百脉根LjIPT3启动子的克隆及表达载体的构建

[目的]为深入研究LjIPT3的表达调控和功能奠定基础。[方法]利用TAIL-PCR技术克隆百脉根IPT基因LjIPT3起始密码子的上游序列,利用生物信息学手段对其序列特征和潜在的调控元件进行分析,并构建启动子表达载体。[结果]利用TAIL-PCR技术成功克隆了LjIPT3基因5′端上游调控序列。将目的片段连接到pMD18-T载体上,获长度为1 910 bp序列,其3′端有部分序列与LjIPT3的5′端相同,证明克隆的片段为LjIPT3起始密码子ATG的上游区域。该序列含有1个TATA-box和3个CAAT-box,还包含光响应元件、MYB结合位点、不同的激素反应元件以及各种胁迫元件,说明该基因的表达可能受多种因素的调控。成功构建了驱动报告基因GUS的植物表达载体。[结论]该研究为研究植物细胞分裂素的合成代谢和植物生长发育的调控奠定了基础。     

DDF2基因克隆及植物表达载体构建

采用CTAB法提取拟南芥叶片总DNA,根据已报道的DDF2基因序列设计并合成1对特异引物,通过PCR扩增得到1条约550 bp的特异片段,把该片段连接到pGEM-T Easy Vector.上进行测序,结果表明:该基因编码区全长546 bp,为开放阅读框,共编码氨基酸181个,与报道序列完全一致.并构建了以CaMV35S为启动子的植物表达载体pBI121-DDF2,采用冻融法将其转入根癌农杆菌,为后期该基因遗传转化花卉,改良花卉品质,并提高其抗逆性打下了一定的基础.     

番茄DNA甲基转移酶SlDNMT2基因RNAi表达载体的构建

DNA甲基化是发生在基因5′端5′-CpG-3′胞嘧啶上的DNA共价修饰作用,可调节基因转录,与植物的生长、发育、成熟、衰老有着密切关系。DNMT2是首先从拟南芥中发现的DNA甲基转移酶。该研究通过NCBI序列比对获得番茄中DNMT2的同源基因SlDNMT2的编码区序列;通过Primer5设计引物,PCR技术扩增获得SlDNMT2基因高度特异性序列(长度约500 bp);利用一系列分子生物学试验研究方法最终成功构建SlDNMT2 RNAi表达载体,并命名为pBI121-35S∷siRNA1-siRNA2。该RNAi表达载体的构建为进一步探究SlDNMT2基因在植物生长发育过程中的功能奠定了一定的理论基础并提供了一条高效、迅速的载体构建途径。     

神秘果素基因合成及其液泡积累表达载体DC-miraculin的构建

在不依赖神秘果(Synsepalum dulcificum Daniell)植物资源的条件下,根据已报道的神秘果素基因序列合成24条寡核苷酸引物,通过重叠延伸PCR法合成了神秘果素全基因。为使神秘果素导向液泡积累,利用菜豆蛋白C末端四肽的液泡定位功能,在人工合成基因的3'末端加入了编码液泡定位短肽的核苷酸序列。将该基因序列插入植物表达载体YH4215,成功构建了神秘果素植物双元表达载体,命名为DC-miraculin。载体上的神秘果素基因由双CaMV35S启动子控制,转基因植物的报告基因为gusA,抗性筛选标记为潮霉素抗性基因hpt。     

细胞分裂素与细胞的分裂增殖

细胞分裂素对细胞的分裂增殖起着重要的调节作用,在细胞周期中的G1/S期,细胞分裂素促进D型细胞周期蛋白CycD的表达;在G2/M期,其作用与CDK的磷酸化有关。植物通过体内细胞分裂素的代谢影响细胞分裂素水平,调节植物生长发育调控基因,影响植物的根尖、茎尖等器官的生长发育。     

