辽宁一例凡纳滨对虾大规模死亡的病原研究

为对辽宁省盘锦地区2014年出现的大规模死亡凡纳滨对虾Litopenaeus vannamei展开病原研究,对死虾进行了白斑综合征病毒(WSSV)、桃拉病毒(TSV)、传染性皮下及造血组织坏死病病毒(IHHNV)和嗜水气单胞菌Aeromonas hydrophila的分析鉴定,提取病虾鳃组织DNA/RNA后,以特异性引物进行WSSV、TSV和IHHNV病毒检测,通过16S r DNA测序及嗜水气单胞菌特异性引物和气溶素基因的双重PCR对分离菌株QD1进行分类鉴定,并对病虾的鳃、胃、肝胰腺和附肢进行了组织病理切片观察。结果表明:患病对虾WSSV和TSV检测呈阳性;菌株QD1为嗜水气单胞菌,其人工回归感染试验结果显示,分离菌株能使健康凡纳滨对虾致病死亡;组织病理学观察显示,病虾鳃及胃组织出现大量WSSV特征性的病变核,肝胰腺上皮细胞出现严重萎缩,肝胰腺管腔变大,部分肝细胞坏死,肝胰腺管之间结缔组织中血细胞明显增多。研究表明,此次凡纳滨对虾大量死亡为WSSV和TSV两种病毒与嗜水气单胞菌混合感染所致。     

辽宁一例凡纳滨对虾大规模死亡的病原研究

为对辽宁省盘锦地区2014年出现的大规模死亡凡纳滨对虾Litopenaeus vannamei展开病原研究,对死虾进行了白斑综合征病毒(WSSV)、桃拉病毒(TSV)、传染性皮下及造血组织坏死病病毒(IHHNV)和嗜水气单胞菌Aeromonas hydrophila的分析鉴定,提取病虾鳃组织DNA/RNA后,以特异性引物进行WSSV、TSV和IHHNV病毒检测,通过16S r DNA测序及嗜水气单胞菌特异性引物和气溶素基因的双重PCR对分离菌株QD1进行分类鉴定,并对病虾的鳃、胃、肝胰腺和附肢进行了组织病理切片观察。结果表明:患病对虾WSSV和TSV检测呈阳性;菌株QD1为嗜水气单胞菌,其人工回归感染试验结果显示,分离菌株能使健康凡纳滨对虾致病死亡;组织病理学观察显示,病虾鳃及胃组织出现大量WSSV特征性的病变核,肝胰腺上皮细胞出现严重萎缩,肝胰腺管腔变大,部分肝细胞坏死,肝胰腺管之间结缔组织中血细胞明显增多。研究表明,此次凡纳滨对虾大量死亡为WSSV和TSV两种病毒与嗜水气单胞菌混合感染所致。     

白斑综合征病毒在养殖克氏原螯虾中感染流行研究

2007年,在从南京采集的患病养殖克氏原螯虾样品超薄切片中发现大量类似对虾白斑综合征病毒(WSSV)颗粒,结合初步的流行病学调查、人工回感实验及PCR检测结果确定导致此次养殖克氏原螯虾大规模死亡的病原为WSSV。利用建立的特异性引物PCR方法,在江苏省内扬州邵伯湖、淮安白马湖、盱眙、南京禄口等多处养殖克氏原螯虾体内均检测到该病毒,且在鳃、心肌、神经、肝脏、肠道、肌肉等多处组织中被检出;未检测到另外两种常见对虾病毒:桃拉病毒(TSV)和传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)。     

对虾白斑综合征病毒射阳株的分离及其在螯虾体内的动态分布

从江苏射阳某对虾养殖场采集患白斑综合征的病死对虾，以对虾组织镁浆液接种克氏原螯虾并传至2代。结果螯虾全部发病死亡。用斑点杂交和单抗ELISA检测对虾和2代螯虾，均为白斑综合征病毒（WSSV）阳性，将此WSSV命名为射阳株，进一步用斑点杂交和单抗ELISA检测射阳株在肌注和口服感染螯虾体内的动态分布，并与青岛株的动态分布相比较。口服和肌注螯虾在感染后12h，病毒首先在血淋巴中检出，然后减少，36h后又明显检出，并增加至高峰然后减少；肠上皮、心脏、肌肉中的病毒在口服和肌注感染后36h同时出现并呈总体递增分布；此外，病毒在胃上皮、真皮和结缔组织中也有不同程度的分布。感染死亡螯虾各主要组织器官均可检出病毒；电镜观察死亡螯虾鳃、心脏、肝胰腺、直皮、卵巢等器官的超薄切片，均可见到典型的病毒粒子，显示死亡螯虾内病毒已形成周血感染。WSSV射阳株与青岛株在螯虾的动态分布具有相似性。     

