红螯螯虾CHH2基因的表达特征及其在卵巢发育中的功能

为研究高血糖激素基因(CHH)在红螯螯虾卵巢发育中的作用，基于转录组学数据鉴定到红螯螯虾CHH2基因序列，并对其基本特性进行生物信息学分析。采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测了CHH2在红螯螯虾不同组织和卵巢发育阶段的表达情况。结果表明，CHH蛋白在甲壳类物种中高度保守，同源性高达66.84%。qRT-PCR结果表明，在红螯螯虾的肝胰腺中几乎检测不到CHH2表达，在其他组织均有表达，包括肌肉、鳃、肠、心，且在卵巢中的表达水平最高；另外，CHH2在卵巢发育各个时期(未发育、发育期、快速发育期、成熟期)均有表达，表达水平先升高后降低，在卵巢发育成熟期表达水平最低。此外，在切除单侧眼柄和雌二醇活体注射的红螯螯虾卵巢中，CHH2表达水平显著降低。通过注射体外合成CHH2-dsRNA对红螯螯虾进行RNAi干扰试验，结果显示，卵巢发育重要标记卵黄蛋白原基因(VTG)表达水平显著上升。综上所述，CHH2可能负调控红螯螯虾卵巢发育，研究结果为进一步开发基于RNAi的促性腺成熟技术奠定理论基础。     

晒田环境胁迫对克氏原螯虾卵巢组织、卵黄蛋白原及营养物质代谢的影响

【目的】研究克氏原螯虾在晒田环境胁迫条件下卵巢组织学特点、卵黄蛋白原浓度及营养物质代谢水平的变化,探索其性成熟过程中体内营养物质变化相关机制,为晒田环境胁迫促进克氏原螯虾卵巢成熟这一生产操作的改良和标准化提供参考依据。【方法】试验对象分为晒田组与对照组克氏原螯虾,在晒田胁迫0、3、7、10 d时分别采集30只雌性克氏原螯虾,取卵巢进行石蜡切片和HE染色,并采集试验组的卵巢、肝胰腺和血清,检测卵黄蛋白原mRNA表达水平和浓度及营养物质代谢水平。【结果】雌性克氏原螯虾在晒田胁迫期间共鉴定出4个卵巢发育阶段,包括卵黄发生前阶段(Ⅰ期,卵巢为黄色,卵母细胞直径150～250μm)、初级卵黄发生阶段(Ⅱ期,卵巢为橙色,卵母细胞直径250～600μm)、次级卵黄发生阶段(Ⅲ期,卵巢为棕色,卵母细胞直径高于600μm)、成熟阶段(Ⅳ期,卵巢为黑褐色,卵母细胞直径高于1000μm)。晒田胁迫0 d时,晒田组与对照组雌性克氏原螯虾卵巢成熟率相似;晒田胁迫10 d时,晒田组雌性克氏原螯虾卵巢成熟率升至96.67%,而对照组仅升至60.00%。随着胁迫时间增加,晒田组和对照组雌性克氏原螯虾的卵巢与肝胰腺的卵...     

中国明对虾卵黄蛋白原mRNA在卵巢和肝胰腺中表达量的实时荧光定量PCR检测

中国明对虾卵黄蛋白原mRNA基因在卵巢和肝胰腺中都有表达。采用实时荧光定量PCR方法测定在卵巢不同发育时期卵巢和肝胰腺这两种组织的卵黄蛋白原mRNA的表达水平,提取组织总RNA,设计特异性引物进行荧光定量PCR扩增,对卵巢发育的各个阶段,卵原细胞增殖期、卵黄发生前期、初级卵黄发生期、次级卵黄发生期和消退期的卵黄蛋白原mRNA表达进行相对定量分析。结果表明:在卵巢中,卵黄蛋白原mRNA在前3个阶段随着卵巢的发育,表达量不断增加,分别为0.04、0.23和1.03,次级卵黄发生期开始减少到0.16,消退期卵黄蛋白原mRNA表达量又增加到1.00。而在肝胰腺,前4个阶段随着卵巢发育,表达量逐步增加,分别为0.01、0.07、0.19、和1.29,至消退期,表达量减少到0.74。研究亮点:使用实时荧光定量的方法,分析了中国明对虾卵黄蛋白原mRNA基因在卵巢发育的不同时期,卵巢和肝胰腺组织中的相对表达水平。选择敏感性和特异性较好的实验方法,在前人定性研究的基础上开始相对定量的研究,清晰地阐述了卵巢和肝胰腺中卵黄蛋白原mRNA基因的表达差异。     

