培养基中几种重要营养元素对Anabaena sp. strain PCC 7120及Synechocystis sp. strain PCC 6803生长的影响

配制KNO3、KHCO3、NaHCO3、FeNa2-EDTA及Na2s2 O3营养盐培养液,并按一定浓度添加至液体或固体培养基中,获得含有不同营养素、不同浓度的液体及固体培养基,检测无机氮(NO3-)、无机碳(HCO3-)、Fe及Na2S2O3对集胞蓝细菌Synechocystis sp.strain PCC 6803和鱼腥蓝细菌Anabaena sp.strain PCC 7120细胞生长的影响.结果显示,集胞蓝细菌Synechocystis sp.strain PCC 6803在10 mmol/L硝酸盐生长较好,鱼腥蓝细菌Anabaena sp.strain PCC 7120在2 mmol/L硝酸盐生长较好.不同浓度KHCO3及NaHCO3都会对蓝细菌的生长产生影响,可能是因为盐离子发挥了主要作用.此外,2种蓝细菌在10 mmol/L Na2S2O3中生长较好,不同浓度的铁盐对蓝细菌的生长产生较大影响,在10μmol/L铁盐中生长最佳.     

集胞蓝细菌PCC 6803中CcmK2蛋白多克隆抗体的制备与检测

CcmK2蛋白是集胞蓝细菌PCC 6803羧酶体外壳蛋白的主要组分,在羧酶体的组装与功能行使方面扮演重要角色。为解析其功能,本研究构建了原核表达载体pET28a-CcmK2,并在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达带有6个组氨酸标签的CcmK2重组蛋白。通过金属亲和层析技术,将CcmK2重组蛋白纯化后免疫家兔,制备抗CcmK2多克隆抗体。基于Dot blot分析的结果显示:该多克隆抗体能够有效检测蓝细菌CcmK2蛋白;进一步的抗体特异性分析显示,CcmK2多克隆抗体与其他羧酶体外壳蛋白存在微弱的抗原抗体反应;最后,通过Western blot分析证实该多克隆抗体能够特异而灵敏地检测集胞蓝细菌PCC 6803中CcmK2的丰度。     

大熊猫核糖体蛋白S17亚基基因（rps17）的克隆及序列分析

RPS17蛋白是核糖体40S亚基的组成部分,由rps17基因编码.为了解大熊猫核糖体蛋白亚基rps17基因的结构特点及其与已报道的人和其他哺乳动物核糖体蛋白亚基rps17基因的异同,分别运用RT-PCR和PCR技术,从大熊猫肌肉组织的mRNA中成功克隆了核糖体蛋白亚基S17基因的cDNA序列以及从总DNA中成功克隆了S17基因的结构基因序列.序列分析发现,大熊猫核糖体蛋白亚基S17基因的表达序列长为457bp,开放阅读框(ORF)为408bp,编码135个氨基酸的蛋白质.结构基因序列长2 368bp,含有4个外显子和3个内含子.拓扑预测显示,核糖体蛋白亚基RPS17的相对分子质量为15.52×103,PI为10.26,含有5个类型的功能位点,即:5个蛋白激酶C磷酸化位点,1个酪蛋白激酶II磷酸化位点,1个酪氨酸激酶磷酸化位点,1个N-豆蔻酰化位点及1个核糖体蛋白S17Esignature位点.进一步分析发现,该基因的表达序列及其编码的氨基酸序列与已报道的部分哺乳动物有很高的相似性,其蛋白质的高级结构除褐家鼠外与其它物种也具有一致性.对大熊猫rps17基因及其表达的蛋白质结构的比较研究,旨在丰富和完善哺乳动物r...     