安徽省克氏原螯虾白斑综合征病毒和虾虹彩病毒检测及分析

2020年检测安徽省滁州、安庆和合肥的20个稻田养殖的200只克氏原螯虾(Procambarus clarkii)鳃组织中白斑综合征病毒和虾虹彩病毒,结果发现白斑综合征病毒阳性检出率为97.5％,病毒含量达106拷贝/mg的检出率与克氏原螯虾死亡率呈正相关.虾虹彩病毒阳性检出率为13％,只在滁州的3个和合肥的2个稻田的养殖虾中检出.     

凡纳滨对虾3种主要病毒和虾肝肠胞虫在辽宁地区的流行情况分析

为解决近年来辽宁地区凡纳滨对虾Litopenaeus vannamei病害频发的问题,于2015年8月从辽宁省盘锦、营口地区26个发病的凡纳滨对虾养殖池塘中随机采集病虾样本,采用聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)检测对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)、对虾白斑综合征病毒(WSSV)和对虾桃拉综合征病毒(TSV),并用环介导等温扩增(Loop-Mediated Isothermal Amplication,LAMP)技术检测虾肝肠胞虫Enterocytozoon hepatopenaei(EHP)的感染情况。结果表明:IHHNV和EHP的检出率较高,分别为65.4%和34.6%,WSSV和TSV的检出率分别为19.2%和7.7%;EHP的检出率与对虾体型大小密切相关,在小虾样本中检出的阳性率高达100%,而大虾样本中均未检出;26份对虾样本中有7份样本同时携带EHP和IHHNV。研究表明,IHHNV和EHP是2015年8月辽宁地区凡纳滨对虾的主要流行病原,发病率可能与对虾生长缓慢、个体大小差异明显相关。     

珠三角凡纳滨对虾白斑综合征病毒检测

应用聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)检测技术对2012-2014年间广东省珠三角地区珠海、江门、中山三地养殖体系中凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)白斑综合征病毒(White Spot Syndrome Virus,WSSV)的携带情况进行了抽样调查。结果显示:白斑综合征在珠三角凡纳滨对虾主产区的不同地方和不同养殖月份中均有不同程度的流行;其中仔虾阶段WSSV携带率显著高于幼虾和成虾(P0.05)。     

一种改进的对虾白斑综合征病毒提纯方法

对虾白斑综合征病毒(WSSV)的囊膜蛋白在提纯的过程中易脱落,用传统的密度梯度离心方法不易获得完整的病毒粒子,对传统的蔗糖密度梯度离心方法加以改进后,可以获得大量完整的病毒粒子.用患白斑综合征病毒病的中国对虾鳃制备WSSV粗提液,感染螯虾(Cambarus proclarkii),选取25%的蔗糖溶液用作病虾鳃的匀浆液,然后经蔗糖密度梯度离心,分取各带负染后电镜观察,大量完整的病毒位于46% ～52% 蔗糖梯度之间,病毒粒子末端带有很长的尾;而病毒裸露的核衣壳位于40%～46%蔗糖梯度之间;在57%～62%之间观察到较多完整病毒粒子和少量细菌.实验结果表明改进的病毒提纯方法较好,可得到大量完整的带嚢膜的病毒颗粒.     

