小麦WZY2基因RNA干扰表达载体的构建及遗传转化

【目的】利用基因枪将WZY2基因RNA干扰表达载体pAHC-WZY2-Ri导入"郑引1号"小麦,获得WZY2基因表达缺失型小麦,为深入分析WZY2基因功能奠定基础。【方法】以植物表达载体pAHC25为基础,构建含有反向重复序列的RNA干扰表达载体pAHC-WZY2-Ri,利用基因枪将其转入"郑引1号"小麦幼胚愈伤组织中,经过筛选、PCR检测得到阳性植株。【结果】从转化的1 500个愈伤组织中获得27株再生植株。利用PCR对再生植株进行检测,获得阳性植株3株,转化率为0.2%。【结论】构建了WZY2基因的RNA干扰表达载体,成功地将WZY2基因RNA干扰表达载体导入"郑引1号"小麦,获得阳性植株。     

基因枪法介导转ZmalⅠ基因小麦植株的获得和鉴定

【目的】获得转玉米ZmalⅠ基因的安全转基因小麦植株,为研究玉米ZmalⅠ基因在增加小麦籽粒大小和粒质量方面的作用,以及利用基因工程提高小麦产量奠定基础。【方法】以陕农138为供试材料,绿色荧光蛋白基因(GFP)为安全标记基因,利用基因枪法,将由谷蛋白胚乳特异表达启动子启动的ZmalⅠ+GFP融合蛋白基因的过表达载体pGlu-exbessa::ZmalⅠ导入小麦中,并对转基因小麦进行PCR检测。【结果】采用基因枪法共轰击3 000个幼胚,获得再生植株59株,移栽至培养钵后成活52株,成活率为88.1%;利用载体上安全标记基因GFP的特异引物对成活的转化植株进行PCR检测,获得含有GFP基因的阳性安全植株16株,转化率为0.53%。【结论】将ZmalⅠ基因成功地整合到了小麦基因组中。     

基因枪法介导的转KN2基因小麦的获得及鉴定

【目的】获得转KN2基因的小麦植株,为研究KN2基因对提高转基因小麦抗寒性的作用,以及为利用基因工程提高小麦抗逆性奠定基础。【方法】以弱冬性小麦品种小偃22为供试材料,通过基因枪法,用含有KN2基因的植物表达载体和筛选标记基因bar共转化小麦幼胚愈伤组织,经过除草剂(Phosphinothricin,草丁膦)筛选和愈伤组织分化获得再生植株,并对得到的再生小麦植株进行PCR检测。【结果】采用基因枪法共轰击小偃22的幼胚愈伤组织1 680个,共获得再生植株17株,移栽到花盆中成活15株;根据目标基因序列设计特异引物,对成活的小麦植株进行PCR检测,结果表明获得含有bar基因和KN2基因的转基因阳性植株分别为6株和4株,转化率分别为0.36%和0.24%,bar和KN2的共转化率为0.24%。【结论】KN2基因成功地转入到小麦品种小偃22中。     

籽粒硬度Pinb基因反义表达载体构建及遗传转化

籽粒硬度是小麦品质改良的重要目标性状.利用含有Ubi启动子、Bar表达盒的基础质粒pAHC25,构建了含有Pinb基因的植物反义表达载体pAHantipB,其中pAHantipB载有小麦籽粒硬度Pinb基因的反向序列,可用于小麦遗传转化,利用花粉管通道法将其转入软质小麦品种京411,获得1株转基因植株,T1代转基因植株抗性筛选及PCR12检测结果表明,转化率为0.17%.基因组DNA斑点杂交证实了外源基因在受体小麦基因组中的整合.     

