不同繁殖季节牦牛睾丸组织VEGF及其受体分布比较

【目的】探索VEGF及其受体(VEGFR2)在繁殖期和繁殖间期成年牦牛睾丸组织中的分布特点并进行比较分析.【方法】应用免疫组织化学SP法检测VEGF及其受体(VEGFR2)分布特征并通过IPP图像分析软件进行定量统计.【结果】免疫组织化学显示,成年牦牛睾丸中,VEGF表达于各级生精细胞以及Sertoli细胞和Leydig细胞,强表达于长形精子,小血管内皮细胞见强阳性表达,肌样细胞未见表达;其受体VEGFR2表达于各级生精细胞及Sertoli细胞,且Leydig细胞内强表达,小血管弱表达;性成熟牦牛睾丸组织中VEGF和VEGFR2的表达繁殖期高于繁殖间期,但无显著统计学差异(P0.05).【结论】VEGF及其受体在性成熟牦牛睾丸组织中表达丰富,表明其参与精子发生及局部微环境的调节,不同繁殖期有一定的表达差异,提示其表达与牦牛发情活动密切相关.     

LN在不同繁殖期蓝狐睾丸组织分布比较

【目的】比较睾丸细胞外基质的重要成分LN在不同繁殖季节蓝狐睾丸中的分布及变化特点.【方法】采用H.E染色法、组织化学法、免疫荧光技术结合IPP形态计量比较分析.【结果】H.E染色表明繁殖间期与繁殖期蓝狐睾丸生精小管内部结构有明显不同,繁殖期蓝狐睾丸生精上皮细胞层数明显多于繁殖间期,精子发育良好,繁殖间期生精小管内无成熟精子.免疫组织化学密度表明,LN在蓝狐不同繁殖期睾丸间质细胞,小血管壁均呈强阳性表达,管周肌样细胞中等表达,阴性对照无表达.免疫荧光表达显示,LN主要表达于间质细胞及管周肌样细胞,平均吸光度统计结果表明,繁殖期较繁殖间期表达显著增高.【结论】蓝狐睾丸LN在生精小管基膜的表达在不同繁殖期变化不明显,但在间质细胞及支持细胞的表达差异显著与季节性繁殖有一定关系,提示LN可能参与间质细胞分泌雄性激素的调节.     

高原地区成年藏绵羊和小尾寒羊睾丸组织eNOS的差异表达

【目的】研究内皮性一氧化氮合酶(endothelial NOS,eNOS)在高原地区成年藏绵羊和小尾寒羊睾丸组织中的定位及分布特征.【方法】采用免疫组化SP法结合半定量法描述染色结果分布密度,蛋白免疫印迹(Western blot,WB)分析比较.【结果】eNOS免疫组织化学分布密度表明,小尾寒羊睾丸精子细胞和精原细胞强阳性表达,而在藏绵羊精子和精原细胞内无明显表达;小尾寒羊间质细胞(leydig cell)和支持细胞(sertoli cell)为中等阳性表达,在藏绵羊弱阳性表达.eNOS在藏绵羊及小尾寒羊小血管均为阳性表达.Western免疫印迹显示eNOS抗体有较好的反应性,且小尾寒羊睾丸组织蛋白反应性强于藏绵羊睾丸组织提取蛋白.【结论】高原环境中,eNOS可参与调节高原地区绵羊睾丸局部血管舒缩以适应环境温度变化;小尾寒羊生精上皮eNOS表达较强可能是高寒环境中精子生成过程中的低氧应激反应的一个方面.     

Ⅳ型胶原蛋白在成年牦牛生精小管的定位及分布特征

采用H.E和Masson特殊染色以及免疫组织化学法结合形态计量学统计分析,对成年牦牛(5~7岁)生精小管中的Ⅳ型胶原蛋白进行定位,研究其分布特征.结果表明:睾丸生精上皮结构清晰,有4~8层细胞,胶原纤维分布于生精小管固有膜和间质血管壁上;免疫组织化学染色观察Ⅳ型胶原蛋白在sertoli细胞、各级生精细胞及精子上呈强阳性表达,血管内皮细胞有阳性表达,生精小管基膜及管周肌样细胞为弱阳性表达,而leydig细胞几乎无表达;Ⅳ型胶原蛋白的相对表达量在sertoli细胞及各级生精细胞显著高于在leydig细胞和管周肌样细胞中(P0.05),但在固有膜和管周肌样细胞之间的相对表达量无显著差异(P0.01).Ⅳ型胶原蛋白在成年牦牛睾丸中的分布特征与胶原纤维分布相一致,sertoli细胞和管周肌样细胞在合成及分泌Ⅳ型胶原蛋白中发挥作用.     

