中,江苏沛县样品JS2和山东潍坊样品SD1是落选短体线虫单一侵染样品,河南永城样品HN2和安徽淮北样品AH3是咖啡短体线虫单一侵染样品,安徽萧县样品AH2、AH5和淮北样品AH4以及河南永城样品HN1和HN3均为落选短体线虫和咖啡短体线虫的混合侵染样品,江苏徐州样品JS1是落选短体线虫和斯克里布纳短体线虫的混合侵染样品。用SCAR特异性引物扩增20个短体线虫单条DNA样本,结果显示,用落选短体线虫特异性引物PNEG-F1/D3B5能够从JS1-2、JS2-1、JS2-2、AH2-2、AH4-1、AH5-1、HN1-2、HN3-2、SD1-1和SD1-2等10个样本中扩增出140 bp的单一条带,用咖啡短体线虫引物PC1/PC2能够从AH2-1、AH3-1、AH3-2、AH4-2、AH5-2、HN1-1、HN2-1、HN2-2和HN3-1等9个样本中扩增出630 bp的单一条带,用斯克里布纳短体线虫引物Ps F7/Ps R7从JS1-1中扩增出130bp的单一条带,种类鉴定结果与上述序列分析结果相一致。【结论】我国黄淮流域4省小麦孢囊线虫发病田中的短体线虫种类有咖啡短体线虫、落选短体线虫和斯克里布纳短体线虫,其中落选短体线虫是优势种,证实了短体线虫不同种群复合侵染小麦的现象较为普遍。基于mt DNA-COI基因构建的系统进化树可以有效区分短体线虫的近缘种,相比r DNA 18S和28S基因更适于作为短体线虫种类鉴定的分子靶标。     

三七病原根结线虫核糖体基因ITS区段的克隆测序及其在检测中的应用

根据NCBI基因库中根结线虫属rDNA序列,设计通用引物M18s/M28s,对采自云南文山、砚山、马关、蒙自等地的4个三七病原根结线虫种群(Meloidogyne hapla)rDNA区段进行聚合酶链式反应(PCR)扩增,并将扩增到的目的片段克隆到pGEM-T载体上。对重组克隆进行测序和序列分析,结果表明:4个种群rDNA同源性为100%,ITS区序列长度为479 bp,其中ITS1序列长度为213 bp,5.8S序列长度为159 bp,ITS2序列长度为107 bp。根据此序列设计-对特异性寡聚核苷酸引物Mhf/Mhr,应用PCR技术,以北方根结线虫(Meloidogynehapla)、南方根结线虫(Meloidogyne incognita)、花生根结线虫(Meloidogyne arenaria)和爪哇根结线虫(Meloido-gyne javanica)全基因组DNA为对照,对三七病原根结线虫全基因组DNA进行特异性扩增。结果表明,该对引物能从供试的北方根结线虫和三七病原根结线虫种群全基因组DNA中扩增到462 bp长度的分子片段,而南方根结线虫、花生根结线虫和爪哇根结线虫则无扩增产物。该引物可用于三七病原根结线虫的检测。     

肾形肾状线虫个体间rDNA内转录间隔区的变异

利用DNA序列分析技术对我国浙江、福建和重庆3个地区的肾形肾状线虫(Rotylenchulus reniformis,RN)种内群体及群体内个体间核糖体RNA基因(rDNA)内转录间隔区(internal transcribed spacer,ITS)序列进行PCR扩增及序列变异分析。结果显示不同的群体间均获得2种PCR产物,标记为变异类型Ⅰ(RN_VAR1)和变异类型Ⅱ(RN_VAR2)。基于每个群体内2条雌虫分别挑取各变异类型的5个克隆测序,共得到60个克隆序列。经序列比对分析,发现肾形肾状线虫rDNA基因2种类型的ITS区变异很大,其中变异类型Ⅰ序列长度为705~712bp,鸟嘌呤和胞嘧啶(guanine and cytosine content,GC)含量为45.1%~46.7%;变异类型Ⅱ序列长度为854~860bp,GC含量为48.4%~50.0%。2种类型的ITS相似度(包括5.8SRNA基因)仅为62.1%~65.6%,而各rDNA变异类型内部各个克隆序列也存在差异,变异类型Ⅰ内个体间相似度为89.9%~100%;变异类型Ⅱ内个体间相似度为91.4%~99.8%。系统进化分析表明2种变异序列明显分成2支,同时通过ITS序列分析无法将3个地方群体区分开来。经实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qPCR)检测发现RN_VAR1含量稍大于RN_VAR2,分别占保守18S基因的rDNA重复单位含量的56%和40%。同时,还发现肾形肾状线虫的2种rDNA-ITS变异类型与已报道的2种18SRNA基因变异类型相对应,表明肾形肾状线虫存在2种rDNA变异类型。     

施用方式和土壤深度对昆虫病原线虫越冬的影响

在田间试验条件下,利用孔径为25 μm的尼龙网袋,评价了两种线虫品系(噬菌性异小杆线虫Heterorhabditis bacteriophora和小卷娥斯式线虫Steinernema carpocapsae)、两种施用方式(感染线虫的昆虫尸体和线虫悬液)、两种土层深度(5 cm和15 cm)以及不同取样时间(2013年12月8日、2014年2月18日以及2014年4月14日)对昆虫病原线虫越冬情况的影响.试验结果表明,S. carpocapsae 较H. bacteriophora的低温抗性强,施用后4个月,无论是虫尸剂还是线虫悬液处理,品系S. carpocapsae的存活率均高于H. bacteriophora.另外,各处理组在15 cm深度处的线虫数量均大于5 cm深度处.随着时间的延续,线虫悬液组线虫数量下降迅速.虫尸剂组在前两次取样时几乎未释放线虫,但在次年4月中旬取样时发现,S. carpocapsae虫尸剂有侵染期线虫释放,其释放的线虫数量与S. carpocapsae悬液处理无显著差异.可见,虫尸剂有助于昆虫病原线虫越冬,但与线虫品系有关,采用虫尸剂有助于高效利用昆虫病原线虫防治有害昆虫.     