中间偃麦草RAR1基因的分离及其在小麦背景中的功能分析

 【目的】RAR1是大麦抗白粉病基因和多种植物抗病（resistance, R）基因介导的抗病信号途径中的重要信号元件。为明确RAR1在小麦抗白粉病反应中的作用，为小麦广谱抗病分子育种提供基因资源，开展了本研究。【方法】采用生物信息学技术、RT-PCR和RACE方法分离克隆中间偃麦草RAR1基因，通过酶切和连接构建该基因的单子叶高效表达载体，采用基因枪法转化小麦，对转基因小麦植株进行分子检测、表达分析和抗病鉴定。【结果】分离克隆出中间偃麦草RAR1基因，其编码蛋白具有典型的RAR1功能结构域；构建了中间偃麦草RAR1基因的单子叶高效表达载体pUBI∷RAR1；用基因枪法轰击小麦推广品种扬麦12幼胚愈伤组织1 545个，获得152株再生植株，通过PCR检测出阳性植株18株，转化率为1.17%；对T1、T2代转基因材料进行PCR检测、RT-PCR分析和白粉病抗病鉴定，结果表明转入的RAR1基因能够在小麦背景中遗传，RAR1基因的超量表达可提高小麦对白粉病菌的抗性、拓宽小麦的抗病谱。【结论】分离出中间偃麦草RAR1基因，RAR1基因在小麦中超量表达可提高小麦对白粉病菌的抗性、拓宽其抗病谱，可以作为小麦白粉病广谱抗性分子育种的潜在的重要基因资源。     

转cry1Ab13基因玉米新种质的创制

【目的】构建包含抗鳞翅目害虫基因cry1Ab13的重组植物表达载体,并利用其创制对玉米螟Ostrinia furnacalis具有优良抗性的转基因玉米Zea may L.新种质。【方法】利用同源重组法将cry1Ab13基因连接到表达载体pCAMBIA3300-Bar上,获得以抗除草剂Bar基因为筛选标记的植物表达载体pCAMBIA3300-cry1Ab13-Bar。通过农杆菌介导法转化玉米自交系H99幼胚,对再生植株进行逐代除草剂筛选、PCR检测及T2代植株的Southern blotting检测、实时荧光定量PCR检测,并对转基因植株进行田间及室内抗虫性鉴定。【结果】构建了cry1Ab13基因的植物表达载体,转化玉米获得3株高抗玉米螟和1株抗玉米螟的T2代转基因植株。Southern blotting证明cry1Ab13基因已经整合到玉米基因组中,实时荧光定量PCR结果表明cry1Ab13基因已经在玉米植株内表达。抗虫性鉴定结果表明,与对照相比转基因植株对玉米螟的抗性显著提高。【结论】将cry1Ab13基因导入玉米并成功表达,显著提高了转基因玉米对玉米螟的抗性,为抗虫玉米新种质的创制奠定了基础。     

利用RNAi技术抑制籽粒PPO合成改良小麦面粉白度的研究

【目的】通过RNAi策略抑制小麦籽粒ppo的表达,获得籽粒PPO酶活性低、白度高的转基因小麦新种质。【方法】构建了以小麦胚乳特异表达启动子1Dx5启动子驱动的籽粒ppo的RNAi载体pBAC47P-ppoIR,利用基因枪将该载体与含bar的表达载体基因枪共转化中优9507幼胚愈伤组织,获得T0转基因植株。通过分子鉴定（PCR、Southern杂交、半定量RT-PCR、Northern杂交）、酶活筛选和白度测定等方法对转基因植株及其后代株系进行筛选。【结果】获得了27株阳性T0转基因植株。转基因植株及其后代经PCR和Southern杂交检测表明,RNAi构件已经稳定整合到T1的12个株系中。半定量RT-PCR和Northern杂交结果表明有20株T2籽粒中ppo表达水平明显低于对照。对转基因T2灌浆期籽粒进行PPO同功酶活性分析表明,有6个株系的PPO活性有所减弱。对T4籽粒的面片白度测定表明,5个株系的白度均比对照有所提高,其中2个株系效果显著。【结论】RNAi技术的表达能抑制籽粒ppo表达,降低PPO同功酶的活性,明显提高小麦面片白度,从而为小麦面粉白度的改良、品质育种提供了材料。     