山羊PHGPx基因在不同组织中的表达特点及性腺中的定位

【目的】研究磷脂氢谷胱甘肽过氧化物酶(PHGPx)在山羊各种组织中的表达特点及在性腺中的定位情况。【方法】提取各种组织总RNA,应用实时荧光定量PCR方法检测各种组织PHGPx mRNA表达规律,利用免疫组化技术对睾丸和附睾PHGPx进行定位分析。【结果】PHGPx mRNA在各种组织表达水平由高到低依次为:睾丸心脑附睾肾肝肺脾背最长肌,在性腺和附睾中:睾丸附睾尾附睾头附睾体;免疫组化结果显示睾丸间质组织、生精细胞均有阳性产物,附睾头部平滑肌纤维表达弱阳性,附睾尾部附睾管中的单层柱状上皮表达呈强阳性。【结论】PHGPx在不同组织广泛表达,发挥重要的生物学功能,免疫组化结果直观显示了睾丸及附睾表达差异的部位,需深入研究其作用机制。     

CYP19基因在牦牛睾丸及附睾组织中的表达定位

【目的】为了探讨CYP19基因在牦牛睾丸及附睾不同部位的表达差异性.【方法】应用免疫组织化学、qRT-PCR方法、Western-blot等检测方法,研究成年牦牛睾丸及附睾头、体、尾等4个组织中CYP19基因的表达和定位.【结果】免疫组化结果显示在睾丸支持细胞、间质细胞和生殖细胞中P450arom蛋白均有较强表达,在附睾头、体、尾的上皮细胞和平滑肌细胞均有较弱表达.蛋白印迹结果显示附睾头表达最高,附睾尾、附睾体、睾丸表达依次递减(P0.05).mRNA水平结果表明睾丸中表达量最高,附睾尾、附睾头、附睾体表达依次递减(P0.01).【结论】以上结果提示CYP19基因在睾丸及附睾头、体、尾中表达有差异,这一结果为进一步研究CYP19基因对牦牛睾丸及附睾发育作用奠定了基础.     

GATA-4在不同能量水平下绵羊睾丸中的表达与定位分析

为了研究GATA-4在不同能量水平下绵羊睾丸中的表达特点及定位情况,提取睾丸组织总RNA,应用Real-Time PCR方法检测睾丸中GATA-4mRNA的表达规律,利用免疫组化技术对睾丸中GATA-4进行定位分析。结果表明,GATA-4mRNA在睾丸中的表达水平由低到高依次为:35%VFI组﹤65%VFI组﹤自由采食组;免疫组化结果显示睾丸Sertoli细胞、Leydig细胞、生精细胞均有阳性产物,阳性强度分别为:35%VFI组﹤65%VFI组﹤自由采食组。GATA-4基因在不同能量水平下具有表达差异性,对绵羊的繁殖性能具有重要的调控作用。     

