少孢节丛孢菌XJ-A1几丁质酶AO-483基因的克隆及生物学活性

为弄清少孢节丛孢菌几丁质酶的生物学功能,对少孢节丛孢菌XJ-A1几丁质酶AO-483基因进行克隆及分子特征分析,并在大肠埃希菌中进行诱导表达;采用DNS还原糖法检测经镍柱纯化的重组几丁质酶活性,将其作用于秀丽隐杆线虫幼虫,分析其生物活性。结果显示,AO-483基因编码309个氨基酸,与少孢节丛孢菌标准株(ATCC 24927)的几丁质酶AO-483基因序列的同源性为96.88%,氨基酸序列同源性为97.73%;AO-483含有1个Glyco-hydro-18结构域,位于20~297位氨基酸,属于糖苷水解酶18家族,还含有特征序列GMLGG和LDGLDLDVE;三级结构为典型的三磷酸异构酶桶形结构。SDS-PAGE分析结果表明,重组蛋白AO-483分子质量约为52 ku,与预测大小一致;Western blot分析证实,该重组蛋白能与小鼠抗少孢节丛孢菌多克隆血清抗体发生特异性反应。经DNS还原糖法检测,该重组几丁质酶活性为223.31 U·mL^-1;重组几丁质酶对秀丽隐杆线虫Ⅰ期和Ⅳ期幼虫有较强的降解活性。     

少孢节丛孢菌几丁质酶AO-801基因的分子特征分析及其多克隆抗体制备

为了研究捕食线虫性真菌——少孢节丛孢菌几丁质酶的生物学功能,对少孢节丛孢菌XJ-A1几丁质酶AO-801基因进行克隆和分子特征分析,通过大肠杆菌表达AO-801重组几丁质酶,利用镍柱纯化技术纯化目的蛋白,免疫小鼠后制备AO-801几丁质酶多克隆抗体。结果显示,几丁质酶AO-801基因序列与少孢节丛孢菌标准株[Arthrobotrys oligospora Fres.,美国模式培养物集存库(American type culture collection,简称ATCC)24927]的核苷酸序列同源性为95.96%,氨基酸序列的同源性为97.34%。几丁质酶AO-801属于糖苷水解酶18家族,具有典型的几丁质酶催化区保守序列SIGGW和LDGVDVDWE,无信号肽序列,其二级结构以无规则卷曲、α螺旋和β折叠为主要结构元件,三级结构中有(α/β)8的圆桶形结构。十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,简称SDS-PAGE)和蛋白质印迹法(Western Blot)分析表明,重组几丁质酶蛋白的分子量约为59ku,与预期大小一致,与少孢节丛孢菌阳性血清能发生特异性反应。间接酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay,简称ELISA)法的检测结果显示,获得的抗AO-801多克隆抗体血清效价达到1∶25 600。     

少孢节丛孢菌XJ-A1几丁质酶基因的克隆及生物信息学分析

为研究捕食线虫性真菌几丁质酶的功能,在国内首次对少孢节丛孢菌XJ-A1几丁质酶AO-801和AO-483基因进行扩增、克隆及测序,并对其编码蛋白信号肽、疏水性与亲水性、高级结构、功能域进行预测和分析。结果显示,2个不同蛋白均具有典型的几丁质酶催化区保守序列SXGGW和DGXDXDWE,属于糖苷水解酶18家族几丁质酶,无信号肽序列,表明这2个蛋白为非分泌型蛋白,二级结构以无规则卷曲、α-螺旋和β-折叠为蛋白的主要结构元件,三级结构中有(α/β)8的圆桶形结构。系统发育分析表明,几丁质酶AO-801和AO-483与昆虫病原真菌几丁质酶的亲缘关系更为接近,说明它们所产生的几丁质酶在侵染宿主的过程中发挥着类似的功能,并且不同来源真菌几丁质酶根据分子质量的差异形成3个不同的进化分枝。     

少孢节丛孢菌DNA提取及18SrDNA基因序列扩增试验

对捕食线虫性真菌———少孢节丛孢菌的DNA提取及18SrDNA基因序列扩增方法进行了研究。结果表明:将少孢节丛孢菌接种于0.4g/L玉米粉液体培养基中,置20℃±1℃温箱中培养2周,其浓缩菌丝经细胞裂解液裂解,可用酚———氯抽提法提取DNA,以该DNA为模板,用真菌特异性PCR引物扩增后,少孢节丛孢菌18SrDNA基因序列的4个PCR扩增片段分别为597bp、555bp、377bp、310bp。     