实时定量PCR快速检测对虾白斑综合症病毒

根据对虾白斑综合症病毒(White Spot Syndrome Virus,WSSV)的保守序列,利用Primer Express2.0软件设计引物和Taqman探针,建立了WSSV的实时定量PCR检测体系.构建含有WSSV目的扩增片段的质粒为标准品,进行定量PCR扩增,结果表明标准品浓度在1.5×107～1.5×101个拷贝之间有"S"型扩增曲线,检测限为15个拷贝.标准曲线中模板浓度(X)与Ct值的关系为:Ct=-3.77 lgX+43.73,相关系数R2=0.9967.该检测方法特异性强,对传染性皮下和造血器官坏死病毒(IHHNV)、斑节对虾杆状病毒(MBV)、肝胰腺细小病毒(HPV)以及对虾基因组DNA没有扩增反应.运用该方法对100尾对虾样品进行检测,14个对虾样品为阳性.而运用巢式PCR检测只有4个对虾样品为阳性.实时定量PCR方法检测WSSV,快速、特异、灵敏,在虾病的临床检测上具有重要意义.     

克氏原螯虾WSD的PCR诊断及组织病理损伤研究

【目的】近年来白斑综合症病毒(WSSV)严重威胁着克氏原螯虾(Procambarus clarkii)的健康养殖,本研究旨在确定一例克氏原螯虾暴发性死亡的病因。【方法】对患病虾进行临床症状观察,取其鳃、心脏、肝胰腺、肠道、肌肉、眼睛等组织分别进行套氏PCR检测和组织病理学观察。【结果】患病虾临床剖解特征表现为肠段中空无食物,肠壁透明,肠管较细;套氏PCR结果显示患病虾体内WSSV呈阳性;PCR产物测序并进行系统发育树分析显示,该基因序列与WSSV的核苷酸序列同源性为100%,进一步证实本次患病克氏原螯虾体内携带WSSV。病理组织切片显示,该病靶器官主要为肝胰腺、心脏、鳃、肠道,患病虾均表现为中度至重度坏死性肝胰腺炎、中度充血性鳃炎、中度坏死性心肌炎、以及轻度肠炎,肌肉组织未发现明显病变。【结论】推断造成本次克氏原螯虾大量死亡的原因为WSSV感染。     

多重RT-PCR方法在凡纳滨对虾病毒检测中的应用

病毒检测在预防和控制对虾病毒性疫病实践中具有重要的作用和意义.为了提高对虾病毒检测的快速性和简便性,建立了一种可同时检测6种对虾病毒的RT-PCR方法,并利用该方法对来自广西沿海地区的130份病虾样品中的黄头病毒(YHV)、白斑综合征病毒(WSSV)、桃拉病毒(TSV)、肝胰腺坏死病毒(HPV)、传染性皮下组织坏死病毒(IHHNV)以及杆状病毒(MBV)进行了检测.检测结果:白斑综合征病毒发病率最高,检出率高达73.8 %;传染性皮下组织坏死病毒发病率为18.5 %;桃拉病毒检出率为3.1 %;未检出黄头病毒、肝胰腺坏死病毒和杆状病毒.该RT-PCR方法扩增得到的片段经测序,结果与标准毒株的核酸数据高度吻合.实践证明,该实验建立的RT-PCR方法具有高度的准确性,与其他检测方法相比具有快速、简便的特点,在对虾病毒检疫、流行病学调查等方面具有重要的应用价值.     

3种来源的野生斑节对虾携带病毒情况调查

利用PCR方法,对2008年取自3个斑节对虾主产地（中国、泰国、非洲）的野生斑节对虾亲虾进行主要病毒病筛查。在所检测的210例野生亲虾样本中,均发现携带白斑综合征病毒（WSSV）、传染性皮下及造血组织坏死病毒（IHHNV）或斑节对虾杆状病毒（MBV）的阳性样本,其中泰国来源的斑节对虾亲虾WSSV携带率最高,达到89.8%,而中国来源的斑节对虾亲虾IHHNV携带率最高,为8.8%。12例样本同时检测出WSSV和IHHNV（阳性率为5.7%）。该结果揭示3种来源的斑节对虾亲虾普遍携带WSSV和IHHNV,其中WSSV仍然是感染斑节对虾的主要病原。调查结果增进了对斑节对虾主产区野生亲虾健康状况的了解,并在一定程度上揭示了WSSV感染的新规律。     