基因枪介导的转PYL5基因小麦的获得与鉴定

【目的】通过基因枪介导共转化,获得转拟南芥抗旱基因PYL5的小麦植株,为转基因小麦的抗旱功能研究奠定基础。【方法】以小麦品种西农889、绵阳19和宁春16为供试材料,通过基因枪介导法将诱导型启动子Rd29A启动的PYL5基因和筛选标记基因Bar共转化到小麦幼胚愈伤组织中,经过除草剂PPT(Phosphinothricin)筛选和愈伤组织分化,获得再生植株。根据目标基因PYL5和Bar基因序列分别设计特异引物,对移栽成活的小麦T0代再生植株进行基因特异性PCR检测。【结果】采用基因枪分别轰击西农889的1800个、绵阳19的800个和宁春16的800个幼胚愈伤组织,经过筛选和分化分别获得了9,5和14株小麦再生植株;对转基因小麦T0代再生植株的基因特异性PCR检测结果表明,西农889、绵阳19和宁春16 Bar基因的转化率分别为0.280%,0.500%和0.750%,PYL5基因的转化率分别为0.110%,0.125%和0.500%,Bar和PYL5基因的共转化率分别为0.110%,0.125%和0.500%。【结论】PYL5基因成功转入到了小麦品种西农889、绵阳19和宁春16中。     

转LTP基因T_0代小麦的获得及抗条锈病鉴定

以小麦生产品种小偃22、科农199和西农1376为受体品种,植物抗菌蛋白基因LTP作为目的基因,构建pAHC25-LTP表达载体,利用基因枪法转化小麦幼胚愈伤组织,获得转LTP基因T0代小麦1247株。经草铵膦(Phosphinothricin,PPT)抗性筛选及PCR分子检测,获得阳性再生植株209株,转化率1.87%。阳性再生植株接种条锈菌CYR29、CYR31和CYR32混合小种后进行抗条锈病鉴定,获得抗性植株74株,其中抗性显著提高的抗病植株11株。本研究初步证明抗菌蛋白基因LTP在小麦抗条锈病菌的侵染中有一定作用,为获得转抗菌蛋白基因的抗条锈病小麦品种奠定基础,以期获得育种中可应用的新型抗源材料。     

小麦大龄幼胚再生性能改进与农杆菌转化

 【目的】小麦幼胚再生率与幼胚大小关系密切,改进小麦大龄幼胚再生性能促进小麦转基因研究。【方法】以18个普通小麦基因型和5个硬粒小麦基因型为材料,对其开花授粉后15—17 d的大龄幼胚进行破碎处理、组织培养和农杆菌转化,对转化后的幼胚组织和获得的抗性再生植株分别进行组织化学染色检测和PCR检测。【结果】大龄幼胚培养2 d后破碎处理的再生率为18.2%,显著高于完整胚对照(.7%),培养2 d后进行破碎处理的再生效果高于4和6 d后破碎处理;不同基因型小麦大龄幼胚破碎处理后再生率为16.9%—46.7%,其中,Bobwhite和中8423大龄幼胚再生率达到了40%以上;大龄幼胚破碎后在弱光条件下培养,再生率进一步提高,较对照(完整胚黑暗培养)提高5.4%—47.4%;农杆菌侵染后GUS瞬时表达率为0—76.7%,其中科农199高达76.7%,其次为Verry(64.4%)和Alondra(47.2%);经PCR检测,农杆菌转化小麦大龄破碎幼胚获得了候选转基因植株。【结论】破碎处理和弱光培养显著提高了小麦大龄幼胚再生率,比对照提高5—10倍;科农199、Verry和Alondra大龄幼胚对农杆菌侵染比较敏感,适宜作为农杆菌转化的受体材料;农杆菌转化小麦大龄幼胚可以获得转基因植株。     