大草蛉卵黄发生的动态分析

用蒸馏水沉淀法提取大草蛉(Chrysopa septempunctata Wesmael)的卵黄蛋白，免疫家兔，并将所得抗血清经雄虫匀浆液吸收，获得抗卵黄蛋白的特异抗体，经纯化后，用辣根过氧化物酶标记抗体。采用酶联免疫测定(ELISA)直接法，系统测定了大草蛉成虫期脂肪体、血淋巴和卵巢中卵黄蛋白的动态变化。结果表明：脂肪体是卵黄原蛋白合成的场所，卵黄原蛋白的合成始于羽化后第4d；脂肪体、血淋巴中卵黄原蛋白的滴度在羽化后第4d开始迅速上升，至成虫期的第7d达到高峰期；在羽化后第4d的卵巢中可以检测到卵黄蛋白，此后其含量迅速上升，到成虫期的第7d达到高峰期。经SDS—PAGE分析，结果表明：大草蛉的卵黄蛋白由165kD和46kD的大小2个亚基组成。     

克氏原螯虾卵巢发育Ⅲ期与Ⅳ期的比较蛋白质组学研究

克氏原螯虾作为经济虾蟹类的重要代表,是淡水虾类重要水产养殖资源.目前在规模化养殖过程中优质苗种的供应短缺现状,是制约克氏原螯虾产业发展的瓶颈之一.人工养殖条件下,雌虾卵巢易出现发育迟缓甚至停滞现象而导致雌、雄性腺发育不同步是优质苗种短缺的首要根本原因.分析可知,克氏原螯虾卵巢从卵黄发生前期(Ⅲ期)到卵黄发生期(Ⅳ期)的发育过渡是卵母细胞能否顺利发育成熟的关键点.本研究对克氏原螯虾卵巢发育Ⅲ期和Ⅳ期卵巢组织总蛋白质组双向电泳的等电聚焦条件、上样量等关键因素进行了优化,运用PDQuestTM软件对获得的凝胶图谱进行了图像分析,并对表达差异蛋白质点(丰度差异≥2倍)进行了串联质谱鉴定.结果显示:在等电总伏特数不低于8500V·h、样品上样量为200 μg时,可以获得较清晰的凝胶图谱;利用串联质谱分析挖取的52个差异蛋白质点,其中共成功鉴定29个(包括22种蛋白质);分析表明,相对于发育Ⅲ期卵巢蛋白质组,在Ⅳ期卵巢蛋白质组中有13种蛋白质表达量有下调,9种蛋白质表达量有上调.研究结果将对于揭示克氏原螯虾的卵巢发育分子调控机制奠定一定基础,同时对于了解其他虾蟹类动物的性腺发育机理也将积累重要分子生物学资料.     

