红麻谷胱甘肽还原酶基因(HcGR)的克隆及盐胁迫下表达分析

[目的]克隆红麻谷胱甘肽还原酶基因(HcGR)并分析其组织表达特性及不同盐胁迫下的表达模式,为深入研究HcGR基因在响应盐胁迫的分子调控机制提供理论参考.[方法]基于红麻转录组测序结果,克隆HcGR基因,对其序列进行生物信息学分析,并利用实时荧光定量PCR检测HcGR基因在红麻不同组织及不同盐度胁迫[CK(0 mmol/L NaCl)、T1(50 mmol/L NaCl)、T2(100 mmol/L NaCl)和T3(200 mmol/L NaCl)]下的表达情况.[结果]克隆获得的HcGR基因开放阅读(ORF)长度为1698 bp,其编码蛋白相对分子量为60 kD,由555个氨基酸残基组成,理论等电点(pI)为8.46,为亲水性蛋白,定位于叶绿体;HcGR蛋白二级结构以无规则卷曲为主,以α-螺旋、延伸链和β-转角为辅,所占比例分别为44.14%、27.75%、22.16%和5.95%,其三级结构由无规则卷曲、α-螺旋和延伸链3种结构元件相互盘绕而成;该蛋白与榴莲GR蛋白亲缘关系较近.HcGR基因在红麻根、茎和叶中均有表达,且相对表达量存在显著差异(P<0.05,下同),相对表达量排序为叶>根>茎,表明HcGR基因具有明显的组织表达特异性.在红麻的根和叶中,HcGR基因相对表达量随NaCl胁迫浓度增加整体上呈先升高后降低的变化趋势,且均在T1处理下达峰值,显著高于CK、T2和T3处理.HcGR基因在茎中的相对表达量随NaCl胁迫浓度增加呈波动变化趋势,但T1、T2和T3处理均高于CK,其中T1和T3处理显著高于CK.[结论]HcGR基因在红麻根、茎和叶中的表达具有明显组织特异性,且可被不同浓度NaCl诱导响应盐胁迫信号,并通过上调各组织中的转录水平以提高抗盐胁迫能力,故推测该基因在红麻抗盐胁迫机制中发挥重要调控作用.     

木薯MeGWD3基因克隆及植物表达载体构建

[目的]克隆木薯葡聚糖水合双激酶(MeGWD3)基因并构建其植物表达载体,为开展木薯MeGWD3基因调控及功能研究提供参考.[方法]采用RT-PCR从木薯华南124(SC124)中克隆MeGWD3基因,对其进行序列分析,并将其连接至改造的pCAMBIA2300载体,构建植物表达载体pCAMBIA2300-MeGWD3.[结果]MeGWD3基因全长3522 bp,编码1173个氨基酸.经序列比对,发现MeGWD3基因序列与木薯Phytozome数据库中公布的GWD基因(cassava4.1_000497m)只存在2个碱基差异,同源性高达99.94%;与NCBI数据库中收录的木薯GWD基因(JN618460)同源性高达99.00%,与蓖麻GWD基因(XM 002518566)同源性达86.00%;成功构建植物表达载体pCAMBIA2300-MeGWD3.[结论]成功构建的植物表达载体pCAMBIA2300可用于MeGWD3基因功能及木薯淀粉代谢研究.     

盐生植物灰绿藜对NaCl和NaHCO3胁迫的生理响应

[目的]应对日益严重的土壤盐渍化问题,开发新的具有生态效益和经济价值的盐生植物.[方法]以具经济价值的新疆盐生植物灰绿藜为材料,采用分光光度法测定了不同浓度NaCl和NaHCO3胁迫后植株的日相对生长率(RGR)、丙二醛(MDA)、多种渗调质、抗氧化剂含量变化及几种重要的抗氧化酶活力变化,探讨了其对盐碱胁迫生理响应机制的差异性.[结果](1)在0～300 mmol/L,NaCl对植株生长的抑制作用较小,300 mmol/L NaHCO3对植株生长产生了一定程度的抑制;(2)150和300 mmol/L NaCl和NaHCO3处理后植株叶片丙二醛含量均显著增加;叶片超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)活力均无显著变化;抗氧化剂ASA显著升高.(3)随盐碱处理浓度增加,叶片脯氨酸(Pro)、甜菜碱(BADH)、可溶性糖含量显著升高,其中脯氨酸在较高浓度NaCl处理下升高幅度显著高于相同浓度的NaHCO3.[结论]植株体内抗氧化剂和渗调质ASA和脯氨酸Pro积累的差异可能是造成灰绿藜对高浓度盐碱胁迫耐受差异的原因之一.     

