水稻纹枯病菌(Rhizoctonia solani)原生质体制备与再生技术及优化

水稻纹枯病的病原菌是立枯丝核菌(Rhizoctonia solani Kühn),其病原菌(R.solani Kühn)又称为水稻纹枯病(rice sheath blight)菌,由立枯丝核菌侵染引起的水稻纹枯病是水稻上最重要的病害之一。为建立高效的水稻纹枯病菌原生质体制备技术体系,采用0.7mol/L NaCl作为渗透稳定剂,对Glucanex、溶壁酶(lywallzyme)、纤维素酶(cellulase-R-10)、离析酶(macerozyme-R-10)、蜗牛酶(snailase)、崩溃酶(driselase)和裂解酶(lysing enzyme)等7种不同的胞壁裂解酶降解水稻纹枯病菌GD-118菌株细胞壁的作用进行测定,并对不同酶组合及其酶质量浓度进行优化筛选。结果显示:Glucanex对水稻纹枯病菌细胞壁的降解效果最好,用20mg/mL Glucanex处理1g菌丝4h后,可释放118.5×104个原生质体;用15mg/mL Glucanex和10mg/mL lywallzyme混合酶处理,可高效降解水稻纹枯病菌细胞壁并获得大量原生质体,原生质体产量达3.09×107个/g菌丝,再生率达58%;Glucanex和lywallzyme的混合酶对不同水稻纹枯病菌菌株的细胞壁降解和原生质体释放没有显著差异。可见,上述制备水稻纹枯病菌原生质体的方法具有较好的高效性和适用性,可满足该菌分子遗传研究的需要。     

小麦纹枯病菌原生质体制备条件及再生菌株致病性研究

以小麦纹枯病菌HD-6为对象,进行原生质体制备与再生研究,并将再生菌株与原始菌株的致病性进行比较分析,为建立小麦纹枯病菌高效遗传转化体系提供依据.选用溶壁酶、崩溃酶、蜗牛酶、纤维素酶4种常见酶分别对小麦纹枯病菌进行酶解,并通过单因素试验分析酶解温度、酶解时间以及溶液pH值对原生质体得率的影响.结果表明,4种酶均能够裂解小麦纹枯病菌细胞壁得到一定数量的原生质体,其中崩溃酶的裂解效果最好,每克菌丝得到的原生质体数可达到2.6×108个.该酶的最佳反应温度是24℃,最适的酶解时间是3h,最适的pH值是6.0.获得的原生质体可以完成再生,并且再生菌株与原始菌株的致病力没有显著差异.     

裂壳菌L-14原生质体制备与再生体系构建

【目的】初步构建裂壳菌L-14原生质体制备和再生体系,为同源菌株原生质体制备研究提供理论依据。【方法】研究细胞壁裂解酶组合、酶解时间、酶解温度、渗透压稳定剂种类对原生质体制备产量的影响,以获得最优制备方案,同时筛选适合的原生质体再生培养基。【结果】菌株经YEPG液体培养基培养7 d后,使用0.7 mol/L的NaCl作为渗透压稳定剂配置浓度各为20 mg/mL的崩溃酶+裂解酶复合酶液,在30℃、80 r/min条件下酶解5.5 h后可获得较高的原生质体数量,利用PDS培养基的原生质体再生率可达10.65%,显著高于其它类型培养基。【结论】确定了裂壳菌L-14的高效原生质体制备与再生体系,为该菌株遗传转化体系的建立研究奠定基础。     