Tropomyosin基因在克氏原螯虾(Procambarus clarkii)卵巢发育过程中的表达

原肌球蛋白Tropomyosin是虾蟹类的主要致敏物质,除此以外在其他方面功能的研究非常少。本研究克隆了克氏原螯虾Tropomyosin基因,进行了同源序列比对,并分析了Tropomyosin基因在克氏原螯虾卵巢发育过程中的转录水平表达模式。研究结果显示,Tropomyosin蛋白序列高度保守,在虾蟹类甲壳动物中,8个抗原决定簇序列几乎完全一致。本研究克隆的基因存在3个核苷酸位置(c61—t,g118—a,c359—t)的变化,但是均不处于抗原决定簇内,免疫原性不受影响。Tropomyosin基因mR NA在克氏原螯虾卵巢组织中表达量很低,但是随着卵巢的发育存在表达差异,即呈现一个先提高再降低的峰型特征。本研究暗示Tropomyosin除过敏原特性外,可能也受性腺发育的部分调控影响。     

中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)卵黄发生前期与消退期卵巢和肝胰腺消减文库的初步构建及分析

利用抑制性消减杂交技术(SSH)分别对中国明对虾在卵黄发生的两个关键时期(卵黄发生前期和消退期)构建卵巢和肝胰腺的正反向消减文库,测序结果与GenBank进行BLASTx同源比较并利用GO分析进行功能注释.结果显示,各文库中的差异表达基因与卵巢发育时期相吻合,卵黄发生前期的卵巢和肝胰腺中分别检测到与卵黄蛋白原相关基因的出现,说明卵黄发生前期与卵黄发生有重要联系.在消退期中检测到与皮质棒形成相关的基因,说明消退期仍有皮质棒的形成,同时也检测到一些与免疫相关的基因,在机体中差异表达时期的功能有待进一步探讨.     

能量代谢相关基因在眼柄切除诱导克氏原螯虾卵巢成熟中后期的表达量

借鉴国外最新研究结果,探讨了克氏原螯虾单侧眼柄切除后15 d内卵巢的一系列变化情况,利用实时定量RT-PCR技术比较分析了眼柄切除前、后卵巢组织中NADH脱氢酶、ATP合成酶F0及细胞色素C氧化酶的基因表达情况.结果显示,在克氏原螯虾眼柄切除诱导卵巢成熟的中后期,这些能量代谢相关基因表达量大幅上调.说明在克氏原螯虾养殖过程中卵巢快速发育阶段,卵巢组织细胞要消耗大量能量,须要在饲料配方中提高能量饲料的比例.     

克氏原螯虾雌雄分养状态下的性腺发育观察

克氏原螯虾具有多雄多雌交配行为,这一特性给克氏原螯虾家系选育工作带来了许多不便。为了获取克氏原螯虾(Procambarus clarkii)雌雄分开养殖下的性腺发育状况,本研究从苗种阶段开始对克氏原螯虾进行雌雄分开养殖,在江苏地区克氏原螯虾主要繁殖季节(9—12月),对雌雄分开养殖状态下克氏原螯虾的性腺发育情况进行了观察。9月所采集的雌性克氏原螯虾多处于性腺发育Ⅴ期(占20/30),卵巢呈深褐色,卵粒饱满均匀;11月所采集的克氏原螯虾样品的卵巢多数已退化(占22/30),卵巢中仅残存少量未成熟卵粒(或空腔),处于性腺发育Ⅵ期。组织切片观察结果显示,克氏原螯虾卵母细胞直径为2 000μm左右,细胞质中可见大量的卵黄颗粒;精巢呈长囊形,生精小囊多呈囊球状,生精小囊与收集管相连接,收集管中可见部分精子。研究结果提示,雌雄分开养殖对克氏原螯虾的性腺发育没有产生明显的不利影响,本研究为后续开展克氏原螯虾家系选育相关研究积累了数据。     

