甘菊内参基因CITUA的克隆与表达分析

根据前期工作已获得的甘菊α-tubulin基因EST序列，使用RACE技术获得了该基因的全长序列，命名为ClTUA。生物信息学分析表明，ClTUA基因全长cDNA序列为1 580 bp，编码432个氨基酸残基。利用MEGA40软件对推测的氨基酸序列进行系统关系分析发现，其为植物中Ⅰ类α-tubulin基因。RT PCR分析发现:ClTUA基因不仅在盐、干旱、冷、热、脱落酸和水杨酸各种非生物胁迫下稳定表达，而且在不同生长发育阶段的样本中稳定表达；而作为对照的两个内参基因，ClActin和26S rRNA基因在不同非生物胁迫下表达稳定，但在不同生长发育阶段的样本中表达强度不同。这一结果表明，ClTUA基因的表达稳定性优于ClActin和甘菊26S rRNA基因，可以作为内参基因用于甘菊抗逆性和生长发育过程中基因表达规律研究。      

中国南瓜内参基因18S rRNA的克隆及其引物开发

【目的】克隆获得中国南瓜18SrRNA,并设计合适的荧光定量PCR内参,为开展中国南瓜重要功能基因的表达模式和调控机制研究奠定基础。【方法】以中国南瓜‘密本’品种的基因组DNA为模板,通过PCR方法克隆中国南瓜18SrRNA基因序列,再利用Primer Premier软件设计荧光定量PCR引物,对该内参基因在中国南瓜不同组织、生长阶段及非生物胁迫条件下的表达稳定性进行检测。【结果】首次克隆得到中国南瓜18SrRNA基因序列,其长度为1 857bp,GenBank登录号为KM979454,该基因与西瓜、西葫芦等瓜类蔬菜18SrRNA基因同源性大都在90%以上;以中国南瓜内参基因18SrRNA核苷酸全长序列为基础设计1对荧光定量PCR引物,以中国南瓜果肉总RNA逆转录的cDNA第一链为模板进行PCR扩增,该引物扩增的片段大小为132bp,扩增效率高,特异性强;18SrRNA基因在中国南瓜不同组织、生长发育阶段及非生物胁迫条件下均能稳定表达。【结论】克隆获得中国南瓜18SrRNA基因,该基因适合在中国南瓜基因表达研究中作为内参基因。     

菠菜非生物胁迫下实时荧光定量PCR分析中内参基因的选择

为筛选适宜菠菜不同胁迫下基因表达水平分析的内参基因,本研究选取ACT11、ACT2/7、G6PD、ELF1B、UBC2、TUB、TUA和CYP2共8个常用内参基因作为候选内参基因,利用实时荧光定量PCR技术,通过ge Norm、Norm Finder、Best Keeper软件分析和评价其在不同胁迫下菠菜幼苗中的表达稳定性。结果表明,8个候选内参基因在不同胁迫处理下菠菜幼苗中的表达丰度及稳定性存在差异,Na Cl和高温胁迫下G6PD表达稳定性最好,PEG胁迫下ELF1B表达稳定性最好。本研究结果可为菠菜非生物胁迫下相关基因的功能分析和基因差异表达研究提供有效的校正工具。     

大豆不同发育时期及非生物胁迫下实时荧光定量PCR内参基因筛选

为研究大豆在不同发育时期的不同组织、不同非生物胁迫下稳定表达的最适内参基因,以大豆“JN28”V1时期的根、茎、叶,R3、R4时期的豆荚,R5、R8时期的子粒,干旱、低温、盐、脱落酸（ABA）胁迫下的根和叶共15个样本为试验材料。选择8个候选内参基因（Actin,β-actin,CYP2,EF1-α,Fbox,GAPDH,TUB4,18SrRNA）进行实时荧光定量PCR检测,并分析8个候选内参基因表达的稳定性。利用geNorm、NormFinder、BestKeeper软件分析后,再经过RefFinder计算筛选出合适的内参基因。结果表明：4个软件的分析结果不同,以RefFinder综合分析结果显示,V1期的根和叶、R3期的豆荚、ABA胁迫下的根,最适的内参基因为Actin;V1期的茎、R4期的豆荚、R8期的子粒,最适内参基因为EF1-α;R5期的子粒、干旱胁迫下的叶,最适内参基因为Fbox;干旱胁迫下的根,最适的内参基因为CYP2;盐胁迫的根、ABA胁迫下的叶,最适内参基因为18SrRNA;低温胁迫下的叶,最适内参基因为β-actin;低温胁迫下的根,最适内参基因为EF1-α和18S...     