水稻纹枯病菌原生质体制备与再生条件的优化

为获得进行水稻纹枯病菌遗传转化所需的高质量原生质体,选用该病菌强致病力菌株GD-118,分别从酶种类、菌龄、酶解时间、酶解温度、酶液pH值和渗透压稳定剂及其浓度6个方面优化了原生质体的制备条件,从酶解时间和渗透压稳定剂及其浓度2个方面优化了原生质体的再生条件。结果表明:优化后的水稻纹枯病菌原生质体制备的最佳条件组合是"纤维素酶+溶菌酶+崩溃酶"组合酶、总酶终质量浓度10mg/mL、菌丝菌龄15h、酶解时间3h、酶解温度35℃、酶液pH5.6、以0.6mol/LMgSO4.7H2O为渗透压稳定剂,此最佳条件组合所制备的原生质体产率高达4.00×107/g;原生质体最佳的再生条件是酶解3h的原生质体在含1.0mol/L甘露醇的再生培养基上26℃时进行培养,在此条件下可获得最佳的再生效果,再生率为39%。     

基于 VBL 增白剂细胞染色的水稻原生质体细胞壁变化检测

为快速、准确地观察水稻原生质体制备及培养过程中水稻细胞壁的去除和再生情况，利用荧光增白剂 VBL 细胞壁染色液对细胞进行染色，制片后置于激发波长为345 nm、发射波长为430 nm 的荧光显微镜下观察。结果发现，在原生质体制备过程中，细胞周围发出的蓝色荧光初期表现分布均匀且荧光强烈，之后逐渐变为分布不均匀且荧光暗淡，最后蓝色荧光消失，表明纤维素逐渐被酶解去除；在原生质体培养过程中荧光情况与制备过程的刚好相反。结论：利用荧光增白剂 VBL 细胞壁染色液染色通过荧光强弱变化对比，可以快速、准确地检测水稻原生质体制备及培养过程中细胞壁的变化。     

层出镰孢菌原生质体制备条件的研究

[目的]研究层出镰孢菌(Fusarium proliferatum)原生质体的最佳条件,建立高效制备层出镰孢菌原生质体制备的方法.[方法]通过对菌丝体菌龄、酶解液组合、酶解反应温度及酶解时间等影响因素进行优化,对层出镰孢菌原生质体的制备条件进行研究.[结果]菌块在CMC液体培养基中25℃培养分生孢子3 d后,过滤离心后转移至YEPD液体培养基中培养12 h,该菌丝最适于层出镰孢菌原生质体的制备;用1.2 mol/L KCl溶液配制含有5 mg/m L裂解酶、25 mg/m L崩溃酶、0.05 mg/m L溶壁酶的酶解液在30℃下对菌丝酶解1.5 h,此时原生质体的数量最大,为2.47×10~9个/m L.原生质体再生培养时,使用40%PTC溶液恢复细胞壁,在TB3液体培养基中30℃过夜培养,离心后与TB3固体培养基混合后倒入平板培养,原生质体再生率可达39.75%.[结论]通过对菌丝体菌龄、酶解液浓度、温度、酶解时间等条件的优化,可提高层出镰孢菌原生质体的产量及再生率,为进一步研究层出镰孢菌致病分子机制提供理论依据.     

纹枯灵与担菌胺防治水稻纹枯病田间药效试验报告

田间试验了７５％纹枯灵可湿粉剂、２０％担菌胺可湿粉剂和５％井冈霉素对水稻纹枯病的防治效果。结果表明，用纹枯灵和担菌胺不同剂量处理的小区，水稻纹枯病的相对病情指数或相对病害增长率，显著低于用井冈霉素处理的小区。     

秦巴蛹虫草原生质体的制备及再生条件研究

【目的】研究秦巴蛹虫草原生质体制备及再生的最适条件,建立高效制备和再生原生质体的方法。【方法】以秦巴蛹虫草无性型菌株CM-16为材料,研究细胞壁裂解酶种类、酶解时间、酶解温度、菌丝体菌龄及稳渗剂种类对原生质体制备及再生效果的影响,并在单因素试验结果基础上进行正交优化试验。【结果】(1)以0.6mol/L NaCl为稳渗剂,用混合酶(质量分数1%纤维素酶和质量分数0.5%蜗牛酶按1∶1体积比混合)在(26±1)℃对菌龄6d的菌丝酶解3h,原生质体的产量最高。(2)以0.6mol/L甘露醇为稳渗剂,用混合酶(质量分数1%纤维素酶和质量分数0.5%蜗牛酶按1∶1体积比混合)在(26±1)℃对菌龄5d的菌丝酶解2h,原生质体的再生率最高;验证试验结果表明,在此条件下,原生质体再生率平均为25.7%,此时原生质体平均产量为83.42×105 mL-1。【结论】对酶解温度、酶解时间、菌丝体菌龄、稳渗剂及酶系种类等条件的优化,可提高秦巴蛹虫草原生质体的产量及再生率。     