克氏原螯虾泛素结合酶E2基因的克隆及其在卵巢中的表达分析

利用RACE技术获得了UB-E2基因c DNA全长,通过RT-PCR技术研究UB-E2基因在不同组织、发育时期的表达量和17α-羟孕酮激素刺激后UB-E2表达量及性腺发育情况。结果表明:该基因序列全长3 943bp,开放阅读框675 bp,编码224个氨基酸,相对分子量23. 93 ku,等电点8. 61,82～219位氨基酸序列为泛素结合酶家族特有的结构域。氨基酸序列比对发现,克氏原螯虾UB-E2基因与节肢动物UB-E2基因有较高的同源性;系统进化分析表明,UB-E2基因与凡纳滨对虾和斑节对虾聚为一支。荧光定量结果显示,UB-E2基因在克氏原螯虾卵巢组织中的表达量显著高于其他组织(P 0. 05);在卵巢发育初期表达量最低,随后逐渐升高,到产卵后期开始下降; 17α-羟孕酮刺激结果显示,试验组卵巢发育速度明显加快,同时UB-E2基因的表达量也显著上升,卵巢发育速度和UB-E2基因表现为受17α-羟孕酮刺激响应一致。推测UB-E2基因在克氏原螯虾的卵巢发育和配子发生中起着重要的作用,本研究为克氏原螯虾性腺发育分子调控机制提供一定的理论依据。     

克氏原螯虾PcDsx基因的克隆及表达分析

为阐明克氏原螯虾(Procambarus clarkii) doublesex(PcDsx)的功能,采用RACE技术克隆获得PcDsx cDNA序列,利用qRT-PCR检测该基因的表达情况。生物信息学分析结果显示,该基因cDNA全长1 584 bp,包括243 bp 5′UTR、765 bp ORF(编码254 aa)和576 bp 3′UTR;PcDsx蛋白包含1个保守的DM结构域,与东方刺龙虾(Sagmariasus verreauxi)SvDsx的DM结构域相似性较高。基因表达分析结果显示,PcDsx广泛表达于成年克氏原螯虾的各组织中,其中克氏原螯虾触角腺中该基因的相对表达量最高,性腺和肌肉中的相对表达量也较高,并且发现该基因在成年雌虾多种组织中的表达与相应雄虾组织中的表达存在显著性差异;克氏原螯虾早期发育不同时期表达分析结果表明,PcDsx的表达水平在出膜后3 d达到一个高峰,而幼虾中PcDsx的最高表达分别出现在出膜后41 d和115 d,此外,该基因在出膜后期雌雄幼虾中的表达亦表现出显著性差异。     

克氏原螯虾卵巢发育与产卵周期变化的观察

对克氏原螯虾性腺(卵巢)在不同季节和不同生长阶段进行连续1 a(从2007年4月至2008年3月)跟踪解剖观察,以期探明克氏原螯虾卵巢成熟发育机理和繁殖生理规律。结果显示:克氏原螯虾卵巢发育一般分为Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期、Ⅴ期和Ⅵ期6个时期,卵巢发育初期(Ⅰ期)呈白色透明状,未见卵粒;Ⅱ期和Ⅲ期卵巢中的卵粒颜色逐步变黄加深;发育至Ⅳ~Ⅴ期,卵黄沉积后的卵粒呈深褐色;产卵后的卵巢(Ⅵ期)呈空管状,残存有少量未成熟的卵子。在长江流域(江苏地区),2007年4~6月份的雌虾卵巢发育时期以Ⅱ~Ⅲ期为主,卵巢出现频率最高值为46.7%;2007年7~8月克氏原螯虾25 g以上的个体多数卵巢已达到Ⅳ期,卵巢出现频率为40.0%~50.0%;2007年9~11月卵巢成熟系数为1.99%~2.92%,均高于其他月份;2007年12月至2008年3月卵巢发育时期以产卵后的第Ⅵ期为主,出现频率最高达60.0%。表明,在自然条件下克氏原螯虾大部分个体一般1 a只产1次卵且主要集中在秋冬季,同时其繁殖孵幼存在明显的不同步性。     