鸡大肠杆菌对氨基糖苷类药物高水平耐药的16S rRNA甲基化酶检测

为了解河南地区鸡源大肠杆菌对氨基糖苷类药物高水平耐药的16S rRNA甲基化酶的流行情况,对2005～2008年在河南地区病鸡的病料中分离保存的429株大肠杆菌进行药敏试验,并分别设计特异性引物对其进行16S rRNA甲基化酶基因的聚合酶链式反应扩增.检测结果显示,在6种氨基糖苷类药物高水平耐药的16S rRNA甲基化酶基因中,仅检测出ArmA和RmtB,检出率分别为20.7%(89/429)和23.3%(100/429).且随时间的推移,ArmA和RmtB的出现几乎是逐年增高.提示河南地区鸡大肠杆菌对氨基糖苷类药物高水平耐药的16S rRNA甲基化酶产生率较高,且以ArmA和RmtB为主.     

集胞藻PCC6803中α-酮戊二酸脱羧酶的原核表达分析

【目的】α-酮戊二酸脱羧酶(α-ketoglutaric acid decarboxylase,α-KGD)是蓝细菌三羧酸循环途径中的一个关键酶。试验旨在优化集胞藻PCC6803中sll1981基因编码蛋白的原核表达方法,并对不同表达方法获得的重组sll1981蛋白进行活性测定。【方法】利用分子生物学技术构建含有sll1981基因的多种表达载体,通过SDSPAGE分析这些表达载体在大肠杆菌表达系统中的表达和可溶性情况,利用Ni-NTA亲和层析分离纯化重组sll1981蛋白,然后通过酶偶联法测定重组sll1981蛋白的催化活性。【结果】含有sll1981基因的不同表达载体在大肠杆菌表达系统中的表达良好,然而重组sll1981蛋白的可溶性和催化活性差异较大。【结论】当pET28bsll1981质粒与pTf16分子伴侣质粒在大肠杆菌中共表达时重组sll1981蛋白的可溶性和催化活性均为最佳。酶动力学测试表明集胞藻PCC6803中sll1981基因编码蛋白具有α-酮戊二酸脱羧酶功能。为进一步研究α-酮戊二酸脱羧酶的结构功能关系及催化机制提供重要基础。     

3种蓝细菌藻蓝蛋白β亚基脱辅基蛋白基因的克隆、表达及重组蛋白的抗氧化活性

为研究蓝细菌藻蓝蛋白脱辅基蛋白的抗氧化活性,分别从3种蓝细菌Spirulina subsalsa、Mastigocladus laminosus和Nostoc PCC 7120中克隆C-藻蓝蛋白β亚基编码基因cpcB_(Sp)、cpcB_(Ma)和cpcB_(No),在大肠杆菌中表达,获得了重组蛋白CpcB_(Sp)、CpcB_(Ma)和CpcB_(No)。通过测定其对羟基自由基和DPPH自由基的清除率,比较它们的抗氧化活性。结果显示:3种重组蛋白对羟基自由基和DPPH自由基的清除率都随着蛋白质质量浓度的增加而升高。当蛋白质浓度达到250 mg/L时,CpcB_(Sp)、CpcB_(Ma)和CpcB_(No)对羟基自由基的清除率分别为82%、89%和93%,对DPPH自由基的清除率分别为43%、49%和58%。以上结果表明,3种重组藻蓝蛋白脱辅基蛋白都具有较高的抗氧化活性,有潜力作为医疗上使用的抗氧化试剂,不同蓝细菌的同源藻蓝蛋白的抗氧化能力存在一定差异,选择不同蓝细菌的藻蓝蛋白是提高重组藻蓝蛋白抗氧化能力的有效途径。     

鸭LEPR基因结构和功能的生物信息学分析

以鸭瘦素受体(LEPR)基因为研究对象,运用生物信息学方法对鸭等10种动物的LEPR蛋白进行多序列比对分析、分子进化分析及蛋白质结构分析,并预测LEPR蛋白的理化性质、疏水性等基本性质。结果表明：鸭LEPR蛋白预测为不稳定的亲水性蛋白质,不含信号肽,为非分泌型蛋白质,定位在细胞质膜上,与其生物学功能相符。鸭LEPR蛋白还含有132个潜在磷酸化位点、10个N型糖基化位点和6个O型糖基化修饰位点。进化关系分析表明,鸭LEPR基因与同为水禽的黑天鹅进化关系最近,具有较高的同源性。这一研究为进一步研究鸭LEPR基因及其编码的蛋白质结构和功能提供了参考。     