茶卷叶蛾寄生真菌球孢白僵菌几丁质酶基因的克隆与序列分析

球孢白僵菌是最重要的虫生真菌之一,在农林害虫生防中发挥着重要的作用。本研究从茶卷叶蛾球孢白僵菌JYBb201-11菌株中克隆了几丁质酶Bbchit1基因(GenBank登录号:HQ435871)。根据GenBank上昆虫病原真菌几丁质酶基因序列同源性设计引物,分别进行DNA-PCR和总RNA-RT-PCR反应,对得到的目的片段,回收纯化后通过PMD18-T载体转化到大肠杆菌DH5α中,获得几丁质酶基因序列的重组质粒PMD18-chit,并测序。结果表明,DNA-PCR和总RNA-RT-PCR获得的基因序列完全一样,都是一个完整ORF序列,含1 047bp核酸序列,编码348个氨基酸,信号肽长度为22个氨基酸,成熟蛋白理论分子量约为36.78kD,理论等电点为5.95。该蛋白序列中包含2个保守区域,即底物结合区域(SIGG)和几丁质的活性位点(DGIDIDIE),该蛋白可归为几丁质酶18族V类。氨基酸序列同源性分析表明,球孢白僵菌JYBb201-11菌株几丁质酶与球孢白僵菌Bb0062菌株(AAN41259)和NCIM1216菌株(ACF32998)几丁质酶chit1氨基酸序列同源性都达99.43%;与球孢白僵菌MTCC 2028菌株(ACZ28129)几丁质酶chit1氨基酸序列同源性达98.28%。     

棘孢木霉Myb27转录因子基因特性分析、原核表达及产物纯化

以棘孢木霉CGMCC11653菌株菌丝体总RNA反转录的cDNA为模板,克隆全长717 bp转录因子Myb27基因编码序列,其编码238氨基酸组成的多肽。用生物信息学软件预测蛋白的理化性质、结构域并进行亚细胞定位、氨基酸多序列比对和进化关系分析,结果表明：其相对分子质量为27 000,属于Myb-like DNAbinding结构域的蛋白,亚细胞定位在细胞核中。链格孢菌毒素诱导条件下Myb27的表达有显著变化,可能参与棘孢木霉抗链格孢菌毒素胁迫应答反应的正向调控。构建原核表达载体pMAL-Emyb27,转化大肠杆菌ER2523获得转化子ER2523-Emyb27,其成功诱导的最适条件为0.1 mmol/L IPTG 37°C连续诱导培养3 h;用PBS+10 mmol/L麦芽糖洗脱层析柱可得到与MBP标签融合的单一可溶性69 500重组rMyb27蛋白。可见Myb27转录因子调控抗病基因的表达所结合的顺式作用元件提供体外重组蛋白,为调控棘孢木霉抗杨树叶枯病链格孢菌毒素胁迫的机理提供理论依据。     

羊草Class Ⅱ几丁质酶基因的克隆及序列分析

[目的]克隆自然生长于黑龙江省盐碱地的羊草ClassⅡ几丁质酶基因并进行序列分析,为进一步研究几丁质酶基因的生物功能和应用奠定了基础。[方法]构建羊草叶片的cDNA文库,对其进行DNA序列测定和分析,并与GenBank中收录的植物几丁质酶基因序列及编码的氨基酸序列进行同源性比较。[结果]在羊草叶片eDNA文库中克隆出1条全长eDNA片段,片段长996bp,其中,可读框768bp,编码255个氨基酸。编码产物在结构上缺乏CBD和C-端延伸区,具有ClassⅡ几丁质酶的结构特征,其氨基酸序列与黑麦和小麦ClassⅡ几丁质酶具有很高的同源性;构建的pQE—LcChi2重组载体经诱导后表达出一个约27KD的蛋白,与推测的pQE-LcChi2基因编码产物大小一致。[结论]LcHi2基因在大肠杆菌中能够表达,是一个具有表达功能的基因。     

粉红粘帚菌几丁质酶基因cDNA克隆及表达

为研究粉红粘帚菌(Clonostachys rosea)生防机制并获得生物防治相关基因,文章利用RT-PCR方法克隆粉红粘帚菌1个几丁质酶基因T-ech42,对该基因进行生物信息学分析,并在大肠杆菌原核表达系统中进行外源表达。该基因长度为1 263 bp,编码420个氨基酸。推导T-ech42氨基酸序列以及蛋白质结构的生物信息学分析表明,该蛋白等电点为5.85,理论分子质量为45.13 ku,N端含信号肽,长度为20个氨基酸;T-ech42属于糖基水解酶18家族内切几丁质酶,包含SIGGW底物结合位点和FDGIDXDWE活性位点。将该基因构建到原核表达载体p ET-22b(+)上,转化至大肠杆菌BL21(DE3)菌株中,经终浓度1 mmol·L-1的IPTG诱导4 h后,可见酶蛋白活性表达。     

