‘合作猪’TDRP1基因的克隆及生物信息学分析

【目的】丰富猪TDRP1基因研究的基础数据.【方法】以猪NM_001198925序列为参考,设计特异性引物,通过克隆测序获得‘合作猪’TDRP1基因完整CDS序列,并进行生物信息学分析,同时采用实时荧光定量PCR方法检测TDRP1基因在不同组织中的表达特性.【结果】获得了TDRP1基因完整的CDS序列(GenBank登录号:KU743254),共684bp,其编码186个氨基酸多肽.与参考序列相比,在编码区第33、348位点处发生了同义突变(C→G、C→T).TDRP1基因分子式为C_(897)H_(1421)N_(259)O_(287)S_2,理论等电点(PI)为5.86,不稳定系数为62.66,疏水指数为64.03,平均亲水性为-0.939,属不稳定可溶性酸性蛋白质.二级结构以无规则卷曲和α-螺旋为主,属混合类蛋白质.亚细胞定位结果显示,TDRP1编码的蛋白质在遗传物质复制和转录、翻译过程中发挥功能的可能性分别为26.3%、14.3%,明显高于发挥其它功能的可能性.mRNA表达分析表明,TDRP1基因在垂体和睾丸中高表达,肺、肾、小脑、卵巢中度表达,肝、脾、大脑、胃、小肠中低表达,心脏组织中不表达.【结论】成功克隆了‘合作猪’TDRP1基因的完整CDS区序列,并发现了2个SNP位点;多组织转录表达分析表明TDRP1在垂体和睾丸中表达较高,可为深入研究TDRP1基因的功能提供参考.     

猪TDRP1基因的电子克隆及生物信息学分析

利用生物信息学和比较基因组学方法,对猪TDRP1基因的结构、表达及功能进行分析,结果表明:(1)电子克隆获得猪TDRP1基因cDNA部分序列共776bp,包括119bp的5′UTR、561bp的编码区和96bp的3′UTR,共编码合成187个氨基酸多肽;(2)猪TDRP1基因CDS序列与人、小鼠和大鼠的同源性分别为85%、76.1%、77.1%.编码合成的猪TDRP1蛋白与人、小鼠、大鼠之间的同源性分别为82.5%、71.1%和70.1%;(3)猪TDRP1蛋白的相对分子质量为20489.8,不含信号肽,为1个可溶性蛋白,同时也是1个非分泌性蛋白,存在4个二级结构区段;(4)基于cDNA及EST数据库的检索显示,猪TDRP1基因至少在卵巢和甲状腺等组织中表达.     

中国美利奴成母羊促甲状腺激素受体基因的克隆与组织表达

[目的]探讨绵羊TSHR基因序列及组织表达特征,为进一步研究TSHR在绵羊季节性繁殖中作用的分子机理奠定基础.[方法]利用RT-PCR技术克隆绵羊TSHR基因,并对序列进行生物信息学分析;采用半定量RT-PCR技术检测TSHR在绵羊不同组织的表达情况.[结果]以中国美利奴羊卵巢组织cDNA为模板,获得了3 276 bp的TSHR cDNA序列,包括全部编码区序列(Coding Sequence,CDS)长2 295 bp,编码764个氨基酸.TSHR蛋白结构经预测发现存在多个磷酸化位点和蛋白激酶C磷酸化位点.半定量RT-PCR结果显示,绵羊TSHR基因在所检测组织中均有表达,其中在下丘脑、松果体和垂体中呈高丰度表达,在甲状腺、子宫等组织呈中等丰度表达.[结论]从绵羊卵巢组织中克隆到TSHR基因并进行了序列分析;TSHR基因在绵羊各组织中广谱表达,但在下丘脑、松果体、垂体、甲状腺中表达水平较高,提示TSHR在绵羊季节性繁殖等重要生理活动的神经内分泌调节过程中发挥重要作用.     