蜡梅水通道蛋白基因（CpAQP）分子特征分析及植物表达载体的构建

在已构建的蜡梅花cDNA文库及EST分析的基础上,通过对文库cDNA克隆全长测序,得到了1个蜡梅水通道蛋白基因,命名为CpAQP(GeneBank登录号为：GU433105)。cDNA全长1154 bp,最大ORF 810 bp,编码269个氨基酸。聚类分析和同源性比对表明,该蛋白基因属于TIPs亚族类,具有高度保守的MIP家族结构域。该蛋白具有6个跨膜结构,N-末端和C-末端都在细胞内。利用NetPhos2.0对CpAQP蛋白进行磷酸化位点预测,该蛋白C端丝氨酸磷酸化,可能在植物胁迫和亚细胞定位中起着重要作用。将该基因的cDNA编码序列连接到植物表达载体pCAMBIA2301g中,成功构建了CpAQP基因的植物表达载体pCAM-CpAQP,为进一步通过转基因技术研究该基因的功能奠定了基础。     

籼稻VQ6基因的克隆与植物表达载体构建

采用CTAB法提取籼稻的基因组DNA;根据TIGR数据库中Os VQ6基因序列设计合成特异性引物,通过PCR扩增成功地获得了籼稻Os VQ6基因。该基因具有VQ结构域,其编码区全长为351 bp,编码116个氨基酸残基。经T载体连接转化后测序,进一步构建了Ca MV 35S启动子驱动Os VQ6基因的植物表达载体p SN1301-Os VQ6。     

籼稻VQ6基因的克隆与植物表达载体构建

采用CTAB法提取籼稻的基因组DNA;根据TIGR数据库中Os VQ6基因序列设计合成特异性引物,通过PCR扩增成功地获得了籼稻Os VQ6基因。该基因具有VQ结构域,其编码区全长为351 bp,编码116个氨基酸残基。经T载体连接转化后测序,进一步构建了Ca MV 35S启动子驱动Os VQ6基因的植物表达载体p SN1301-Os VQ6。     

百脉根PIN基因家族的鉴定与分析

生长素输出载体蛋白PIN-formed(PIN)是一类调控植物生长素极性运输的重要载体元件,与植物生长发育密切相关。利用生物信息学方法对百脉根(Lotus corniculatus)PIN基因家族成员(LjPIN)进行筛选、鉴定,并对其结构特征、系统进化、编码蛋白质性质、顺式作用元件组成和表达特性等进行研究,为其功能鉴定及利用奠定基础。结果表明,百脉根基因组中含有27个LjPIN成员,主要分布在1—5号染色体上;27个LjPIN基因含8个可变剪切位点,编码35个蛋白质;除了LjPIN4、LjPIN13、LjPIN23基因外,其他LjPIN基因均含有内含子,内含子数和外显子数均为1～10个;LjPIN与拟南芥AtPIN、大豆GmPIN在进化关系上较接近,与水稻OsPIN较远;LjPIN蛋白大多为碱性的两性稳定蛋白质,一般含有5种保守基序,基序数量2～9个;LjPIN基因除了含有顺式作用基本元件CAAT-box和TATA-box外,还含有光响应、激素响应及生长发育相关的调控元件;11个LjPIN基因在根、茎、叶、花和不同形成时期种子中呈时空差异表达。     

Oleosin与GUS融合蛋白基因的植物表达载体的构建及融合蛋白性质的预测

将油菜油脂蛋白Oleosin基因与报告基因GUS通过6个氨基酸编码的凝血酶识别位点(Gly-Val-Arg-Gly-Pro-Arg)连接起来,形成一个融合蛋白。其中编码区基因长2415bp,共编码804个氨基酸和一个终止密码子。使用蛋白质分析软件Antheprot.5.0和DNAstar对融合蛋白的理化特性,二级结构,潜在信号肽断裂位点,跨膜区进行分析表明:融合蛋白较好的保持了原来两个蛋白的理化特性和二级结构。将该融合基因克隆到中间载体pUC-121上,并用棉花LEA蛋白D-113基因启动子替换CaMV35S启动子,构建成植物表达载体pBI-LEA-O::G121。     

酸柚根系CS和PEPC基因的克隆及序列分析

以酸柚(Citrus grandis)根系为材料,利用热硼酸法提取了根系总RNA,并逆转录成cDNA,利用PCR和RACE技术相继得到柠檬酸合酶基因(CS)和磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因(PEPC)的保守区、3'端和5'端.酸柚根系CS基因全长1760bp,开放读码框有1413 bp,编码472个氨基酸,氨基酸序列相对分子质量为52.487 ku,等电点为6.9,亲水指数为-0.199;5'端非编码区为67 bp,3'端非编码区为277 bp;推导的氨基酸经序列比对,发现与其他物种具有很高的同源性(85.4%-99.6%).酸柚根系PEPC基因全长3307 bp,开放读码框有2604 bp,编码868个氨基酸,氨基酸序列相对分子质量为99.569ku,等电点为6.68,亲水指数为-0.398;5'端非编码区为431 bp,3'端非编码区为269 bp,推导的氨基酸经序列比对,发现与其他物种具有很高的同源性(85.8%-95.7%).初步确定克隆到的为酸柚根系CS和PEPC基因,登陆Genbank,登陆号分别为HQ537481和HQ537482.     