水曲柳TCP4转录因子克隆及胁迫和激素下的表达分析

TCP转录因子家族是植物特异的一类调控生长发育和逆境胁迫的重要转录因子。本文揭示了水曲柳FmTCP4在非生物胁迫及激素信号诱导调控的表达特征,为该基因在水曲柳中调控生长发育以及逆境胁迫响应功能的研究奠定基础。通过前期研究克隆获得了水曲柳TCP4基因序列,并命名为FmTCP4,应用生物信息学软件对水曲柳FmTCP4基因的分子结构特征进行了分析,利用4 ℃低温、盐(NaCl)以及干旱(PEG6000)进行非生物胁迫处理,利用脱落酸(ABA)和赤霉素(GA₃)进行激素信号诱导,分析FmTCP4基因的表达特征。生物信息学分析表明该基因全长1 251 bp,具有完整的开放阅读框,编码416个氨基酸。FmTCP4具有螺旋-环-螺旋结构,为亲水性的不稳定蛋白,不存在信号肽,具有跨膜能力,亚细胞定位预测存在于细胞核中,并在细胞质到细胞核的调控中起作用。同源序列比对结果表明,FmTCP4与芝麻、烟草等物种的同源蛋白序列相比具有很高的同源性。非生物胁迫处理后,FmTCP4的表达量随处理时间而改变,但其变化趋势不同,表明FmTCP4明显响应了这3种非生物胁迫。激素信号诱导结果表明,外源植物激素调控了FmTCP4基因的表达,基因表达量相对于对照组具有显著性差异。非生物胁迫和激素信号诱导下的基因表达分析表明,FmTCP4响应了寒冷、盐、干旱等非生物胁迫以及激素信号,说明其参与了植物的生长发育和逆境胁迫的平衡。      

二倍体和四倍体泥鳅qRT-PCR分析中内参基因优选

为筛选在泥鳅中稳定表达的内参基因,以确保泥鳅基因表达分析结果的可靠性,选取ACTB、TUBA、EF1A、GAPDH、TUBB和18SrRNA 6个常用的内参基因作为候选内参基因,分别用BestKeeper、geNorm、NormFinder、ΔCt和RefFinfer软件分析这6个基因在二倍体和四倍体泥鳅胚胎发育阶段、成鱼组织间以及倍性间表达的稳定性。结果显示,在胚胎发育各阶段,TUBB和TUBA的表达最稳定,可作为胚胎发育阶段qRT-PCR分析的内参基因;其中,TUBB在泥鳅倍性间的表达差异不显著,因此,可作为泥鳅胚胎发育中跨倍性qRT-PCR研究的内参基因。在成鱼各组织中,ACTB和18SrRNA的表达最稳定,可用作组织间qRTPCR分析的内参基因;其中,18SrRNA在倍性间的组织表达差异不显著,因此,可作为泥鳅组织间跨倍性qRTPCR的内参基因。     

高粱SbNAC0584基因克隆与表达分析

NAC转录因子是植物体特有且在调控植物生长发育、抵抗逆境胁迫等方面具有重要生物功能的转录调控因子。本研究从高粱中克隆得到一个受逆境胁迫诱导表达的NAC家族基因,系统进化分析结果表明该基因与玉米Zma NAC0584亲缘关系最近,故将其命名为SbNAC0584;SbNAC0584基因全长929 bp,编码290个氨基酸,氨基酸序列比对结果表明SbNAC0584蛋白N-末端具有典型的NAC保守结构域,C-末端为序列高度多样性的转录调控结构域。采用实时荧光定量PCR技术分析SbNAC0584基因对不同非生物逆境胁迫的应答模式,结果表明SbNAC0584受NaCl、脱水、PEG胁迫和植物激素ABA诱导表达上调,推测SbNAC0584在高粱非生物胁迫应答过程中发挥重要作用;组织特异性表达分析结果表明SbNAC0584在高粱旗叶和根中表达量相对较高。本研究为深入研究SbNAC0584的抗逆生物学功能奠定基础。     