小麦puroindoline及其相关基因分子遗传基础研究进展

籽粒硬度是重要的小麦品质性状之一,对小麦的磨粉品质和加工品质有重要影响。控制籽粒硬度的主效基因puroindoline位于5D染色体的短臂上,可分为Pina和Pinb2种类型。Pina和Pinb紧密连锁,编码区均为447个碱基,没有内含子,共同形成小麦籽粒硬度的分子遗传基础。目前,普通小麦和山羊草中均已发现多种puroindoline变异类型,其中引起小麦籽粒硬度大幅度升高的Pina-D1b类型的分子机制为从编码区第23个碱基开始缺失15380个碱基。Puroindoline除了对小麦籽粒硬度有重要影响之外,对其它品质性状也有重要影响,不同puroindoline变异类型之间小麦品质具有一定差异。另外,与puroindoline紧密连锁的Gsp-1基因变异类型更为丰富,但对籽粒硬度没有明显的调节作用。最近发现的与puroindolineb高度同源的基因Pinb-2v具有4种类型,分别位于小麦7A、7B和7D染色体上,可能对籽粒硬度具有微效的调节作用。本文通过对puroindoline的分子特征和突变类型以及相关功能进行分析和总结,旨在为中国小麦品质的基因工程改良提供参考。     

Rht基因对春小麦和硬粒小麦离体单雄生殖的影响

研究了离体条件下Ｒｈｔ基因对单雄生殖的影响。选用Ｒｈｔ基因的不同等位基因品系作为抗体材料,包括以砚小麦为背景的Ｒｈｔ１,Ｒｈｔ３、Ｒｈｔ１４及以硬粒小麦Ｃｈａｒｋｏｖｓｋａｙａ ４６为背景的Ｒｈｔ１４和Ｒｈｔ１。结果表明：不同的Ｒｈｔ遗传体系对愈伤诱导频率和植株再生率的影响不同。在砚小麦中,显性Ｒｈｔ５基因对单倍体产生的所有阶段都有明显的正向效应。而在硬粒小麦中,显性的Ｒｈｔ１４基因与其它秭妹相比     

小麦籽粒硬度及其分子遗传基础研究回顾与展望

 籽粒硬度是最重要的小麦品质性状之一，是市场分级和定价的重要依据。随着硬度测试方法的日趋完善，其分子遗传基础的研究逐步加快。硬度主要受位于5D染色体短臂上一个主效基因和多个微效基因控制，Pina和Pinb是形成小麦籽粒硬度的基础。PINA蛋白的缺失或编码PINB蛋白的基因突变均造成小麦胚乳质地变硬。中国目前该项研究较少，与国外相比仍有很大差距，本文着重阐述了小麦胚乳结构及硬度的生化和遗传基础，旨在为我国小麦籽粒硬度的研究提供理论依据。     

Primary studies on tissue culture from mature embryos in diploid and tetraploid wheat

Using mature embryos (MEs) as the explants, the callus induction, embryogenic callus differentiation, plantlet regeneration and culture efficiency in diploid and tetraploid wheat of four genotypes were studied. The tested four genotypes wheat included cultivable emmer wheat (Triticum dicoccum Schuble), durum wheat (Triticum durum Desf.) and the common wheat progenitors Triticum dicoccoides and Triticum aegilopides. Results indicated that there were significant differences in the efficiency of callus induction, callus differentiation and plant regeneration among the tested genotypes. The efficiency of differentiation and regeneration shows strong genotype dependence. The rates of callus induction, embryogenic callus differentiation, plantlet regeneration and culture efficiency respectively were 95.00%, 90.00%, 32.40%, and 27.70% in cultivable emmer wheat, which were significantly higher than other tested genotypes. Therefore, this study has provided a basis for genetic transformation, gene cloning and molecular plant breeding in wheat and other related species. __________ Translated from Molecular Plant Breeding, 2007, 5(4): 480–484 [译自: 分子植物育种]     

小麦幼胚愈伤组织的遗传转化

将从水稻中提取的抗性调节转录因子OsDREB2.2基因,通过农杆菌介导进入小麦组织细胞内的方法,培育筛选稳定遗传的植株,使小麦中的一系列抗性基因得以表达,从而培育出抗逆性强的小麦新品种。采用河北农业大学自主培育的小麦新品种河农825、河农827、河农831等为试验材料,以各自幼胚为外植体,诱导的愈伤侵染农杆菌后,获得的抗性愈伤组织数平均为170.44、分化愈伤数平均为24.56、抗性芽与转化幼胚总数的比例平均为0.96%。表明本研究中采用的愈伤组织诱导、农杆菌侵染和植株再生条件是适宜的。     