大熊猫AP2S1基因cDNA 克隆及分析

该研究运用RT-PCR技术,首次从大熊猫Ailuropoda melanoleuca的肌肉组织总RNA中成功克隆了AP2S1基因的编码序列,并对其进行了全面分析.结果表明:大熊猫AP2S1基因编码序列克隆片段全长为512bp,开放阅读框(ORF)为429bp,编码142个氨基酸的蛋白质,该蛋白的相对分子质量为1.7×104,等电点pI为5.82,含有4种类型共5个功能位点,即1个蛋白激酶C磷酸化位点、2个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点、1个N-酰基化位点和1个网格蛋白调节素小肽链标签;且该蛋白在哺乳动物网状细胞中的半寿期(half-life)大于30h,不稳定指数(in-stability index)为26.99,属于稳定蛋白.进一步分析发现,大熊猫AP2S1基因与已报道的人、苏门答腊猩猩、牛、褐家鼠和小家鼠5个哺乳动物物种的编码序列及其编码的氨基酸序列具有很高的相似性,表明该基因及其编码蛋白在物种漫长的进化过程中极其保守.     

Synechocystis sp. strain PCC 6803定量PCR模板制备方法的改进

以Synechocystis sp.strain PCC 6803为实验菌株,设计改良制备定量PCR模板的方法;同时,对Synechocystis sp.strain PCC 6803总RNA的Trizol抽提法进行优化.结果显示,利用改良方法抽提得到的RNA结构更完整;同时,利用改良方法制备的模板可以用于后续定量PCR实验;其中,只有高表达量基因适用于半定量PCR,低表达量基因则需要实时荧光定量PCR检测.     

MreB在鱼腥蓝细菌PCC 7120细胞分裂过程中的功能

为研究Anabaena sp. PCC 7120中的细胞形态决定蛋白MreB的亚细胞定位和功能,构建了由mreB自身启动子驱动的mreB-gfp融合载体,通过接合转移的方法将其转化到野生型Anabaena sp. PCC 7120中,获得绿色荧光蛋白标记的MreB的鱼腥蓝细菌菌株,同时用MreB的抑制剂A22处理菌株。结果显示,MreB的亚细胞定位随着细胞周期的进程而发生变化,A22处理可导致MreB无法正确聚合定位。     

鱼腥蓝细菌PCC 7120中可控降解系统的构建

鱼腥蓝细菌PCC 7120中已有较为成熟的诱导表达系统,但缺乏可控的蛋白降解系统。本研究基于Mesoplasma florum中的Lon蛋白酶(mf-Lon),在蓝细菌中建立可诱导的蛋白降解系统,并通过该系统对关键基因编码产物进行可控降解以研究其生理功能。结果发现降解系统并无预期作用,需进一步改进。     

藻蓝蛋白α亚基裂合酶的分子克隆和酶动力学研究

为了比较研究不同藻种中藻蓝蛋白裂合酶CpcE/F的结构与功能的差异,对Anabaena sp.PCC 7120中的CpcE/F进行克隆,并进行大量表达,将表达的裂合酶CpcE/F用于藻蓝胆素(PCB)与Mastigocladus laminosus PCC 7603藻蓝蛋白α-亚基(α-PC)脱辅基蛋白(CpcA)的体外重组,得到天然活性的α-PC,从而表明CpcE/F所编码的蛋白质是α-PC生物合成的裂合酶,并对CpcE/F的酶动力学进行了初步研究。     