石灰抑制稻纹枯菌的效应及应用研究

稻纹枯菌是水稻主要病害稻纹枯病的病原菌 ,由于其寄主范围广 ,变异性强 ,目前常用生物和化学农药防治 ,但污染重 ,成本高。笔者着重研究了石灰对稻纹枯菌的抑制及防治效果。经 3年的应用研究 ,现已证实该方法可行 ,且经济、安全无污染 ,实用性较强。     

大豆疫霉菌原生质体制备及再生菌株的生物学性状

为了建立聚乙二醇(PEG)介导的大豆疫霉菌的遗传转化系统,对大豆疫霉菌原生质体的制备条件及再生菌株的生物学性状进行了研究.结果表明:Driselase以及Driselase和Lysing酶的混合液均能有效地裂解菌株Pmg 2-3的细胞壁并获得原生质体;其中混合酶液的裂解效果优于Driselase单一酶液,当混合酶液中两个酶的浓度均为15 mg·mL-1时,在30℃消化3 h可产生4×106mL-1的原生质体.所制备的原生质体经细胞核染料4,6-diamidino-2-phenyl-indole(DAPI)染色后发现,大型均一的原生质体内含有细胞核;原生质体在再生培养基上再生率达1.0%,再生菌株在利马豆培养基上菌落形态呈白色、圆形、毛毡状,其生长速率、致病性均与亲本菌株保持一致.     

小单孢菌40027菌株原生质体的形成和再生

通过酶解温度、酶解时间和再生培养基对小单孢菌40027菌株原生质体形成和再生的研究,确定小单孢菌40027菌株原生质体制备条件为37℃酶解60min;原生质体的再生培养基为R-1培养基。     

植物原生质体及利用其进行细胞结构和生理研究的进展

本文综述自70年代以来利用原生质体进行细胞结构和生理研究的进展.内容包括:用以细胞结构和生理研究的原生质体的制备;利用原生质体进行细胞结构,尤其是细胞壁再生的研究;利用原生质体进行细胞生理的研究,着重反映光合作用和跨膜运输两方面的内容.     

木霉菌原生质体的制备和再生的研究

采用正交拉丁设计对影响木霉菌原生质体制备和再生的条件进行了系统研究。结果表明：木霉菌原生质体制备受到缓冲体系、渗透压稳定剂、木霉菌菌龄、细胞壁降解酶的种类、酶解时间和再生培养基的影响，而不受木霉菌株系的影响。其中以磷酸缓冲体系和蔗糖为渗透压调节剂的降解体系为最佳，木霉菌菌龄以培养20h较好，崩溃酶对木霉菌细胞壁的降解效果好，酶解时间以4h为最佳，再生培养基以基础培养基和NaCl为渗透压调节剂为最佳。     

蛹虫草原生质体的制备与再生

为了建立原生质体介导的蛹虫草遗传转化系统,考察了各种细胞壁裂解酶和渗透压稳定剂等对蛹虫草原生质体形成和再生的影响.蛹虫革菌丝体形成和释放原生质体最适裂解酶和酶解时间分别为:1%Cellulase,30℃作用2 h;最适渗透压稳定剂是0.8mol·L-1MgSO4;最适合原生质体再生的培养基为含0.6mol·L-1蔗糖的PDA培养基.原生质体液涂布双层再生培养基的方法再生率最高,为4.38%.     