2个柽柳Prx基因的克隆及表达分析

过氧化还原蛋白（Prxs）是植物体内重要的抗氧化酶。为深入研究Prx基因在柽柳非生物胁迫中的作用,从柽柳cDNA文库中获得了2条Prx的单一序列ThPrx1与ThPrx2,其中ThPrx1为部分序列,ThPrx2为全长序列。生物信息学分析表明,2条ThPrx与植物Prx同源基因的氨基酸序列具有较高的同源性,并且ThPrx1和ThPrx2分别属于Prx的PrxⅡ和2-Cys Prxs亚家族。通过实时定量PCR对这2个ThPrx基因在不同非生物胁迫（NaCl、PEG、CdCl2、低温及ABA）处理的柽柳根和叶中的表达模式分析显示, 2个ThPrx基因在胁迫下的表达模式不同:NaCl、PEG和ABA均能够诱导ThPrx1基因在根中的表达,而CdCl2和低温胁迫则抑制了该基因在根和叶中的表达;ThPrx2基因在低温处理的柽柳中的表达量下降,其他胁迫处理不同程度上影响了ThPrx2基因的表达。结果表明,ThPrx1与ThPrx2是2个新的Prx基因,推测其可能参与植物的逆境胁迫过程。      

玉米ZmWRKY41基因克隆及转录激活验证

[目的]干旱是影响作物生长发育及产量的重要因素。植物WRKY转录因子超家族在植物的生长发育、响应逆境胁迫过程中发挥着重要作用。因此,克隆分析玉米WRKY转录因子的序列特征和功能,为研究玉米耐逆分子育种提供重要抗逆基因资源。[方法]本研究以玉米自交系B73为材料提取玉米总RNA反转录cDNA,克隆、分离获得ZmWRKY41基因编码区全长序列。DNAMAN比对发现,ZmWRKY41蛋白具有保守结构域WRKYGQK和锌指结构域(zinc-finger motif)C2HC,属于第三类WRKY转录因子家族。利用生物信息学方法研究该基因蛋白质理化性质,并对其进行结构分析预测。利用PlantCARE在线工具预测、鉴定ZmWRKY41基因启动子区是否含有响应非生物胁迫的顺式作用元件。将ZmWRKY41基因编码区全长序列构建pGBKT7诱饵载体上,与GAL4DNA结合域融合,转化酵母菌株AH109验证ZmWRKY41转录因子转录激活活性。[结果]玉米ZmWRKY41基因编码区全长774bp,含有长度分别为221bp、126bp、427bp 3个外显子,共编码257个氨基酸序列。蛋白质高级结构预测发现,ZmWRKY41蛋白包含2个α-螺旋结构和5个β-折叠结构,不含跨膜结构和信号肽。ZmWRKY41基因启动子元件预测发现,该启动子中含有干旱胁迫(CGGTCA)、热胁迫(AAAAAATTTC)、低温胁迫(CCGAAA)等非生物逆境胁迫响应相关的顺式作用元件。酵母转录激活验证实验显示,将含有pGBKT7-ZmWRKY41融合表达载体转化酵母AH109菌株,能在单缺、三缺培养基正常生长且能使α-半乳糖苷酶底物分解显蓝色,表明ZmWRKY41基因具有转录激活活性。[结论]玉米ZmWRKY41基因是WRKY转录因子基因家族成员之一,在酵母体内具有转录激活活性,可能参与响应非生物逆境胁迫,为进一步研究该转录因子调控非生物逆境胁迫奠定基础。     

荒漠植物花花柴耐高温相关基因HTR的克隆及表达模式分析

非生物胁迫是导致作物减产甚至植株死亡的重要因素。在所有非生物胁迫因子中，温度是影响植物生长发育的重要因子之一。本研究从荒漠植物花花柴高温胁迫转录组数据中筛选出HTR基因家族，为深入探究该基因家族的结构和功能，克隆了花花柴KcHTRs基因家族的8个成员，重点分析了KcHTR3、KcHTR4基因在高温胁迫下的表达模式。结果发现KcHTR3全长780 bp，编码259个氨基酸，KcHTR4全长771 bp，编码256个氨基酸，KcHTR3、KcHTR4于45℃处理4 h时，在叶器官中表达量最高，两个基因的表达均呈高-低-高的趋势，表明植物在应对高温胁迫时表现出耐受-响应-适应的能力，这为荒漠植物抗逆基因资源的挖掘与利用提供了研究基础。     

金纹细蛾β-actin基因克隆及表达分析

为了明确β-actin基因在金纹细蛾定量实验中作为内参基因的可靠性。根据近缘物种同源基因设计简并引物,通过RT-PCR技术克隆得到金纹细蛾β-actin基因片段,并进行序列分析;利用QRT-PCR方法检测该基因在金纹细蛾不同发育时期及成虫5种组织间的表达情况。结果表明:金纹细蛾β-actin基因片段为594bp(GenBank登录号:KF880733),编码174个氨基酸残基,具有actin蛋白家族典型特征,富含4种类型特定功能位点,其氨基酸序列与其他鳞翅目昆虫的相似性均大于96%。金纹细蛾β-actin基因在其生长发育阶段稳定表达,无显著差异,可以作为研究金纹细蛾不同发育时期的内参;在成虫头、胸、足和翅4种组织间表达量无显著差异。     