陆川猪MYL9基因克隆及其表达差异分析

[目的]克隆陆川猪肌球蛋白调节轻链9基因(MYL9),并进行生物信息学分析及检测其在不同猪种中的表达差异,为明确陆川猪骨骼肌生长规律及研究MYL9的生理功能打下基础.[方法]根据NCBI上的家猪MYL9基因序列设计特异性引物,采用RT-PCR克隆陆川猪MYL9基因,利用在线软件对其进行生物信息学分析,并以实时荧光定量PCR检测陆川猪和杜洛克猪背最长肌中MYL9基因的表达情况.[结果]陆川猪MYL9基因编码区(CDS)序列长519 bp,共编码172个氨基酸;与NCBI上已公布的家猪MYL9基因(NM_001244472.1)CDS序列比对,陆川猪MYL9基因存在2处碱基突变,分别是195 bp处C→A和498 bp处T→C,均为同义突变;陆川猪MYL9基因推导氨基酸序列与家猪MYL9基因推导氨基酸序列的同源性最高,为99.6%,与鸡的同源性最低,为88.4%.陆川猪MYL9蛋白存在3个N糖基化位点和15个磷酸化位点,不存在跨膜结构域和信号肽,符合一般EFh-PEF超家族的结构特征.陆川猪MYL9蛋白二级结构中α-螺旋占54.65%,无规则卷曲占35.47%,β-转角占8.14%,延伸链占1.74%.MYL9基因在杜洛克猪背最长肌中的相对表达量极显著高于陆川猪背最长肌(P<0.01).[结论]MYL9基因序列在不同物种中具有较高的保守性,其在10周龄陆川猪背最长肌中的相对表达量极显著低于杜洛克猪,与其在不同猪种背最长肌中的磷酸化程度有关,也说明MYL9基因对猪肌肉生长速度有一定影响.     

广西巴马小型猪SP1基因克隆测序及其真核表达载体的构建

[目的]克隆广西巴马小型猪特异性蛋白1(SP1)基因,并构建其真核表达载体,为揭示其对猪生长发育的调控机理打下基础.[方法]利用RT-PCR从广西巴马小型猪背最长肌组织中扩增SP1基因,采用DNASTAR、TMHMM等分别进行基因生物信息学分析;以pEGFP-N1质粒构建真核表达载体pEGFP-N1-SP1并转染293T细胞,于转染48 h后在倒置荧光显微镜下观察并拍照.[结果]克隆获得的广西巴马小型猪SP1基因与GenBank中野猪(Sus scrofa)的参考序列(XM_005652569.3)一致,未发现碱基突变位点;其编码序列(CDS)全长2340 bp,编码779个氨基酸.广西巴马小型猪SP1蛋白不存在跨膜结构,也不存在信号肽,不属于分泌型蛋白;其二级结构中α-螺旋占17.84%,延伸链占21.31%,β-转角占9.76%,无规则卷曲占51.09%.构建的真核表达载体pEGFP-N1-SP1能成功转染至293T细胞中并表达出绿色荧光蛋白.[结论]广西巴马小型猪SP1基因CDS序列编码蛋白主要参与细胞内活动,而非外分泌型蛋白,以SP1基因构建的真核表达载体pEGFP-N1-SP1能转染293T细胞并成功表达,可直接用于后期SP1基因功能探索及干扰表达等研究.     

鹌鹁PiRNAs和Piwil1基因克隆及表达研究

[目的]目前,国内外尚无有关禽类piRNAs及其结合蛋白Piwi的研究报道,开展禽类小分子RNA及其结合蛋白的研究将为小分子RNA的遗传特性、发生和消失机理以及转基因鸡等研究提供基础依据.[方法]以鹌鹑为研究对象,通过构建eDNA文库和TA克隆测序的方法从睾丸组织中获得piRNAs序列和Piwill基因的CDS序列,同时采用Q-PCR技术分析了鹌鹑不同生命阶段不同组织中piRNAs和Piwill基因的表达规律.[结果]从鹌鹑睾丸组织中克隆了13个piRNAs序列和Piwi 11基因的CDS序列;Q-PCR结果表明piRNAs和Piwi11基因在鹌鹑不同生命阶段不同组织中均有不同程度地表达.[结论]鹌鹑piRNAs长度与哺乳动物相似;Piwi11基因与红色原鸡有较高的同源性,包含PAZ和Piwi结构域,无信号肽剪切位点,推测其属于Piwi家族蛋白,可能通过降低结合RNA的能力或者影响其它转录因子与结构基因启动子的亲和性发挥调控作用;在睾丸组织中,piRNAs和Piwi11蛋白的表达量均是随着个体的不断发育而增加,推断在禽类中piRNAs可能与Piwi蛋白相互作用共同调控精子的发生过程.     