Study on Plant Regeneration of Wheat Mature Embryos Under Endosperm-Supported Culture

To reveal the suitability of using mature embryos as an explant source in wheat tissue culture, mature embryos from eight common wheat cultivars （Triticum aestivum L. cv.） were cultured with or without endosperm to test their efficiency of callus induction and plant regeneration. When embryos were cultured together with endosperm （endosperm-supported culture, ES）, the percentage of callus induction was significantly lower than that when embryos were cultured in the absence of endosperm （non-endosperm-supported culture, NES）. This pattern was evident in most genotypes, regardless of whether 2 or 8 mg L^-1 2,4-D was added in the NES culture. However, in ES culture, more induced calli were differentiated into distinct green spots and they further developed into plantlets. Thus, more plants were regenerated in ES culture than in the NES treatment. Most of the eight tested genotypes showed a significant difference in callus induction rate and plantlet regeneration in both ES and NES cultures. In addition, the enzymatic activity of oxalate oxidase in the callus of ES culture condition was obviously higher than that in the callus of NES culture condition, suggesting that the activity of oxalate oxidase may be a parameter for selection of calli with potential for plantlet regeneration. These results indicate that wheat mature embryos are valuable explants for highly efficient callus induction and plant regeneration, if proper treatment and medium are used.     

Dicamba and Sugar Effects on Callus Induction and Plant Regeneration from Mature Embryo Culture of Wheat

To establish a highly efficient plant regeneration system for wheat genetic transformation, the effects of three different concentrations of dicamba and two different sugar types on callus induction and plant regeneration from mature embryo cultures were evaluated. Callus induction and plant regeneration were obtained from mature embryos of two commercial cultivars Zhoumai 18 and Yumai 34 （Triticum aestivum L.） cultured on L3 basal medium. The results showed that the efficiency of mature embryo culture was significantly influenced by the genotypes, sugar types and dicamba concentrations. 4 mg L^-1 dicamba proved the best effective for inducing embryogenic callus and also gave the highest proportion of plants regenerated across the two cultivars. Substitution of maltose by sucrose significantly improved the plant regeneration efficiency in both cultivars. There was a significant interaction between genotype-by-sugar types, and sugar types-bydicamba concentrations. Overall, Zhoumai 18 gave the highest frequency of plant regeneration （82.65%） when dicamba concentration was 4.0 mg L^-1 and with sucrose in initial callus induction. These results will facilitate genetic transformation work with elite wheat.     

小麦愈伤组织诱导及其再生能力影响因素的研究

以农艺性状较好的24份小麦品种(系)为材料，筛选出了愈伤组织诱导率高且植株再生能力强的基因型材料山农995604和F281—10，在此基础上对影响愈伤组织的分化能力以及较长时间保持分化能力的因素进行了研究。结果表明，在愈伤组织的继代过程中，保持较高浓度的2，4—D，或对愈伤组织进行交替继代培养有利于较长时间保持其再生能力。最佳取材时间在开花后15d左右，而对于在开花后25d取的大龄胚，若仅挑取盾片组织进行接种，也可以获得质量较高和再生能力较强的愈伤组织。     

农杆菌介导的小麦转化体系的优化

为建立农杆菌介导的高效小麦遗传转化体系,分析比较了不同小麦栽培品种、不同培养处理条件下的愈伤诱导、分化及转化效率。结果表明:2个长江中下游主推小麦品种扬麦158和华麦13的幼胚愈伤诱导没有差异,但扬麦158形成的胚性愈伤多、分化率及转化率高于华麦13,是优良的农杆菌介导的遗传转化受体基因型。预培养20d的愈伤转化率最高,高渗处理可进一步提高转化率。获得的T0、T1代转基因植株,经PCR分析鉴定,表明外源基因已经整合到小麦基因组中。