用于荔枝qPCR分析的内参基因克隆及稳定性分析

利用基因克隆和测序,从‘妃子笑’荔枝果皮中获得了β-Actin、GAPDH和18S rRNA 3个qPCR分析常用的内参基因全长序列,其长度分别为1 273、1 368和1 712 bp;3个基因与其他物种高度同源,氨基酸序列相似性均超过了98%.在此基础上,结合已报道的UBQ、eEF和25S rRNA 3个常用的内参基因,对β-Actin、GAPDH、18S rRNA,UBQ、eEF和25S rRNA 6个常用内参基因在荔枝果实发育不同阶段和外源生长调节剂处理后表达稳定性进行了分析,同时比较了geNorm、Norm Finder和BestKeeper 3种不同算法的差异.结果表明:以上6个基因中,β-Actin基因在3种不同算法下均保持了较好的表达稳定性.     

马尾松PmMYB169基因的克隆及表达分析

MYB基因家族在植物生长发育和应答逆境胁迫中有重要作用.通过RT-PCR和RACE技术从马尾松中克隆获得了PmMYB169全长cDNA序列,分析了其在低磷胁迫下的表达特性.PmMYB169全长为1 407bp,开放阅读框为927bp,编码308个氨基酸.生物信息学分析表明,PmMYB169蛋白序列中存在MYB家族结构区域,属于R2R3类MYB转录因子;同源性分析表明,PmMYB169在MYB家族保守区域上同源性较高,它与北美云杉亲缘关系最近.荧光定量PCR对低磷胁迫下PmMYB169的表达分析结果表明,PmMYB169的表达量随低磷胁迫时间延长呈上调趋势,说明PmMYB169参与了低磷胁迫应答;对不同组织的表达分析发现,PmMYB169为组成型表达,在马尾松根茎叶中均有表达,以叶的表达量最高.     

金魁猕猴桃RT-qPCR内参基因的筛选

以'金魁'猕猴桃(Actinidia deliciosa)根、茎、叶、花瓣、花萼、雌蕊、子房、幼果为材料,应用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)技术分析了ACT、CYP2、RP2、GAPDH、TUB和TUA 6个常用内参基因在猕猴桃不同器官组织中的表达情况,并利用GeNorm、NormFinder和BestKeeper软件对候选内参基因的稳定性进行了评价。结果表明:ACT和TUA基因在各组织中的表达量差异较小,表达相对稳定;在利用RT-qPCR分析比较猕猴桃不同器官组织中的基因表达差异时,可选择ACT作为内参基因。     

应答非生物胁迫的甘蔗硫氧还蛋白基因ScTRXh2的克隆

从甘蔗蔗茎cDNA文库中获得1个TRXⅠ类第3亚组成员的硫氧还蛋白家族基因全长cDNA序列,命名为ScTRXh2(登录号:KF921298).该基因全长752 bp,开放阅读框长381 bp,5'非翻译区长57 bp,3'非翻译区长314 bp,编码126个氨基酸残基,氨基酸序列与拟南芥TRXs具有高度同源性.实时定量PCR检测显示,该基因在甘蔗中为组成型表达,叶片和蔗茎中的表达量显著高于根和芽.在H2O2和PEG逆境胁迫下,甘蔗ScTRXh2基因的应答模式基本相同,呈现初期(3 h)略微下调,早中期(6 h或12 h)表达量明显上调,中后期(24、48、72 h)显著下调并维持基本稳定的低水平表达.甘蔗ScTRXh2基因对NaCl胁迫的应答较快,虽然也呈现中期(12 h)表达量显著上调,后期(24、48、72 h)显著下调并维持基本稳定的低水平表达,但表达模式与H2O2和PEG胁迫应答有明显不同,表现在胁迫初期(3 h)基因表达显著下调.上述结果提示,甘蔗ScTRXh2基因积极应答非生物逆境H2O2、PEG和NaCl的胁迫,在应答的基因表达谱模式上存在一些差异.     