羽衣甘蓝BoRACK1基因克隆、亚细胞定位及表达分析

[目的]克隆羽衣甘蓝蛋白激酶C1受体(RACK1)基因(BoRACK1)序列,并对其进行亚细胞定位及表达分析,为研究RACK1基因在植物生长发育过程中的调控机制提供理论参考.[方法]PCR扩增BoRACK1基因,构建其亚细胞定位表达载体,通过基因枪法转化洋葱表皮细胞后在激光共聚焦显微镜下观察绿色荧光蛋白(GEP)的分布情况.利用荧光定量PCR(qRT-PCR)检测BoRACK1基因在不同组织中及在非生物胁迫(200 mmol/L NaCl、100 μmol/L ABA和1 mmol/L H2O2溶液)下幼苗中的表达情况.[结果]PCR扩增获得BoRACK1基因的开放阅读框(ORF)序列,其cDNA全长980 bp,编码326个氨基酸,氨基酸序列与其他植物的RACK1具有较高同源性,在65%以上,尤其与拟南芥的同源性高达93%.BoRACK1基因在羽衣甘蓝的根、茎、叶、花和种子中均有表达,其中在根、叶和种子中的表达量较高,而在花、幼芽和茎的表达量较少.BoRACK1基因在ABA、H2O2和NaCl胁迫下的表达量整体上呈下调趋势,其中NaCl胁迫下其表达量在6 h时降至最低,而其他胁迫下其表达量均在4 h时降至最低.BoRACK1定位于细胞质、细胞核和细胞质膜.[结论]BoRACK1基因表达无组织特异性,除了与羽衣甘蓝花、果实及营养器官的发育存在关联外,还可能参与了植物的抗逆性调控过程.     

盐爪爪液泡膜H+-ATPase B亚基基因克隆及盐胁迫液泡膜相关基因的表达

[目的]研究藜科盐生植物盐爪爪(Kalidium foliatum)V-H+-ATPase B亚基基因的克隆与液泡膜相关基因的表达分析.[方法]采用RT-PCR和RACE技术克隆盐爪爪V-H+-ATPase B亚基基因(VHA-B),利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术分析液泡膜相关基因KfVHA-B、Na+/H+逆向转运蛋白基因KfNHX的表达情况.[结果]KfVHA-B全长1 881 bp,含1 467 bp的ORF阅读框,命名为KfVHA-B(GenBank登录号:EF114316),编码488个氨基酸,推测的蛋白分子量大小为54.01 kD,理论等电点为4.68,含一个保守的ATP结合位点‘323-SGSIT-327’和两个推测的多聚腺苷酸化的信号保守序列;基因编码蛋白的系统进化树分析表明,盐爪爪VHA-B与盐穗木的VHA-B聚类关系最近;qRT-PCR检测了液泡膜相关基因KfVHA-B、Na+/H+逆向转运蛋白基因KfNHX的表达,100、500 mmol/L NaCl处理下,KfVHA-B在转录水平表达量始终保持较稳定,KfNHX基因在转录水平随盐浓度的增加其表达量呈现递增趋势,而且100 mmol/L NaCl处理下72 h时其表达量达到最大.[结论]KfVHA-B可能在盐爪爪应对盐胁迫中起着重要的作用.     