HSPA2在牦牛不同组织器官中的表达差异

【目的】探索热休克蛋白70-2(heat shock 70kD protein-2, HSPA2)在牦牛不同组织器官中的表达差异。【方法】选取 3 头 1 岁龄的健康青海高原雄性牦牛为研究对象,在正常生理条件下,于 2013 年 9 月中旬采集不同组织器官（心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、脑和睾丸）样本。（1）从牦牛不同组织器官中提取 RNA,将 RNA 反转录成第一链 cDNA,参照牦牛 HSPA2 和β-actin 基因序列（登录号为 KC790105.1和 DQ838049.1）设计特异性引物,首先采用 RT-PCR 来验证实时荧光定量 PCR（RT-qPCR）是否能应用于牦牛不同组织器官中 HSPA2表达差异的测定;然后采用 RT-qPCR 测定牦牛不同组织器官中 HSPA2相对表达量的差异。（2）将牦牛不同组织器官样本 4％多聚甲醛固定,制成石蜡切片,免疫组织化学法测定 HSPA2 在不同组织器官中的分布。采用 Image-Pro Plus 6.0 软件进行免疫组化图像分析,测定 HSPA2 阳性反应物的积分光密度,进行吸光度分析;通过 SPSS 19.0 统计软件,用单因素方差分析进行差异显著性测定。【结果】(1) RT-PCR 结果表明 RT-qPCR 法可用于牦牛不同组织器官中 HSPA2表达差异的测定。实时荧光定量 PCR 结果表明,HSPA2在睾丸中的相对表达量,分别是在脑、肾脏、心脏、脾脏、肺脏和肝脏中的 83.33、97.09、111.11、133.33、222.22和 285.71倍。(2)免疫组织化学结果显示,牦牛睾丸、肾脏、脑、心脏、肺脏、肝脏和脾脏中均有 HSPA2 的阳性表达。其中,在牦牛肾脏皮质肾小管、髓质肾小管,大脑皮质海马CA1区、小脑皮质,心肌细胞,肺泡上皮细胞,肝细胞,脾脏边缘区和红髓中有 HSPA2 阳性反应,着色深浅不等,大部分阳性反应位于细胞质,细胞核阳性反应极少;而在睾丸曲精小管中生精细胞细胞质和细胞核中均有 HSPA2 阳性反应,着色深浅不等;阴性对照组未观察到阳性反应。根据积分光密度值比较得出,HSPA2 蛋白的阳性表达量在睾丸中最高,脑、肾脏、心脏、肺脏和肝脏次之,脾脏最少。【结论】通过基因水平和蛋白水平两个层面的研究,发现 HSPA2 在牦牛各组织器官中存在表达差异;睾丸中 HSPA2 基因和蛋白表达量均高于脑、肾脏、心脏、脾脏、肺脏和肝脏,提示 HSPA2 可能与睾丸的生殖功能密切相关。     

牦牛和犏牛睾丸组织DDX4基因mRNA表达水平 与启动子区甲基化

【目的】了解牦牛和犏牛睾丸组织中DDX4基因mRNA表达水平和启动子区甲基化状态。【方法】采用real-time PCR技术检测牦牛和犏牛睾丸组织DDX4基因mRNA表达水平,采用克隆测序技术获得牦牛和犏牛DDX4基因启动子区序列,采用亚硫酸氢钠测序法检测牦牛和犏牛睾丸组织中DDX4基因启动子区甲基化状态。【结果】牦牛睾丸组织中DDX4基因mRNA表达水平极显著高于犏牛（P＜0.01）;牦牛和犏牛DDX4基因启动子区1 370 bp,含有核心启动子区（251 bp）和CpG岛（918 bp）。犏牛睾丸组织中DDX4基因启动子区甲基化水平（86.5%）极显著高于牦牛（67.0%）（P＜0.01）。【结论】牦牛睾丸组织DDX4基因表达水平极显著高于犏牛,获得了牦牛和犏牛DDX4基因启动子区序列,且犏牛睾丸组织中DDX4基因启动子区甲基化水平极显著高于牦牛（P＜0.01）。     

平原黄牛和高原黄牛睾丸神经肽Y表达的比较观察

采用免疫组化SP法观察神经肽Y(neuropeptide Y,NPY)在平原黄牛和高原黄牛睾丸的分布特点,探索其在不同海拔黄牛睾丸组织的分布特征及其与生精功能的关系.结果表明:NPY主要表达在睾丸各级动脉血管周围或血管壁内,在睾丸白膜、间质结缔组织、睾丸小隔和曲细精管周围也有表达.在高原黄牛睾丸血管周围和血管壁内NPY的分布表现出明显的部位差异,头部和体部的表达明显比尾部高.NPY在高原黄牛各级生精细胞中为阳性表达,而在平原黄牛除了初级精母细胞外其他各级生精细胞为阳性表达.平原黄牛睾丸头、体、尾3部分NPY的分布无明显差异,高原黄牛睾丸头部和体部NPY的表达明显比尾部高.不同海拔条件下黄牛睾丸NPY阳性表达部位和分布密度具有一定的差异,提示肽能神经直接参与睾丸内血流调节,直接或间接影响睾丸雄激素生成和精子发生,对不同生活环境黄牛生殖生理的适应性调控具有重要的作用.