新疆嗜菌异小杆线虫及其共生细菌的初步鉴定研究

【目的】分离获得新疆地区的昆虫病原线虫及其共生细菌,确定其种属及共生细菌的分类地位,为新疆利用昆虫病原线虫进行生物防治害虫提供新的选择和奠定基础。【方法】采用黄粉甲(Tenebrio molitor)幼虫为诱导昆虫,采用Whitetrap法收集侵染期线虫,通过致死的昆虫血腔和侵染期线虫直接分离共生细菌,利用18S rRNA与形态鉴定初步确定昆虫病原线虫的种属,利用16S rRNA与形态初步确定其共生细菌的分类地位。【结果】从新疆伊犁州尼勒克县一山区牧场林带土壤中分离出一种能够有效致死黄粉甲幼虫的昆虫病原线虫,经初步鉴定其属于异小杆属线虫,与嗜菌异小杆线虫进化距离最近,初步命名为嗜菌异小杆线虫尼勒克品系(Heterorhabditis bacteriophora strain Nileke);分离出其共生细菌,初步鉴定为Photorhabdus luminescens(NLK-1),但无荧光。【结论】在新疆本土成功分离出一种异小杆属昆虫病原线虫及其共生细菌,初步确定了其种属,为在新疆本土开展以昆虫病原线虫为主的生物防治害虫提供了新的选择及途径,为开展本地区更广泛的分离筛选奠定了基础。     

昆虫病原线虫对韭蛆和土壤线虫群落的影响

防治韭菜的主要地下害虫韭蛆(迟眼蕈蚊Bradysia odoriphaga)是造成韭菜农药残留超标主要原因。室内实验表明,生物天敌昆虫病原线虫Steinernema feltiae处理60h后,韭蛆杀死率显著高于使用农药的对照组。2010年4月18日在山东省寿光市丰城地区韭菜地施用昆虫病原线虫以防治韭菜的主要害虫韭蛆,同时以施用化学农药辛硫磷作为对照,处理后第35d和第175d调查结果表明,昆虫病原线虫处理组的昆虫病原线虫多度显著高于化学对照组,其中第175d调查结果表明,经昆虫病原线虫处理后的韭菜鲜重比化学农药处理的对照组增加了10.4%,但差异未达到显著效果。上述结果表明,昆虫病原线虫能够有效控制韭蛆危害。第35d取样结果表明,昆虫病原线虫处理组的土壤线虫群落Shannon多样性指数高于化学农药处理组;第175d调查结果表明,两种处理之间土壤线虫群落各指标相近。试验结果表明昆虫病原线虫能够有效防治韭蛆。     

大豆孢囊线虫侵染绿豆的国内首次报道

[目的]本研究对采自山西绿豆根际的孢囊线虫进行种类鉴定,并测定孢囊线虫对绿豆的致病性。[方法]将绿豆根际孢囊线虫进行分离、观察和测量,采用通用引物对其28S、ITS和COI基因进行PCR扩增和序列分析,利用Geneious软件构建系统发育树,并采用人工接种方法测定孢囊线虫的致病性。[结果]孢囊呈柠檬形,初期白色,后期褐色或黄褐色;阴门锥明显,两侧双半膜孔型,阴门裂35.9～48.7μm,膜孔长39.7～42.4μm,膜孔宽28.0～36.3μm,下桥89.2～97.8μm,有明显的泡状突。二龄幼虫呈蠕虫形,体长401～456μm,口针长21.5～25.0μm,尾部圆锥形,透明尾长19～31μm。该种群的形态特征和测量值与大豆孢囊线虫(Heterodera glycines)一致。基于ITS+28S序列构建系统发育树,本试验种群与大豆孢囊线虫和苜蓿孢囊线虫(H. medicaginis)位于同一分支上,置信度达100%。基于COI序列构建系统发育树,本试验种群与大豆孢囊线虫(MK093154,MK093153,KY775596和MN720172)位于同一分支上,置信度达100%。将孢囊线虫回接到健康绿豆上可引起植株发病,并在根部形成孢囊。[结论]将绿豆根际分离到的孢囊线虫鉴定为大豆孢囊线虫(H. glycines Ichinohe,1952),该孢囊线虫回接到健康绿豆可侵染致病并形成孢囊,这是首次在中国发现大豆孢囊线虫在田间侵染绿豆。     

北京油松上东京伞滑刃线虫的鉴定

对北京地区重点林区开展松材线虫普查时从油松中分离到一个伞滑刃线虫属群体.通过形态特征观察发现其与东京伞滑刃线虫(Bursaphelenchus tokyoensis)基本相似;通过扩增核糖体DNA(rDNA)18S、28S、ITS基因片段及测序分析,发现该群体与东京伞滑刃线虫的rDNA 18S和28S基因序列的相似度高达99%,ITS基因序列的相似度高达98%,因此将该群体鉴定为东京伞滑刃线虫.