盐胁迫对玉米幼苗根系乙醇脱氢酶与乙醛脱氢酶表达的影响

为玉米的抗盐机理研究和耐盐育种提供理论依据,以郑单958、京糯208玉米种子为材料,研究不同盐浓度(50mmol/L,100mmol/L,150mmol/L,200mmol/L,250mmol/L)胁迫对玉米幼苗根系中乙醇脱氢酶(ADH2)和乙醛脱氢酶(ALDH2)表达的影响。结果表明:1)与对照组(0mmol/L NaCl)相比,2个玉米品种在盐浓度50mmol/L和150~250mmol/L胁迫下,对幼苗根系ADH2表达均表现出显著的抑制作用,而盐浓度100mmol/L时明显刺激ADH2表达。2)与对照组相比,郑单958在盐浓度100mmol/L时明显刺激ALDH2表达,其表达量是对照的2.96倍,150~200mmol/L时ALDH2表达刺激不显著,250mmol/L时ALDH2的表达量为对照组的1.81倍;京糯208在盐浓度150~200mmol/L时ALDH2表达不显著,但在250mmol/L时,表达量是对照组的4.94倍。结论:玉米郑单958和京糯208在不同浓度盐胁迫下其幼苗根系中ADH2和ALDH2的表达不同,盐胁迫下玉米幼苗根系中ADH2和ALDH2的表达变化与玉米的抗盐性有关。     

瞬时过表达MnERF2基因对桑树耐盐性的影响

为探明桑树AP2/ERF转录因子MnERF2基因对桑树耐盐胁迫能力的影响,利用构建好的植物过表达和抑制表达载体瞬时转化桑树,并比较分析NaCl胁迫前后瞬时转化桑树中的活性氧(ROS)含量、抗氧化酶活性、抗氧化物质含量以及抗氧化酶基因的表达量,以综合评定MnERF2基因的耐盐功能.通过荧光定量RT-PCR对盐胁迫后MnE...     

pCAMBIA2300-betA-BADH双价基因植物表达载体的构建

将载体pCAMBIA2300-35s-OCS进行改造,增加了酶切位点Sac Ⅰ,之后,PCR扩增编码胆碱脱氢酶(CDH)的基因并用Sma Ⅰ和Xba Ⅰ将其与改造后的pCAMBIA2300-35s-OCS连接,得到单价植物表达栽体p2300-gz-betA.再通过Sal Ⅰ、Hind Ⅲ、Sac Ⅰ等酶切位点将编码甜菜碱醛脱氧酶(BADH)的基因及其启动子和终止序列连接到栽体p2300-gz-betA上,最终得到pCAMBIA2300-betA-BADH双价植物表达载体,并将其导入根癌农杆菌GV3101和LBA4404.betA和BADH是编码甜菜碱合成途径的两个关键酶的基因(CDH和BADH),也是近年来研究较多的耐盐基因,其双价植物表达栽体应用于遗传转化后,有望进一步提高转基因植物的耐盐性.     

新疆野生冰草抗旱功能基因BADH的克隆及表达载体的构建

[目的]克隆新疆野生冰草抗旱相关基因甜菜碱醛脱氢酶(betaine aldehyde dehydrogenase,BADH)基因,为进一步研究其抗旱功能奠定基础.[方法]利用同源克隆法和RACE方法扩增获得新疆草原区强抗旱植物沙生冰草抗旱相关基因BADH,并将其构建到植物表达载体pBI121上.[结果]克隆获得的新疆野生沙生冰草抗旱相关基因BADH全长1 422 bp,编码区序列全长为1 182 bp,GenBank注册号为GU181396.1,并成功构建了植物过表达载体.     

柽柳ThGSTT1基因的抗旱耐盐表达分析

[目的]研究柽柳ThGSTT1基因的抗旱耐盐表达.[方法]通过对柽柳7个转录组分析,克隆获得一条谷胱甘肽转移酶基因,通过Blast比对及进化分析其结构,并采用qPCR分析基因的抗旱耐盐表达.[结果]该基因为谷胱甘肽Theta家族基因,因此命名为ThGSTT1基因;该基因编码的蛋白氨基酸残基数为231,分子量为26.1 kDa,理论等电点为7.14.表达谱分析显示,ThGSTT1在柽柳根和叶中的表达不同,具有一定的组织表达特异性.qPCR分析结果表明,盐胁迫明显诱导了ThGSTT1基因的表达,叶中胁迫7d表达量为对照的7.48倍,根中胁迫9d时最大.PEG胁迫下ThGSTT1基因的表达明显受抑制,根中胁迫第3天的表达仅为对照的23.7％,而叶中胁迫第5d表达量最低,为对照的12.7％.[结论]谷胱甘肽转移酶是一种重要的抗逆保护酶类,进行抗旱耐盐表达分析具有重要意义.     