版纳微型猪近交系FANK1基因CDS克隆、qPCR表达及功能生物信息学分析

【目的】获得猪FANK1基因CDS序列、组织表达和蛋白质功能信息。【方法】以GenBank下载的猪及近缘物种的FANK1 mRNA序列为参考序列,设计特异引物从版纳微型猪近交系(BMI)睾丸组织中扩增FANK1基因完全编码序列及部分侧翼序列。应用实时荧光定量PCR技术检测BMI 15个重要组织的FANK1 mRNA转录表达水平,并对FANK1翻译的蛋白质序列进行多种功能生物信息学分析,预测FANK1蛋白质的功能,最后构建FANK1多物种氨基酸系统进化树。【结果】获得了BMI FANK1编码区序列长1 041 bp,编码346个氨基酸,序列已提交GenBank,基因登录号为KU705617和KU705618,对应的氨基酸登录号为AOC89035和AOC89036。基因组结构分析表明FANK1基因定位于猪14号染色体,有11个外显子和10个内含子。多组织相对荧光定量表达分析表明FANK1基因在睾丸、尿道球腺和精囊腺中呈高表达水平;在其他组织中呈中低表达水平。功能生物信息学分析表明FANK1蛋白质含有2种保守结构域FN3和ANK,无跨膜螺旋结构,无N端信号肽序列,二级结构以无规卷曲为主,N末端和C末端均亲水,有4类功能活性位点。系统进化分析表明,FANK1基因在进化中高度保守,且与牛、羊的亲缘关系最近,符合物种的系统分类学。【结论】成功克隆了版纳微型猪近交系FANK1基因的CDS序列并进行了多种组织表达分析,为后续研究FANK1基因在小型猪精细胞分裂及调节信号通路方面的作用及功能奠定基础。     

水稻ARAB-1类似基因的电子克隆及生物信息学分析

[目的]对水稻OsARAB-1基因进行电子克隆,并对其进行生物信息学分析.[方法]以NP 174188.1为查询探针,通过电子克隆获得OsARAB-1基因全长cDNA,用生物信息学软件对其核苷酸序列和蛋白质序列进行生物信息学分析.[结果]获得了OsARAB-1基因全长cDNA,基因编码区序列(CDS)全长1 086 bp.电子定位于第五染色体基因组序列NC 008398.2核苷酸序列6 769 813 ～6 773 213 bp区域.OsARAB-1蛋白属于亲水性的胞外蛋白,比较稳定,偏碱性.二级结构以α螺旋和无规则卷曲为主.具有2个功能结构域:SGNH水解酶型酯酶、GDSL脂肪酶.有21个磷酸化位点、7个糖基化位点.推定的活性位点的氨基酸残基为Ser34、Gly107、Asn167、Asp333、His336.与玉米酯酶亚型B4FM12亲缘关系最近.OsARAB-1基因的表达对水稻的发育和形态发生起重要作用,与水稻抗稻瘟病有关.[结论]该研究为用试验方法克隆该基因和功能鉴定奠定了基础.     