高山红景天GH3基因克隆及序列分析

参照已知植物GH3的氨基酸序列,通过比较找出相对保守的氨基酸序列设计简并引物,通过RT-PCR和RACE法得到高山红景天GH3的3'端,其长度838bp,编码200个氨基酸的602 bp位于GH3的开放阅读框内和一段长36bp的3'非编码区(3'UTR).序列比较结果表明,GH3推导的氨基酸序列与已公布的几种植物GH3氨基酸序列有较高的序列同源性.     

芥蓝BoPGIP2全长基因的分子克隆及其序列分析

从芥蓝（Brussica oleraceaL．var．alboglabra）中克隆了一个新的PGIP基因,命名为BoPGIP2。BoPGIP2基因序列全长为1102bp,由2个外显子和1个内含子构成,外显子总长为993bp,内含子总长为95bp,编码330个氨基酸序列,分子量为37．1kDa。推导的氨基酸序列分析表明,该序列包含5个N一糖基化位点,2个蛋白激酶C磷酸化位点,5个酪蛋白激酶II磷酸化位点,4个N-豆蔻酰化位点;同源序列比对分析表明,所比对基因都含有LRR结构,在145位点的LRR结构域在所有物种中高度保守。     

芥蓝BoPGIP2全长基因的分子克隆及其序列分析

1材料与方法 1．1材料与试剂试材为“中花”芥蓝,种子播于装有蛭石和珍珠岩各半的苗钵中,并在玻璃温室中生长。幼苗期取幼嫩叶片,用75％的酒精棉擦洗干净,做好标记,立即投入液氮中固定,-75℃保存备用。     

农业害虫铅灰齿爪鳃金龟气味受体基因Or83b的克隆及序列分析

采用简并引物反转录多聚酶链式反应(RT-PCR)和cDNA末端快速扩增(RACE)技术,从农业害虫铅灰齿爪鳃金龟中分离和克隆了一类非常保守的嗅觉受体蛋白基因(命名为Hp-Or83b)全序列。Hp-Or83b全长共1822 bp,5’-UTR为168 bp,3’-UTR为220 bp,开放阅读框全长1434 bp,编码478个氨基酸,预测分子量为54.24 kDa,等电点为7.46。通过同源性比较,发现Hp-Or83b氨基酸序列与已知的其它昆虫的Or83b具有较高的同源性。因此推断所获得的cDNA序列为农业害虫铅灰齿爪鳃金龟气味受体基因Or83b的cDNA序列。     

星星草类萌发素蛋白基因(PutGLP2)的克隆及生物信息学分析

类萌发素蛋白是一类种子萌发相关的特异性标记,其在植物生物和非生物胁迫应答过程中起到了重要作用。本研究通过酵母cDNA文库筛选,获得全长为1 065 bp的PutGLP2基因,其5′非翻译区164 bp,开放读码框666 bp,编码221个氨基酸,3′非翻译区235 bp。利用PCR技术,克隆获得PutGLP2的ORF序列。生物信息学分析发现,PutGLP2在氨基端(N端)具有一个跨膜结构域及N端信号肽,预测定位于细胞壁或胞外间质。将PutGLP2与水稻的43种GLP蛋白进行聚类分析,发现PutGLP2属于类萌发素亚家族2成员之一,并与水稻OsGLP1-1相似性最高。本研究将为丰富植物类萌发素蛋白基因信息提供参考。     

斑马鱼促性腺激素释放激素及相关肽基因的克隆与序列分析

从斑马鱼脑组织提取总RNA,应用RT-PCR方法克隆促性腺激素释放激素(GnRH) cDNA,其长度为646 bp,包括一个258 bp开放阅读框;编码的GnRH前体为86个氨基酸残基,由一个信号肽、GnRH十肽和一个由蛋白水解位点(Gly-Lys-Arg)连接的促性腺激素释放激素相关肽(GAP)组成;其中信号肽和相关肽的长度分别为24和49个氨基酸.该cDNA编码的GnRH的前体氨基酸序列与其他物种的GnRH前体基本一致.表明物种间GnRH cDNA的蛋白编码区高度保守,而非编码区的保守性程度很低.进化分析发现,斑马鱼与鲤、鲫、拟鲤、黑头软口鲦等淡水鲤科鱼类的同源性较高.     