碳氮源对少孢节丛孢生长及捕食线虫能力的影响

[目的]探索不同碳氮源对少孢节丛孢生长及捕食线虫能力的影响。[方法]通过对菌株进行分离、接种与培养,观察、测定少孢节丛孢在含有葡萄糖、蔗糖、乳糖、可溶性淀粉4种碳源和尿素、氯化铵、硫酸铵、硝酸铵4种氮源培养基上生长时的菌落形态、大小、稠密度、菌丝粗细及其捕食线虫的能力。[结果]碳源不同,少孢节丛孢的生长及捕食能力不同。4种碳源中,可溶性淀粉的效果最好,最适合少孢节丛孢的生长,且菌丝捕食线虫的能力最强。3种无机氮源对少孢节丛孢生长及捕食能力的影响没有显著差异,但与有机氮源尿素的影响相比,差异较大。在含尿素的培养基中,少孢节丛孢生长速度最慢,但菌丝捕食线虫能力最强。[结论]碳源和氮源对少孢节丛孢的生长和捕食线虫能力均有明显影响。     

甘蔗B家族蔗糖磷酸合成酶基因SofSPSB的克隆及原核表达

[目的]克隆甘蔗B家族SofSPSB基因并进行原核表达,为进一步研究甘蔗SPS酶学特性及SPS活性调控机制奠定基础.[方法]在进化分析的基础上,通过同源克隆获得甘蔗SofSPSB基因部分序列,再结合RACE技术获得全长cDNA序列.扩增SofSPSB基因ORF并连到原核表达载体pETBlue-2上,导入大肠杆菌BL21(DE3)中表达.[结果]通过比对B家族中进化关系很近的玉米(Zea mays)ZmSPS1和水稻(Oryza sativa) OsSPS1基因序列,并在保守区设计一对引物扩增获得甘蔗B家族SPS基因(SofSPSB) 2330 bp序列.结合5'-RACE和3'-RACE技术获得3481 bp SofSPSB基因全长cDNA序列,该序列包含一个3225 bp的开放阅读框(ORF);起始密码子(ATG)位于转录起始位点后56 bp处,终止密码子(TGA)后有一段201 bp的非编码序列,并带有真核生物典型的polyA尾巴;编码1074个氨基酸,SofSPSB与Zm-SPS1、OsSPS1的核苷酸序列同源性分别为94.7%和81.3%,氨基酸序列同源性分别为96.0%和83.9%;其理论分子量Mw=118.96 kDa,等电点pI=6.30.经原核表达后纯化获得带6×His标签的融合蛋白.[结论]克隆获得甘蔗B家族Sof-SPSB基因全长cDNA序列,成功构建了SofSPSB基因原核表达载体,使其在大肠杆菌BL21(DE3)中表达.     

芥蓝黑芥子酶基因的克隆与原核表达

根据GenBank上已公布的植物黑芥子酶基因序列设计引物,采用RT-PCR和3′/5′-RACE相结合的方法,从芥蓝中克隆出黑芥子酶基因全长cDNA序列.序列全长为1832 bp,开放阅读框为1647 bp,编码549个氨基酸,含有糖基水解酶家族Ⅰ(Glyco_hydro_1)活性位点,GenBank登录号为DQ767973.该核苷酸序列与十字花科其他植物的黑芥子酶基因序列具有较高的同源性,同油菜、萝卜、芥菜和大白菜的同源性达90%以上.利用pET28-α(+)构建芥蓝黑芥子酶基因的原核表达载体,转入大肠杆菌BL21,经IPTG诱导表达,SDS-PAGE检测表明表达蛋白的分子质量约为65 ku.     