高温处理对甜菜夜蛾雌虫成虫期生殖力及卵巢发育的影响

对雌成虫羽化后24 h用不同高温处理,观察其产卵量,卵巢发育及卵黄蛋白含量的变化。结果表明,高温对甜菜夜蛾的生殖力和卵巢发育有显著影响。从3个温度处理(40、434、6℃)、3个处理时间(1、48、h)来看,短时间高温对甜菜夜蛾生殖力影响不明显,而8 h高温使产卵量和卵的孵化率大大降低,尤其是46℃处理8 h时,产卵量仅为对照的50%,而孵化率只有9%。高温处理主要抑制了生殖器官的正常发育,使卵巢管长度和卵巢鲜重有不同程度的下降;进而影响了卵黄蛋白的吸收、合成和运转。46℃处理8 h卵巢中卵黄蛋白含量比对照降低了43%,可溶性蛋白含量下降了23%。43℃8 h和46℃4 h处理生殖力开始明显下降。     

不同发育期克氏原螯虾卵巢和肝胰腺中孕酮和雌二醇含量变化

对不同发育期的克氏原螯虾的肝胰腺和性腺指数进行了测定,并采用甲醇抽提的方法,利用电化学发光免疫分析仪测定了克氏原螯虾不同发育期的卵巢和肝胰腺中孕酮和雌二醇的含量变化.结果表明,随着卵巢发育,发育初期肝胰腺指数随着发育的进行逐步增加,到初级卵黄发声期到达最大值后随之下降.卵巢中孕酮和雌二醇含量随着卵巢发育的程度而逐步提高,在初级卵黄发生期到达峰值,随后逐渐下降,在肝胰腺中有着相似的趋势,但是峰值出现稍晚,在次级卵黄发生期.     

口虾蛄卵黄蛋白原(Vg)基因的初步研究

为研究口虾蛄Oratosquilla oratoria卵黄蛋白原(vitellogenin,Vg)基因,利用c DNA末端快速扩增(RACE)技术克隆口虾蛄Vg基因c DNA全长序列(Gen Bank登陆号:KR422400),并应用相对实时荧光定量PCR技术检测雌雄口虾蛄不同组织、不同发育时期卵巢Vg mRNA的表达量。结果表明:口虾蛄Vg基因全长7727 bp,其中5'端非编码区为36 bp,开放阅读框(ORF)为7521 bp,3'端非编码区为170 bp,共编码2506个氨基酸;预测的氨基酸序列中存在1个长度为20个氨基酸的信号肽,1个类似于枯草蛋白酶的内切蛋白酶识别位点(RSKR),3个潜在的N-连接糖基化位点,1个在无脊椎和脊椎动物卵黄蛋白原中都比较保守的KALGNVG基序;对其结构域分析表明,口虾蛄Vg蛋白含有4种保守结构域,分别为卵黄蛋白原N端结构域(Vitellogenin_N)、血管性血友病因子(v WFD)和两种未知功能结构域(domain of unknown function)DUF1943与DUF1081;经NCBI BLASTP同源性比较,口虾蛄Vg氨基酸序列与其他甲壳类的相似性为46%~52%;系统发育分析结果显示,口虾蛄Vg单独聚为一支;实时定量PCR结果显示,口虾蛄Vg基因在性腺和肝胰腺中均有表达,在肌肉中均不表达,卵巢中Vg mRNA的表达量显著高于其他组织(P0.05),且口虾蛄Vg mRNA的相对表达量随着卵巢的发育不断增加(P0.05),在成熟期时达到最高值,随后显著下降,Vg mRNA表达量在卵巢中的变化规律可以作为了解口虾蛄性腺发育的有效指标。本研究结果为口虾蛄Vg蛋白的功能研究奠定了基础。     

丽蝇蛹集金小蜂卵黄原蛋白合成与摄取及卵黄磷蛋白降解的时间动态

采用ELISA测定法检测了蝇类蛹期外寄生蜂-丽蝇蛹集金小蜂卵黄原蛋白合成与摄取,及卵黄磷蛋白降解的时间动态.结果表明:该蜂卵黄原蛋白的合成与摄取分别起始于寄生后的第10 d和第13 d,即正处于该蜂的蛹初期和隐成虫期;胚胎内的卵黄磷蛋白随其发育过程而降解,寄生后第3 d,即胚胎发育结束时则全部降解完毕.此外,还探讨了卵黄蛋白合成、摄取和降解过程中,血淋巴、卵巢或卵内可溶性蛋白含量的的时间动态变化.     