刚竹属3种重要散生竹光系统Ⅰ基因(Lhca 1)的克隆、序列分析和蛋白结构预测

光系统Ⅰ(PSⅠ)在植物光合系统中具有重要功能,Lhca1是编码PSⅠ复合物中最主要的捕光色素蛋白LHCⅠ的基因。该研究采用RT-PCR法,从毛竹中克隆了捕光叶绿素a/b结合蛋白基因LhcaPe01(GenBank EU035496)的全长,从红壳竹和角竹中克隆了长度分别为616、613 bp的捕光叶绿素a/b结合蛋白基因片段LhcaH01(GenBank EU513200)、LhcaJ01(GenBank EU513201)。运用生物信息学方法对其核苷酸序列、编码的氨基酸序列以及蛋白结构进行预测。结果表明,LhcaPe01基因序列从第39 bp开始到第779 bp含有1个开放阅读框和一个中止密码子,该基因全长1051 bp,在5′端有38 bp的非编码区,在3′端含有242 bp的非编码区和Poly(A)30 bp。对这3个基因的保守片段的序列分析表明,刚竹属3种竹种毛竹、红壳竹和角竹保守区内核酸序列同源性非常高,在禾本科内不同属之间毛竹与大麦序列同源性最高,玉米次之。编码的氨基酸序列同源性与核酸序列同源性一致,最高是毛竹与大麦,水稻次之。经推测LhcaPe01编码的蛋白质等电点和分子量分别为5.4000和22107.34 D。蛋白质结构预测表明,毛竹、大麦、水稻、玉米的LHCⅠ蛋白结构非常相似。     

草鱼细胞凋亡抑制蛋白基因cDNA的克隆与表达分析

利用快速扩增cDNA末端(rapid amplification cDNA end, RACE)技术获得草鱼细胞凋亡抑制蛋白基因全长cDNA序列为2 093 bp,含有1个1 944 bp的开放阅读框,5′非编码区长25 bp,3′非编码区长124 bp,可编码647个氨基酸.生物信息学分析表明,在IAP的N端无氨基酸残基组成的信号肽;与斑马鱼的同源性最好,其次是斑猫鲿;在系统进化上,与斑马鱼、斑猫鲿共聚为1支.用半定量RT-PCR分析正常及细菌诱导下草鱼细胞凋亡抑制蛋白基因在不同组织中的表达分布,正常情况下,凋亡抑制蛋白基因在所取的7种组织中均有表达,其中脑、肠和肾表达最高,肝和心脏次之,鳃和肌肉最低,但差异不显著;用嗜水气单胞菌人工感染24 h后,所有组织中的IAP mRNA水平平均降低约26%,以肝脏和肌肉降低较为明显,在感染48 h后,所有组织中的IAP mRNA水平平均升高约4%,其中心脏、肝脏和鳃分别升高8%、16%、19%,这表明草鱼细胞凋亡抑制蛋白可能参与了机体对嗜水气单胞菌感染的免疫应答.     

柽柳甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因的克隆与表达分析

从柽柳(Tamarix hispida)cDNA文库中分离出甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因(ThGAPDH)全长cDNA序列,该基因全长1294bp。其中:5′非翻译区84bp,3′非翻译区184bp,开放阅读框1206bp,编码含341个氨基酸的蛋白质,编码蛋白的相对分子质量为37200,理论等电点(pI)为6.97。采用实时定量RT-PCR方法研究了刚毛柽柳在PEG、NaCl、NaHCO3及CdCl2胁迫下不同时间该基因ThGAPDH的表达模式。结果表明:PEG、NaCl及CdCl2处理均能诱导ThGAPDH基因在根中的表达而抑制其在茎和叶中的表达,而NaHCO3处理均能诱导该基因在根、茎、叶中的表达。基因ThGAPDH的cDNA序列在GenBank中的登录号为GQ478708。