甜菜夜蛾几丁质脱乙酰酶基因(secda 5)的原核表达及多克隆抗体制备

[目的]几丁质脱乙酰酶(Chitin deacetylase,CDA,EC 3.5.1.41)是昆虫几丁质代谢中的一种关键酶,在昆虫生长、发育和代谢中具有重要作用.本研究旨在克隆甜菜夜蛾secda5基因,对其进行原核表达,同时制备其蛋白的多克隆抗体.[方法]以pMD19-T-secda5重组质粒为模板,通过PCR技术获得编码甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)中肠几丁质脱乙酰酶secda5全长基因,连接pET-28a载体并转化E.coli BL21 (DE3)构建工程菌.以不同IPTG浓度、培养温度对目的蛋白进行诱导表达.[结果]IPTG终浓度为0.50 mmol/L、37℃诱导培养4h时蛋白表达量最高.诱导表达获得的重组蛋白经纯化后制备多克隆抗体.[结论]此研究成功克隆了甜菜夜蛾secda 5基因,并进行了原核表达以及多克隆抗体的制备.     

重组毕赤酵母表达棘孢木霉几丁质酶gene02524的酶学性质及抑菌活性

几丁质酶是催化降解几丁质的水解酶,在防治植物真菌病害与虫害方面的应用越来越广泛,是一种重要的生防蛋白。棘孢木霉TD3104是一株优良的植物病害生防菌,几丁质酶在抑菌防病过程中发挥重要作用。为克隆表达棘孢木霉TD3104几丁质酶基因gene02514,明确酶学性质和抑菌活性,利用毕赤酵母表达系统对目的蛋白进行表达,并通过SephadexG-100凝胶进行纯化,对序列进行分析并研究其酶学性质及进行体外抑菌试验。本研究成功地构建了pPIC9K/gene02524重组载体,并且经过比对发现其包含GH18家族的特征氨基酸序列,获得了毕赤酵母转几丁质酶基因工程菌,表达的重组几丁质酶表观分子量44.4 ku,K_m=2.048 2 g/L,V_max=0.635 5×10³μmol/（L·min）,最适反应温度为50℃,最适pH值为5.0,在pH值为3.5时稳定性最高;金属离子Cu²⁺、Hg²⁺可强烈抑制酶活性;可抑制金黄壳囊孢菌等病原真菌的生长。研究结果为解析棘孢木霉几丁质酶在生防中的作用及功...     

杨树PsChiⅠ基因全长的克隆与表达分析

【目的】克隆川杨几丁质酶基因cDNA全长序列,分析其在病原菌侵染过程中不同时段的表达特征。【方法】以受落叶松-杨栅锈菌(Melampsora larici-populina)单孢子堆菌系Sb052侵染后的川杨叶片为试材,采用RACE法克隆川杨几丁质酶基因cDNA序列,对其进行生物信息学和实时荧光定量表达分析。【结果】克隆到1条川杨几丁质酶基因序列,将其命名为PsChiⅠ(GenBank登录号:KC416180)。该序列全长1 145bp,包含1段960bp的开放阅读框(ORF),38bp的5′非编码区和147bp的3′非编码区。其编码蛋白含有319个氨基酸,具有2条糖苷水解酶19家族特征序列,理论等电点为5.03,为ClassⅠb型酸性几丁质酶,属于几丁质酶第19家族。序列比对和系统进化树结果表明,PsChiⅠ与毛果杨(Populus trichocarpa)几丁质酶基因相似性最高,且亲缘关系最近。实时荧光定量PCR结果表明,菌系Sb052侵染杨树叶片后PsChiⅠ基因在各个时段都有表达,但以侵染后12和48h时的表达量相对较高。【结论】获得了几丁质酶基因全长序列,推测其参与了寄主川杨抵抗真菌的防御机制。     

百日草几丁质酶基因片段克隆及其序列分析

[目的]克隆百日草几丁质酶的基因片段,并对其序列进行分析.[方法]以百日草“梦境”系列为材料,提取其叶片总RNA,并根据其他植物几丁质酶基因保守序列设计简并引物,通过RT-PCR克隆百日草几丁质酶基因片段（ZEchi）,并对该基因序列进行分析.[结果]克隆得到的片段长度为227 bp,共编码75个氨基酸残基;核苷酸同源性分析表明,ZEchi与已报道的其他植物几丁质酶基因同源性达70％以上,其中与葡萄的同源性最高,为74％;氨基酸同源性分析表明,该几丁质酶多肽属于18家族几丁质酶,且与已报道的其他植物几丁质酶氨基酸序列具有70％以上的相似性;氨基酸聚类分析表明,该几丁质酶多肽与白车轴草和蒺藜苜蓿的几丁质酶聚类;生物信息学分析表明,由该基因片段编码的多肽为非跨膜蛋白,主要含α螺旋和随机线圈螺旋等二级结构.[结论]该研究为进一步研究几丁质酶基因的功能奠定了基础.     