白斑综合征病毒(WSSV)基因VP28原核表达与检测

VP28是对虾白斑综合征病毒(White Spot Syndrome Virus,WSSV)的囊膜蛋白.将VP28基因序列密码子优化后合成,经限制性内切酶NdeⅠ、Xho Ⅰ酶切后,按正确的阅读框顺序插入到pET-28a(+)表达载体上.重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),经质粒双酶切、测序鉴定后成功地构建了VP28基因原核表达载体pET-28a-VP28.转化菌经IPTG诱导,SDS-PAGE显示含有与预期大小一致的约30 ku蛋白带,主要以包涵体形式表达.采用Ni-IDA-Sepharose CL-6B亲和层析柱对重组蛋白进行纯化,获得了纯度为95％的大肠杆菌重组蛋白VP28.该纯化蛋白作为绝对定量Western的标准品,梯度稀释建立标准曲线,以定量检测转基因鱼腥藻7120中的VP28绝对表达量.实验结果表明,大肠杆菌BL21(DE3)表达的重组蛋白VP28与鱼腥藻7120中表达的VP28分子量基本相同,纯化后的大肠杆菌重组蛋白梯度稀释作为绝对定量Western标准曲线,计算出转基因鱼腥藻7120在培养第17天时,VP28的表达量最大,为5.14 μg/mL,占转基因鱼腥藻7120总蛋白浓度的1.45％.这不仅对转基因鱼腥藻的高效培养具有重要意义,也为日后确定投喂对虾口服疫苗有效剂量防治白斑综合征奠定了基础.     

生防菌bio-2菌株对家禽病原菌的抑制作用

采用纸片药敏试验法,分别测定了不同稀释度生防菌bio-2菌株无菌滤液对分离自家禽的大肠杆菌、沙门氏菌和葡萄球菌等3种病原菌的抑菌作用。结果表明,生防菌bio-2菌株无菌滤液原液、1∶2、1∶4、1∶8、1∶16和1∶32倍稀释液对沙门氏菌、大肠杆菌和葡萄球菌均具有很好的抑菌作用,其中对沙门氏菌的抑菌效果最好(抑菌圈直径17.67~23.78 mm),对葡萄球菌的抑制效果次之(抑菌圈直径14.90~19.73 mm),对大肠杆菌的抑菌效果稍差(抑菌圈直径11.64~16.72 mm)。     

集胞藻酰基载体蛋白基因过量表达对脂肪酸合成的影响

酰基载体蛋白(ACP)是微生物脂肪酸生物合成途径中的一个关键蛋白。为了促进集胞藻脂肪酸的积累,以集胞藻PCC6803为研究对象,成功构建了用于过量表达ACP(ssl2084)基因的同源重组质粒ssl2084⁽⁺⁾并在集胞藻PCC6803中进行转化。将ssl2084⁽⁺⁾突变株进行DNA水平和蛋白质水平鉴定,结果表明,ssl2084基因已经得到过量表达。利用气相色谱—质谱联用技术(GC-MS)对突变藻株在不同温度下脂肪酸的含量及组分进行检测,发现在30 ℃培养条件下ssl2084⁽⁺⁾突变株中C12:0、C16:0和C18:0的含量显著增加,分别为1.50、8.74和0.60 mg·g^-1,与野生型相比分别增加了54.71%、50.82%和155.86%;在20 ℃低温胁迫培养条件下,C12:0、C16:0和C18:0的含量分别达到1.70、11.85和2.31 mg·g^-1,与野生型相比分别增加了31.94%、47.35%和39.90%。以上结果表明,在集胞藻PCC6803中过表达ssl2084基因能提高集胞藻中的中长链脂肪酸的含量,低温条件使得集胞藻中的中长链脂肪酸的含量进一步提高。     