硒和酵母对中华米虾孵化率的影响

[目的]研究硒和酵母对中华米虾孵化率等的影响。[方法]饲料中添加硒和酵母,比较虾的生长指标、孵化率及其幼体的成活率。[结果]当硒含量为0.45μg/g时,饲喂有机硒的中华米虾的生长指标、孵化率等,均高于不添加硒元素和添加同含量无机硒饲喂的中华米虾;同时在饲料中添加适量酵母也可提高以上指标。[结论]将富硒酵母作为饵料生物,按一定比例添加到中华米虾饲料中,可提高虾生长指标、孵化率等。     

对硫磷胁迫下不同硒源对中华米虾超氧化物歧化酶和过氧化氢酶活性的影响

研究了在对硫磷胁迫下饲料中添加不同硒源对中华米虾(Caridina denticulata sinensis)超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)活性的影响.结果表明,饲料中添加等量无机硒和有机硒,有机硒组米虾的SOD和CAT活性均高于无机硒组(P＜0.05).对硫磷对中华米虾的24 h、48 h、72 h和96 h的半致死浓度分别为15.40、8.73、4.59和1.09 μg/L.中华米虾在1.09 μg/L以下不同浓度对硫磷胁迫24 h,随着对硫磷浓度的升高,无机硒和有机硒组虾的SOD和CAT活性变化趋势一致,均是先升后降,有机硒组米虾的SOD和CAT活性均高于无机硒组(P＜0.05).可见,中华米虾对饲料中添加有机硒的吸收效果好于无机硒.     

对硫磷胁迫下不同硒源对中华米虾超氧化物歧化酶和过氧化氢酶活性的影响

研究了在对硫磷胁迫下饲料中添加不同硒源对中华米虾(Caridina denticulata sinensis)超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)活性的影响.结果表明,饲料中添加等量无机硒和有机硒,有机硒组米虾的SOD和CAT活性均高于无机硒组(P＜0.05).对硫磷对中华米虾的24 h、48 h、72 h和96 h的半致死浓度分别为15.40、8.73、4.59和1.09 μg/L.中华米虾在1.09 μg/L以下不同浓度对硫磷胁迫24 h,随着对硫磷浓度的升高,无机硒和有机硒组虾的SOD和CAT活性变化趋势一致,均是先升后降,有机硒组米虾的SOD和CAT活性均高于无机硒组(P＜0.05).可见,中华米虾对饲料中添加有机硒的吸收效果好于无机硒.     

真水狼蛛Pirata piraticus卵黄蛋白的研究

从真水狼蛛Pirata piraticus卵中提取出了雌性特异性蛋白质——卵黄蛋白.聚丙烯酰胺凝胶电泳和免疫扩散试验证明,该蛋白质为生殖期雌蛛所特有.真水狼蛛的卵黄蛋白为糖脂结合蛋白,等电点为pH6.7～7.5. 氨基酸组份分析表明其谷氨酸、天门冬氨酸的含量较高,而含硫氨基酸甲硫氨酸和半胱氨酸含量较低. 卵黄蛋白的分子量为255 kD,其分子由4个亚基组成,亚基分子量分别为84 kD,69 kD,63 kD和49.8 kD. 在胚胎发育过程中,卵黄蛋白含量下降明显. 合适的温度和多种食物混合饲养有利于卵巢的生长发育和卵黄蛋白的合成. 真水狼蛛的卵黄蛋白可能是由卵巢自身合成的. 通过比较卵巢中卵黄蛋白含量和卵粒直径大小,探讨了温度和食物对蜘蛛繁殖力的影响机制.