大豆疫霉菌原生质体制备及再生菌株的生物学性状

为了建立聚乙二醇(PEG)介导的大豆疫霉菌的遗传转化系统,对大豆疫霉菌原生质体的制备条件及再生菌株的生物学性状进行了研究。结果表明:D riselase以及D riselase和Lysing酶的混合液均能有效地裂解菌株Pmg 2-3的细胞壁并获得原生质体;其中混合酶液的裂解效果优于D riselase单一酶液,当混合酶液中两个酶的浓度均为15 mg.mL-1时,在30℃消化3 h可产生4×106mL-1的原生质体。所制备的原生质体经细胞核染料4,6-d iam id ino-2-phenyl-indole(DAPI)染色后发现,大型均一的原生质体内含有细胞核;原生质体在再生培养基上再生率达1.0%,再生菌株在利马豆培养基上菌落形态呈白色、圆形、毛毡状,其生长速率、致病性均与亲本菌株保持一致。     

甜瓜蔓枯病菌原生质体制备及再生体系研究

【目的】建立高效的病原菌原生质体制备和再生体系,明确甜瓜蔓枯病菌的致病机理。【方法】采用单因素分析法,利用2种混合酶20 g·L~(-1) Driselase和8 g·L~(-1) Lysing enzymes,以不同菌龄、摇培转速、不同酶解时间、温度、渗透压稳定剂的种类及pH、再生培养基为研究条件;对甜瓜蔓枯病菌原生质体的制备及再生体系进行优化。【结果】结果表明:以培养36 h左右的菌丝体为材料,以0.7 mol·L~(-1) NaCl作为渗透压稳定剂(pH=7),用20 g·L~(-1) Driselase和8 g·L~(-1) Lysing enzymes在30℃、 140 r·min~(-1)条件下酶解4 h,原生质体的产量可达9.65×10~7个·mL~(-1);以琼脂含量为0.6%的SR培养基作为再生培养基,甜瓜蔓枯病菌的再生率可达22.53%;原生质体的再生率在存放10 h内下降迅速,10 h后下降速度逐渐平缓。【结论】确定了蔓枯病菌的高效原生质体制备与再生体系,为该菌株遗传转化体系的建立奠定基础。     

水稻离体叶片抗纹枯病接种方法的研究

水稻纹枯病是影响水稻生产的重要病害之一。水稻纹枯病抗性属于数量遗传性状,目前尚未发现高抗或免疫的水稻种质材料。为了提高水稻抗纹枯病种质的筛选和研究效率,对水稻离体叶片抗纹枯病接种的实验条件进行了更精确的控制,并采用了量化的病情调查方法。取纹枯菌接种离体水稻叶片组织进行qRT-PCR分析,水稻病程相关基因呈诱导表达,验证了纹枯病菌对水稻的侵染。采用离体叶片接种、大田成株期接种、苗期“微室”接种法,对抗纹枯病水稻品种和敏感品种进行测试。抗性品种和敏感品种纹枯病病级的统计检验呈显著差异,3种方法的结果表现一致。改进的离体叶片接种方法具有易于操作和重复性好的优点,适用于大规模筛选抗纹枯病水稻种质材料。     

3种作物纹枯病菌生物学特性差异的比较

较系统地比较了水稻、玉米和小麦3种作物纹枯病菌的培养性状及其在不同培养基、温度、碳源、氮源、pH值和光照条件下生物学特性的差异。结果表明:供试的3种纹枯病菌菌株在菌落生长速率、菌落和菌核颜色、菌核数量和菌核在培养皿的分布等方面均有明显差异;水稻、玉米和小麦纹枯病菌在Czapek培养基上菌丝生长最快、产生的菌核最多,在Richard培养基上菌丝生长最慢,在WA培养基上产生菌核极少或无;水稻和玉米纹枯病菌菌株生长温度范围为10～35℃,最适温度为25～30℃,而小麦纹病菌枯菌株生长温度范围为5～30℃,生长最适温度为20～25℃;3种纹枯病菌菌株对供试碳源中的可溶性淀粉、蔗糖和葡萄糖能很好地利用,但水稻和玉米纹枯病菌菌株对甘露醇的利用能力最差,而小麦纹枯病菌菌株对乳糖的利用能力最差;硝酸钾、亚硝酸钠、硫酸铵、脲和L-亮氨酸5种氮源对3种纹枯病菌菌丝的生长影响不显著,但对菌核的形成有显著影响;3种纹枯病菌菌株在pH 4～10时均可生长和形成菌核,pH 6时生长最快、形成菌核较多。试验结果还表明,光照对3种纹枯病菌菌丝的生长影响无明显差异,但对菌核数量和颜色有显著影响。     