凡纳滨对虾Toll受体和溶菌酶mRNA组织表达的差异研究

采用荧光定量PCR技术,检测了凡纳滨对虾不同组织(血淋巴、鳃、肌肉和肝胰腺)中Toll受体和溶菌酶mRNA的相对表达量。结果表明:凡纳滨对虾Toll受体和溶菌酶mRNA在不同组织间的表达量存在显著差异。Toll受体mRNA在各组织中的相对表达水平由高到低顺序依次为血淋巴>鳃>肌肉>肝胰腺。溶菌酶mRNA表达水平则依次为血淋巴>鳃>肌肉>肝胰腺,但血淋巴和鳃之间无显著差异。溶菌酶mRNA和Toll mRNA表达量重复测定间的变异度在血淋巴和鳃组织间无显著差异。表明鳃和血淋巴是检测凡纳滨对虾Toll受体和溶菌酶mRNA的相对表达量的理想实验材料。研究亮点:Toll受体能够将异物入侵的信号从细胞外传递到细胞内并引起胞内信号级联反应产生各种免疫效益因子,因此其表达水平一定程度上可以反映对虾对病原入侵的灵敏性。溶菌酶活性是评判对虾免疫抗菌能力的重要指标。研究Toll受体和溶菌酶基因表达的组织差异性,可以为后续开展对虾营养免疫学研究中免疫相关基因检测时实验材料的选取提供理论基础。     

凡纳滨对虾ATG6基因克隆及其在WSSV感染中的表达

[目的]克隆获得凡纳滨对虾自噬相关基因Lv ATG6 cDNA全长,揭示其组织表达特征及其在白斑综合症病毒(WSSV)感染后的表达变化。[方法]利用PCR方法克隆Lv ATG6,半定量PCR方法检测Lv ATG6在对虾10种组织中的表达情况及WSSV侵染后Lv ATG6在对虾鳃和肝胰脏2种组织中的基因表达变化。[结果]克隆获得Lv ATG6 cDNA全长1 275 bp,编码424个氨基酸,预测蛋白分子量大小为51.5 k D;Lv ATG6基因在凡纳滨对虾10种组织中均有表达,无组织表达特异性;Lv ATG6在病毒感染不同时间的对虾鳃和肝胰脏组织中均出现明显的表达变化。[结论]凡纳滨对虾Lv ATG6及参与的细胞自噬可能在WSSV病毒感染增殖过程中发挥了重要作用,该研究为深入揭示凡纳滨对虾细胞自噬与WSSV病毒作用关系奠定了基础。     

凡纳对虾白斑综合征病毒的检测和预防

20世纪 90年代以来 ,日本、泰国、中国等许多亚洲国家和地区因虾病流行 ,对虾养殖产量锐减 ,造成重大经济损失。其中危害最严重的就是白斑综合征 (ｗｈｉｔｅｓｐｏｔｓｙｎｄｒｏｍｅ ,ＷＳＳ) ,其病原体为白斑综合征病毒 (ｗｈｉｔｅｓｐｏｔｓｙｎｄｒｏｍｅｖｉｒｕｓ ,ＷＳＳＶ) [1 - 3] 。 1 993年 5 - 8月 ,我国沿海从南到北对虾养殖场发生了大面积的对虾爆发性流行病 ,损失非常严重[4,5] 。关于ＷＳＳ的研究已成为近年来国内外水产养殖病害研究的热点[6- 1 2 ] 。随着ＷＳＳＶ研究的深入 ,有关ＷＳＳ的病原、病理、诊断方法、检测技…     

凡纳对虾白斑综合征病毒的检测和预防

20世纪 90年代以来 ,日本、泰国、中国等许多亚洲国家和地区因虾病流行 ,对虾养殖产量锐减 ,造成重大经济损失。其中危害最严重的就是白斑综合征 (ｗｈｉｔｅｓｐｏｔｓｙｎｄｒｏｍｅ ,ＷＳＳ) ,其病原体为白斑综合征病毒 (ｗｈｉｔｅｓｐｏｔｓｙｎｄｒｏｍｅｖｉｒｕｓ ,ＷＳＳＶ) [1 - 3] 。 1 993年 5 - 8月 ,我国沿海从南到北对虾养殖场发生了大面积的对虾爆发性流行病 ,损失非常严重[4,5] 。关于ＷＳＳ的研究已成为近年来国内外水产养殖病害研究的热点[6- 1 2 ] 。随着ＷＳＳＶ研究的深入 ,有关ＷＳＳ的病原、病理、诊断方法、检测技…     