金龟子绿僵菌(Metarhizium anisopliae HN1)几丁质酶与谷胱甘肽S-转移酶GST在大肠杆菌中的高效融合表达

使用RT-PCR方法,从高毒力金龟子绿僵菌Metarhizium anisopliae HN1中,克隆得到一个全长为1275bp的几丁质酶基因,经Blast分析此基因序列与M．anisopliae E6的chil基因（AF02749）同源率为96％。将此基因克隆到pGEX-6p-1载体上,使之与载体上一个约26kD大小的谷胱甘肽S-转移酶（GST）相连,构建pGEX-chi融合表达载体,转化到大肠杆菌（Escherichia coli）BL21中,经SDS-PAGE结果分析显示：表达出的融合蛋白大小为68kD,此目的蛋白占表达总量的64．5％。经破碎处理后可检测到几丁质酶活性。     

朱砂叶螨几丁质脱乙酰基酶TecCDA3基因克隆及表达特征分析

[目的]拟克隆朱砂叶螨几丁质脱乙酰基酶TecCDA3并对其进行表达特征分析.[方法]采用同源基因克隆技术克隆TecCDA3,通过实时荧光定量PCR技术分析其表达特征.[结果]成功克隆朱砂叶螨几丁质脱乙酰基酶TecCDA3 (GenBank No.MK779705),其开放阅读框长度为1 611 bp,共编码536个氨基酸,含有3种结构域,根据同源性和发育树分析判定其属于几丁质脱乙酰基酶家族Group Ⅱ.TecCDA3在成螨时期表达量最高,在幼螨时期表达量最低,呈现先下降后升高的表达趋势.[结论]克隆得到朱砂叶螨几丁质脱乙酰基酶TecCDA3并对其表达特征进行分析,丰富朱砂叶螨几丁质脱乙酰基酶基因家族.     

捕食线虫性真菌—少孢节丛孢菌口服生物制剂安全性试验

为研究少孢节丛孢菌口服生物制剂的安全性,将20只6月龄绵羊分成4组,前3组分别灌服含有1.0×105、1.0×106、1.0×107少孢节丛孢菌分生孢子口服生物制剂,第4组为对照组灌服灭菌的生理盐水,灌服后连续30d观察绵羊的各项临床指标;并在7d后每组分别剖检2只绵羊,无菌采集绵羊各器官组织,进行组织切片和少孢节丛孢菌的分离鉴定;另外,将12只感染捻转血矛线虫后的绵羊分成3组,灌服3个不同剂量的生物制剂后测定其对粪便中线虫的捕食活性。结果表明,绵羊的精神状态、食欲、饮水、体温、粪便、增量正常;绵羊肝脏、脾脏、肾脏、肠道淋巴结等组织器官没有出现病理变化;也未从上述组织中分离出少孢节丛孢菌;3个不同剂量的生物制剂均可显著降低绵羊粪便中的幼虫数量。研究结果证实,少孢节丛孢菌口服生物制剂安全有效,无毒副作用。     

枯草芽孢杆菌apr基因的克隆和表达

通过PCR技术克隆枯草芽孢杆菌蛋白酶apr基因,并分别对该基因和编码蛋白进行同源性比较和酶学性质分析。结果表明,apr基因序列全长1509bp,编码503个氨基酸,同源性100%;克隆到表达质粒pET-22b(+)后,将重组质粒经热激转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,IPTG诱导表达,蛋白分子质量为55ku。测定酶活为19500U·mL-1。该基因克隆和表达的成功对于制备大豆抗氧化肽具有实际应用价值,对进一步深入研究其生物学和酶学机制具有重要意义。     

三种生境少孢节丛孢生长特性和捕食效力比较

比较分离自温泉、淡水及土壤的捕食线虫真菌——少孢节丛孢(Arthrobotrys oligospora)的生长特性及捕食效力。通过测定三种生境少孢节丛孢在不同温度、p H及有氧和无氧条件下的生长率及其在最适培养条件下对线虫的捕食率,得出三种生境中少孢节丛孢的最适生长温度均为30℃,分离自温泉和土壤的少孢节丛孢最适p H分别为5.5~7.0和4.5~5.5,而淡水生境少孢节丛孢对不同p H具有广泛适应性;淡水和温泉生境少孢节丛孢对无氧环境有一定的耐受性,而土壤生境少孢节丛孢在无氧环境下生长率低至1.24 cm/5 d。三种生境的少孢节丛孢捕食效力没有显著性差异。