芒果皮萃取物抑菌成分稳定性探讨

对芒果皮采用乙醇提取后再用乙酸乙酯萃取得到的萃取物进行抑菌性能研究,抑菌谱测定结果表明,萃取物对小麦纹枯、小麦赤霉和水稻纹枯等病原菌具有很强的抑菌活性;平皿叶片法结果显示,萃取物对水稻纹枯病菌的治疗效果接近于50%多菌灵WP 1000倍液的防效。同时以水稻纹枯病菌为指示菌,研究芒果皮乙酸乙酯萃取物活性成分的稳定性,结果表明,温度对其抑菌活性影响最大,超过40℃抑菌能力明显下降,但80℃后有所回升;经酸、碱处理后萃取物的生物活性没有变化;紫外光照射对其活性没有任何影响;常见金属离子(Na 、K 、Ca2 、Mg2 、Fe2 、Fe3 )除Na 和K 外,对其活性也有一定影响。     

臭牡丹根提取物的抑菌效果

[目的]研究臭牡丹根不同极性溶剂提取物对常见植物病原微生物的抑菌效果。[方法]制备了乙醇、乙醚、乙酸乙酯和蒸馏水4种臭牡丹提取物,采用菌饼法研究臭牡丹根的抑菌能力,包括抑菌圈直径（十字交叉法）、最小抑菌浓度（MIC）的测定。并以小麦赤霉为指示菌,观察了pH值为5～8范围内臭牡丹根提取物的抑菌活性。[结果]臭牡丹根的4种提取物对小麦纹枯病菌、小麦赤霉病菌、水稻纹枯病菌、玉米大斑病菌均具有不同程度的抑菌作用,其中,蒸馏水提取物的抑菌效果最好,其次为乙酸乙酯、乙醚,80％乙醇提取物的抑菌效果最差。4种溶剂提取物对小麦赤霉的抑制效果几乎都优于其他的菌种,而对玉米大斑的抑制效果最差,可能是其抑菌机理不同,导致对不同菌的抑菌能力产生差异。乙酸乙酯提取液对小麦赤霉、小麦纹枯、水稻纹枯和玉米大斑最小抑菌浓度分别为16、20、20、25mg／ml;80％乙醇提取液对水稻纹枯和小麦赤霉的最小抑菌浓度为30mg／ml,而对小麦纹枯和玉米大斑的最小抑菌浓度为35mg／ml;蒸馏水提取液对小麦纹枯和小麦赤霉的最小抑菌浓度为10mg／ml,水稻纹枯和玉米大斑的最小抑菌浓度分别为16、20mg／ml;乙醚提取液对小麦赤霉、小麦纹枯、水稻纹枯和玉米大斑最小抑制浓度分别为10、20、20、30mg／ml。总的看来,臭牡丹根提取物对这几种常见植物致病菌的MIC均在35mg／ml以下。臭牡丹根提取物在pH值5～8的范围内具有不同程度的抑菌作用。80％乙醇提取物和乙酸乙酯提取物在中性条件下,抑菌效果较好,然后,随着pH值增加或减小而变差;乙醚提取物在酸性条件下,对小麦赤霉的抑制作用大于在中性和碱性条件下;而蒸馏水的则与乙醚相反,表明其抑菌活性受pH值的影响较大。[结论]臭牡丹根对4种病原微生物具有较好的抑制效果,其抑菌活性受pH值影响较大。