广西巴马小型猪ApoA1基因克隆及其生物信息学分析

[目的]克隆广西巴马小型猪载脂蛋白A1(ApoA1)基因并进行生物信息学分析,为后续开展ApoA1基因研究提供基础数据,同时为制作广西巴马小型猪动脉粥样硬化疾病模型打下基础.[方法]以提取的广西巴马小型猪肝脏组织总RNA为模板,运用RT-PCR克隆广西巴马小型猪ApoA1基因序列,以实时荧光定量PCR(qPCR)检测ApoA1基因在广西巴马小型猪心脏、肝脏、脾脏、肺脏和肾脏组织中的表达情况,并利用MegAlign、ProtParam、SOPMA、Net-Phos、SignalP和SWISS-MODEL等在线分析软件对广西巴马小型猪ApoA1基因进行生物信息学分析及构建系统发育进化树.[结果]广西巴马小型猪ApoA1基因编码区(CDS)序列长795 bp,与普通猪ApoA1基因序列的同源性为99.9%,仅第630处有1个碱基发生同义突变.ApoA1基因在广西巴马小型猪心脏、肝脏、脾脏、肺脏和肾脏组织中均有表达,且以肝脏中的相对表达量最高、脾脏中的相对表达量最低.广西巴马小型猪ApoA1由264个氨基酸残基构成,其分子式为C1343H2136N376O409S5,蛋白分子量为30254.31 Da,理论等电点(pI)为5.47,属于亲水性蛋白,存在跨膜结构,不存在信号肽,有18处磷酸化位点(丝氨酸磷酸化位点有10处,苏氨酸磷酸化位点有6处,络氨酸磷酸化位点有2处).广西巴马小型猪ApoA1的二级结构中,α-螺旋占79.92%,β-折叠占2.65%,无规则卷曲占11.12%,延伸链占6.31%,属于全α类蛋白.广西巴马小型猪ApoA1氨基酸序列与普通猪的同源性最高,达99.6%;由基于ApoA1氨基酸序列同源性构建的系统发育进化树也可看出,广西巴马小型猪与普通猪的亲缘关系最近.[结论]广西巴马小型猪ApoA1基因保守性强,以在肝脏中的表达量最高,是广西巴马小型猪抗动脉粥样硬化的重要因子,通过敲除该基因可制作广西巴马小型猪动脉粥样硬化疾病模型.     

陆川猪ANKRD1基因克隆及其表达差异分析

[目的]克隆陆川猪心肌锚蛋白重复域1基因(ANKRD1),并进行生物信息学及组织表达谱分析,为研究ANKRD1在陆川猪机体内的功能作用提供参考依据.[方法]根据NCBI已公布的野猪ANKRD1基因序列(NM_213922.1)设计特异性引物,采用TRIzol法提取陆川猪心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、背最长肌和皮下脂肪的总RNA,反转录合成cDNA,并以此为模板进行ANKRD1基因克隆,通过MegAlign、Protaram、Protscale、MHMM Server和Sig-nalP等在线分析软件进行生物信息学分析,最后以实时荧光定量PCR检测ANKRD1基因在陆川猪各组织中的表达情况.[结果]陆川猪ANKRD1基因蛋白编码区(CDS)序列全长960 bp,编码319个氨基酸残基,与NCBI已公布野猪ANKRD1基因(NM_213922.1)的CDS序列存在4处碱基突变,但均为同义突变,二者的ANKRD1氨基酸序列同源性为99.6%.陆川猪ANKRD1基因编码蛋白分子量为36125.70 Da,理论等电点(pI)为7.09,属于稳定蛋白,其二级结构中α-螺旋占46.39%、无规则卷曲占39.81%、β-转角占9.09%、延伸链占4.70%;陆川猪ANKRD1蛋白不存在跨膜结构,也无信号肽,有多个磷酸化位点.陆川猪ANKRD1基因在其心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、背最长肌和皮下脂肪等7个组织中均有表达,其中以心脏中的相对表达量最高,显著高于在其他组织中的相对表达量(P<0.05,下同),在脾脏中的相对表达量最低,显著低于在心脏、肝脏、肺脏和背最长肌中的相对表达量.[结论]ANKRD1基因在陆川猪的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、背最长肌和皮下脂肪等组织中均有表达,且存在明显差异,故推测ANKRD1基因在不同组织中发挥不同作用.