杜梨响应盐胁迫CIPK01的克隆及表达分析

CBL互作蛋白激酶(CIPK,CBL-interacting protein kinases)是与钙调磷酸酶B类蛋白(CBL,calcineurin B-like protein)特异结合的蛋白激酶,广泛参与植物的生长发育以及生物和非生物胁迫响应。克隆和鉴定杜梨响应盐胁迫的CIPK基因,对杜梨抗逆分子机制和抗逆性研究具有重要意义。选取了一个特殊的基因PbCIPK01做进一步的研究,通过生物信息学和实时荧光定量PCR技术分析该基因的序列特征以及在盐胁迫下的表达模式。该基因全长为1 368 bp,含有1 365 bp的开放阅读框,编码455个氨基酸,DNA序列为5 051 bp,包含12个外显子和11个内含子。实时荧光定量PCR分析结果表明,该基因在杜梨的叶片中表达量最高,且受盐胁迫诱导下调表达。     

甘蔗B12D基因全长cDNA克隆与表达分析

对甘蔗(Saccharum officinarum L.)茎全长cDNA文库进行大规模测序,获得了B12D基因的全长cDNA序列,命名为ScB12D(GenBank Accession number:KF714497)。生物信息学分析表明,该基因全长771 bp,编码87氨基酸(ORF,104~367 bp);该基因编码的蛋白无信号肽,为亲水性非分泌型蛋白;有1个B12D家族保守结构域,二级结构为无规则卷曲;基因定位于质膜,参与能量代谢。同时,甘蔗ScB12D基因在不同物种间具有一定的保守性,在近缘植物中具有高度的保守性,与单子叶禾本科植物玉米、粟米、高粱及水稻的同源性超过90%,与双子叶甘薯和山茶的同源性在70%左右。荧光定量PCR表达分析结果表明,甘蔗ScB12D基因在根、蔗芽、茎(包括蔗皮和蔗髓)、叶片和叶鞘等组织中组成型表达,其中在叶鞘和根中表达量较高;在生物胁迫黑穗病胁迫下,该基因的表达量在所有时间段均呈下调趋势;在非生物胁迫时,该基因的表达受NaCl胁迫后表达量最高,在ABA胁迫下表达量次之,推测该基因的表达可能与甘蔗响应生物和非生物胁迫的机制有关。     

火龙果UQT和18s rRNA内参基因片段的克隆及表达分析

本文基于植物UQT和18s rRNA基因的保守区设计简并引物,克隆了UQT基因和18s rRNA基因,分别命名为Hu UQT和Hu18s rRNA。生物信息学分析表明,Hu UQT基因c DNA序列为271 bp,编码87个氨基酸;Hu18s rRNA基因c DNA序列为209 bp。Hu UQT基因片段与其他植物UQT基因核苷酸序列的同源性均在78%以上;Hu18s rRNA基因片段与其他植物Hu18s rRNA基因核苷酸序列的同源性均在98%以上。RT-PCR结果显示,Hu UQT基因和Hu18s rRNA基因不仅在火龙果不同种质之间表达稳定,而且在干旱胁迫不同时期的样品中表达稳定。因此,UQT基因和Hu18s rRNA基因可以作为内参基因用于火龙果抗逆性和生长发育过程中基因表达规律研究。     

大豆转录因子GmDof1.5的克隆与非生物胁迫诱导表达

Dof转录因子在植物的生长发育和非生物胁迫响应中起重要的调控作用。利用RT-PCR技术从大豆中克隆了一个功能未知的Dof转录因子基因GmDof1.5,该基因位于大豆基因组15号染色体上,ORF全长540 bp,编码含有179个氨基酸的蛋白质,相对分子质量为20.15 ku,等电点为9.82。蛋白序列预测发现,GmDof1.5蛋白含有一个典型Zf-Dof结合域,且含有大量磷酸化位点。蛋白系统进化分析表明,大豆GmDof1.5与豆科植物鸡血藤SsDof4的亲缘关系最近。实时荧光定量PCR结果显示,ABA、干旱、高盐、高温和低温胁迫均可不同程度地诱导GmDof1.5的表达,且GmDof1.5对高温胁迫的响应最为显著。     

枸杞胆碱单加氧酶基因的克隆与表达分析

根据CenBank中的植物胆碱加氧酶(CMO)基因的同源保守区设计简并引物,采用RT-PCR技术从枸杞中扩增出CMO基因的保守序列,并利用巢式PCR、5'-RACE和3'-RACE获得全长CMO.测序结果表明,CMO全长1540 bp,包含1284 bp长的开放读码框(ORF),编码1个含427氨基酸残基、分子量为48.48 kDa、等电点(pl)为5.97的假定蛋白质.此序列Genbank登录号为FJ514800.mRNA分析表明,CMO基因在枸杞幼苗组织中受高盐胁迫和低温胁迫的上调诱导表达,表明该基因可能在植物抵御非生物胁迫中发挥重要作用.