NaCl胁迫对藜幼苗叶片渗透调节物质和保护酶的影响

[目的]研究不同浓度NaCl胁迫对藜叶片中渗透调节物质和保护酶活性的影响,以探讨藜的耐盐机理,为藜的人工栽培及推广提供理论依据。[方法]待藜幼苗长到4叶期时,用0%、0.6%、1.2%、1.8%NaCl溶液进行根部胁迫处理,分别于处理0、1、3、5、7 d后从藜幼苗上部取第3～5片功能叶片进行各项生理指标的测定。[结果]在0.6%NaCl胁迫下,渗透调节物质（可溶糖、脯氨酸和可溶性蛋白质）含量和保护酶（SOD、POD和CAT）活性都是缓慢增加的,丙二醛含量增加不大,膜脂过氧化水平低。在1.2%、1.8%NaCl胁迫下,渗透调节物质（可溶性糖、脯氨酸和可溶性蛋白质）含量随胁迫时间的延长而增加,SOD、POD、CAT活性随胁迫时间的延长先升高后降低,丙二醛含量显著提高,膜脂过氧化水平增大。[结论]藜可以通过渗透调节物质增加和保护酶活性增大来对适度的盐胁迫有一定的适应性,但高浓度、长时间的盐胁迫会对藜造成严重损伤。     

4个番茄品种耐盐性比较

[目的]通过4个番茄品种在种子萌发期和幼苗期耐盐性比较,确定最耐盐番茄品种。[方法]以4个番茄品种为试材,研究番茄种子萌发和幼苗生长期的耐盐性。[结果]随着Na Cl浓度的增加,4个不同番茄品种种子发芽率和发芽势下降,相对盐害率增加;植株株高和干物质积累量降低,盐害指数和干鲜比增加,根冠比呈上升—下降—上升的趋势;4个番茄品种在Na Cl浓度50 mmol/L以下的盐碱土可以正常生长,齐达利耐盐性最强,可在Na Cl浓度100 mmol/L正常生长,4个番茄品种耐盐性由高到低依次为齐达利、粉宴1号、美贝、3684。[结论]该研究为盐碱地番茄品种栽培和耐盐机理研究提供理论依据。     

不同耐盐性水稻幼苗叶绿体光能转化特性对盐胁迫的反应

[目的]探讨盐逆境下光合器官的光合潜力,为提高全株光合能力提供理论依据。[方法]以耐盐性不同的水稻品种Pokkali(耐盐)、Peta(盐敏感)幼苗为材料,研究叶绿体光能转化对盐胁迫的响应。[结果]结果表明:随着NaCl胁迫浓度和时间的增加,2个水稻品种净光合速率、叶绿体放氧活性、ATP含量下降;100 mmol/L NaCl胁迫下,叶绿体ATP酶活性先上升后基本不变,叶绿体光合磷酸化活力先上升后下降;200 mmol/L NaCl作用下,叶绿体ATP酶、叶绿体光合磷酸化活性一直下降;且耐盐品种Pokkali下降的程度明显小于盐敏感品种Peta。[结论]盐胁迫下耐盐品种叶绿体光能转化能力强于盐敏感品种。     

NaCl胁迫对灰绿藜中有机渗透调节物质的影响

[目的]为了研究NaCl胁迫对灰绿藜根、茎、叶中渗透调节物质的影响,探寻灰绿藜的耐盐机理。[方法]分别用不同浓度的NaCl溶液(0、100、200、300、400和500 mmol/L)处理灰绿藜,5、10、20和30 d后测定根、茎、叶中相对含水量、可溶性糖、脯氨酸、可溶性蛋白、甜菜碱含量的变化,并测定株高。[结果]随着NaCl浓度的增加,灰绿藜根、茎、叶中的相对含水量逐渐降低,可溶性糖、脯氨酸以及可溶性蛋白的含量逐渐升高;根中的甜菜碱含量始终都高于茎和叶的;株高随着NaCl浓度的升高而降低。[结论]渗透调节可能是灰绿藜耐受盐胁迫的内在生理机制之一。     