乌鳢不同组织DNA提取研究

[目的]研究乌鳢的肌肉、肝脏、肾脏、尾鳍、鳞片、肠、鳃盖、鳃等组织的DNA提取。[方法]利用酚-氯仿法提取乌鳢的肌肉、肝脏、肾脏、尾鳍、鳞片、肠、鳃盖、鳃等组织的DNA,采用紫外分光光度计法、琼脂糖凝胶电泳法和PCR扩增法检测提取的DNA质量。[结果]结果表明,不同组织的DNA含量不同(0.370~0.975μg/μL),其中肌肉、肝脏、肾脏和肠等组织DNA质量较高,而尾鳍、鳞片、鳃和鳃盖等组织DNA质量较差。[结论]乌鳢的肌肉、肝脏、肾脏和肠等组织提取的DNA可用于后续的分子生物学研究。     

中国对虾与日本对虾对白斑综合征病毒耐受力的比较

[目的]比较中国对虾与日本对虾对白斑综合征病毒的耐受力,为WSSV的病害防治提供参考。[方法]在盐度30‰和(24±2)℃下,将体长约8~9 cm的中国对虾(Fenneropenaeus chinensi)与日本对虾(Marsupenaeus japonicus)停食48 h后,投喂感染白斑综合征病毒(WSSV)的死亡对虾,观察其摄食及感染情况,比较这2种虾的对WSSV耐受力。[结果]中国对虾的平均死亡率为63.33%,发病高峰期为4~5 d,而日本对虾的平均死亡率为54.44%,发病高峰期为5~7 d,中国对虾的发病率于日本对虾,发病时间也较日本对虾早。[结论]中国对虾对WSSV的耐受能力要强于日本对虾。     

亚硝基氮胁迫下WSSV对凡纳滨对虾致病性研究

为评价养殖水环境中亚硝基氮(NO_2~--N)对凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)危害性,开展NO_2~--N胁迫对凡纳滨对虾感染白斑综合征病毒(WSSV)后的死亡率、WSSV在患病对虾体内增殖速率和对虾主要免疫相关酶活性影响研究。试验设置NO_2~--N胁迫浓度为6.68 mg·L~(-1),分别注射10~(-4)和10~(-5)稀释度的WSSV提取液,结果显示,胁迫下感染10-4WSSV的凡纳滨对虾144 h死亡率达90.00%,显著高于无胁迫组(60.00%),相同试验条件下高浓度病毒感染组死亡率高于低浓度组。对虾鳃组织WSSV荧光定量PCR检测结果显示,NO_2~--N胁迫下凡纳滨对虾鳃组织内WSSV增殖加快,感染48 h后10-4攻毒浓度胁迫组病毒量是无胁迫组1.33倍,72 h时病毒量达到无胁迫组2.00倍。此外,免疫相关酶活性结果显示,NO_2~--N浓度突变导致对虾血清中酚氧化酶(PO)、酸性磷酸酶(ACP)、碱性磷酸酶(AKP)活性先升后降。由此可见,NO_2~--N胁迫会加快WSSV在患病凡纳滨对虾体内增殖,导致高死亡率,这可能是胁迫造成对虾免疫相关酶活性降低和抗病原感染能力下降所致。     

中华绒螯蟹白斑症病毒病的诊断

[目的]对江苏省吴中地区养殖池塘患病的中华绒螯蟹进行诊断。[方法]结合临床流行病学调查和分子生物学鉴定,对江苏省吴中地区发病的中华绒螯蟹进行实验室检测与鉴定。参考Gen Bank中白斑症病毒(WSSV)的基因序列设计1对特异性引物,以从中华绒螯蟹的鳃、肝胰腺、肌肉等组织提取的DNA为模板,进行PCR扩增。[结果]经过解剖观察,发现病蟹内脏器官无明显变化。从病蟹的肝胰腺和肌肉中未分离到致病菌。通过PCR扩增,均能扩增出预期大小的特异性产物,测序比对显示扩增条带的基因序列与WSSV的基因序列同源性高达99.6%。病理切片显示鳃和肝胰腺可见大量细胞核肿大细胞,与WSSV引起对虾组织的病变相一致。[结论]经初步诊断,确定引起中华绒螯蟹发病死亡的病原为WSSV。