缢蛏致病菌假单胞菌的分子生物学分析

从患病缢蛏（Sinvnovacula constricta）中分离到一株病原菌,命名为1#菌株。采用传统方法提取菌株DNA,PCR扩增其16SrDNA基因片段、测序,得到该菌基因片段序列长度为1438bp。用MegAlign软件进行比对5种不同种细菌基因序列,构建进化树。16SrDNA产物序列分析结果表明：该菌株的16SrDNA的核苷酸序列与多株假单胞菌（Pseudomonas sp）的同源性为99％,在系统发育树上构成一个分支。在细菌系统发育分类学上,该菌株属于假单胞属,但与已定名的假单胞菌有一定的差异,与几种未定名的假单胞菌的亲缘关系最接近。对其分类地位的最后确定还需进一步的系统发育学分析。     

16SrDNA对四种常见细菌中的鉴定与应用

本实验利用16SrDNA序列分析技术,对来自犊牛腹泻粪便中的四株菌（A菌,B菌,C菌,D菌）进行菌种鉴定。使用16SrDNA通用引物,通过PCR扩增分别得到1500bp,与GenBank中序列进行比对。结果表明：A菌与肠杆菌属、B菌与短小芽孢杆菌、C菌与大肠杆菌、D菌与变形杆菌的同源性最高,相似率均达到了99％,初步确定A菌为肠杆菌属、B菌为短小芽孢杆菌、C菌为大肠杆菌、D菌为变形杆菌。本试验的目的是为16SrDNA在临床细菌的鉴定提供客观理论依据。     

中华根瘤菌NL的筛选与鉴定

从吉林某菜园土样中筛选到菌株NL,用该菌对伊利石进行浸矿脱硅试验,测得接种NL的溶液中的可溶性硅的浓度比对照液中的增67.83%,说明该菌能促进伊利石中硅的溶解.从菌株NL的培养特征、形态大小、生理生化测试和16S rDNA序列的比对分析等方面进行了鉴定,其16S rDNA序列与GenBank中的中华根瘤菌属Sinorhizobium sp.S1-5(AY505134)的相似性达99.62%.试验结果表明菌株NL属于中华根瘤菌(Sinorhizobium).     

缺刻缘绿藻Δ15脂肪酸去饱和酶的功能分析

缺刻缘绿藻（Myrmecia incisa Reisigl）是一种富含多不饱和脂肪酸的球形单细胞淡水绿藻。在脂肪酸合成途径中,脂肪酸去饱和酶与脂肪酸酰基结合载体结合进行脂肪酸去饱和反应。为探究与缺刻缘绿藻中?15脂肪酸去饱和酶（fatty acid desaturase,FAD）结合的脂肪酸酰基结合载体,选用酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）INVSc1和聚球藻（Synechococcus sp.）PCC7942分别验证?15 FAD与酰基辅酶A（酰基-CoA）或酰基载体蛋白（酰基-ACP）结合的脂肪酸去饱和过程。根据缺刻缘绿藻的?15 FAD基因构建双源表达载体pYES2-?15 FAD和pCAMBIA1300-?15 FAD,通过电穿孔法将重组表达质粒分别转入酿酒酵母INVSc1和聚球藻PCC7942中,筛选得到转基因菌株。取相同细胞数的转基因酵母和转基因聚球藻,培养时分别添加等量的底物亚油酸（linoleic acid,18:2?9,12,LA）,以LA作为酰基受体,使其进入转基因酵母和转基因聚球藻的生物合成途径中,培养36-72 h。利用气相色谱-质谱联用系统对总脂肪酸的各组分进行分析,结果显示,在转基因实验组中检测到LA和?-亚麻酸（?-linolenic acid,18:3?9,12,15 ,ALA）的存在,空白实验则未检测出相应的产物。通过计算,转基因酵母催化LA生成ALA的效率29.31%,转基因聚球藻催化底物LA生成ALA的效率为30.86%。根据结果证明无论是酰基-ACP还是酰基-CoA,与缺刻缘绿藻中的?15 FAD结合进行反应的效率相近,不存在偏好性,由于?15 FAD是特异性蛋白,因此证明缺刻缘绿藻中的?15 FAD属于脂酰基结合蛋白。