‘84K’杨组氨酸激酶基因PaHK3a的表达及功能分析

  目的  干旱、高盐等逆境胁迫严重影响了植物的生长发育。研究表明,组氨酸激酶在植物逆境响应中起重要作用。本研究对银腺杨‘84K’组氨酸激酶基因PaHK3a在不同组织的表达模式分析,检测了其对生长素、细胞分裂素等植物激素处理下及人工干旱、盐碱等非生物胁迫下的表达,结合干旱、盐碱条件下丙二醛（MDA）及保护酶活性等生化指标,对该基因的功能进行了初步鉴定,为杨树抗逆分子育种研究奠定基础。  方法  以‘84K’杨无菌苗为材料,通过实时定量PCR（qRT-PCR）技术分析PaHK3a基因在不同组织的表达模式。对‘84K’杨无菌苗进行浓度为10 mmol/L植物激素处理（ABA、6-BA、IBA、GA3及水杨酸（SA））及非生物胁迫处理（42 ℃高温、0 ℃低温、200 mmol/L NaCl和5% PEG6000）,采用qRT-PCR技术分析PaHK3a基因对不同植物激素及非生物胁迫的表达响应;进一步对温室‘84K’杨进行自然干旱处理（6、8、10 d）、200 mmol/L NaCl（2、4、6 d）处理,测定不同胁迫时间点叶片PaHK3a基因的表达,以及超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）活性及MDA含量,并分析PaHK3a基因表达与生理指标的相关性,初步鉴定杨树PaHK3a基因的功能。  结果  qRT-PCR结果显示,PaHK3a基因在叶片中表达量最高,根部中等,茎段最低。与正常条件下相比,在高温、低温、NaCl及PEG模拟干旱处理时,PaHK3a基因表达量与对照相比明显增高,分别为对照的2.63、1.49、1.54、1.58倍。用IBA诱导处理时,基因表达量与对照相比差异不大,而在6-BA、ABA、GA3及SA处理时,基因表达量与对照相比均呈现显著下调。在温室干旱、盐碱胁迫处理过程中,PaHK3a基因表达均显著高于对照,呈现先上升后下降的表达模式,MDA含量也呈现类似的趋势,而SOD活性则随处理时间的延长而持续升高,POD活性在干旱胁迫时先上升后下降,而高盐胁迫时呈上升趋势。生理指标与PaHK3a基因表达量相关系分析发现,在干旱和盐胁迫下,PaHK3a基因表达量与叶片MDA含量、SOD活性和POD活性均呈正相关。  结论  PaHK3a基因在‘84K’杨根茎叶中均有表达,且叶中表达量最高;PaHK3a基因表达受细胞分裂素6-BA、GA3及ABA及SA等植物激素的负调控,同时,受温度胁迫、盐胁迫、水分胁迫等非生物胁迫正调控;温室人工干旱盐碱胁迫过程中,PaHK3a基因表达量升高,且与叶片MDA含量、SOD活性、POD活性均具有正相关性。研究结果初步显示,杨树PaHK3a基因参与杨树植物激素激素信号响应,并在抗逆境胁迫过程中发挥重要调控作用。      

GmSARK启动子驱动IPT基因在拟南芥中的表达研究

[目的]对GmSARK启动子驱动IPT基因在拟南芥中的表达进行研究。[方法]分别克隆IPT基因及GmSARK基因启动子,构建它们的植物表达载体并进行拟南芥的转化,利用PPT(phosphinothricin)除草剂筛选,检测T1代转基因植株;对T1代转基因植株进行黑暗避光和干旱处理后进行半定量RT-PCR分析。[结果]成功克隆得到了IPT基因及GmSARK基因,并构建了它们的p3301-GmSARK-IPT植物表达载体;对T1代转基因植株的RT-PCR表明,目的基因mRNA水平上有所表达。[结论]为进一步研究GmSARK启动子驱动的IPT基因在抗逆中的作用奠定了基础。     

盐胁迫下小黑麦碳酸酐酶基因表达及其酶活性分析

[目的]探究盐胁迫下小黑麦中碳酸酐酶(CA)基因表达特点及酶活性变化规律.[方法]采用0.15M NaCI对两个六倍体小黑麦品种幼苗进行胁迫处理,通过实时荧光定量PCR对胁迫条件下CA基因表达量的变化进行检测,并利用pH计法对相应材料中的碳酸酐酶活性进行测定.[结果]盐胁迫条件下两个小黑麦品种幼苗中的CA基因表达量及酶活性均较对照有所增强.随胁迫时间的不同,参试的两个小黑麦品种中CA基因表达量及酶活性变化的幅度有一定差异.[结论]盐胁迫对小黑麦中CA基因的表达量和酶活性均具有促进作用.