转pti5-vp16基因小麦的分子检测和抗病性鉴定

 将携带pti5 vp16基因的pJZ170质粒附着微弹用基因枪轰入辽春 10号、铁春 1号和丰强 3号小麦幼胚 ,2d后检测瞬时表达 ,GUS染色 ,幼胚表面有明显的蓝点 ,单个幼胚蓝点数多达 85个 ;对经ppt2次筛选后的转基因小麦植株进行PCR检测 ,检出 6株阳性植株 ;对部分PCR检测呈阳性的植株进行斑点杂交和Southern印迹杂交检测 ,转基因植株均产生杂交信号。对PCR呈阳性的转基因小麦植株接种小麦白粉病菌 ,接种 7d后 ,病害表型多数为抗病 ;接种 14d后 ,病害表型为抗病、中抗及中感 ,病害严重度明显轻于对照。     

基因枪法导入Bar基因转化小麦幼胚的研究——抗性愈伤组织与再生植株的遗传转化

在前文研究基础上 ,轰击的 2 80 4个幼胚经 L - PPT筛选后共获得 2 5 9个抗性愈伤 ,对其中 2 0 0个抗性愈伤组织和再生的 32个植株 GU S gene的表达进行组织化学检测 ,以及再生植株的 PCR检测。研究结果表明 ,有 4 5个抗性愈伤组织呈 GUS阳性。32株再生植株中获得 4个抗性株系 ,经 X- Gluc染色 ,在花药中检测到 GU S基因表达 ,PCR检测也呈阳性 ,而在对照和其它再生植株中未发现 GU S和 BAR基因表达     

转基因抗穗发芽小麦的获得

以易穗发芽小麦幼胚为受体,用基因枪法对TrxS反义基因(目的基因)和Bar基因(标记基因)进行了共转化;通过对轰击后的小麦幼胚进行愈伤组织诱导、胚性愈伤组织分化和生根培养,获得再生植株;经分子检测证实在3个受体材料上获得转基因再生植株和可遗传的转基因后代.通过培养皿籽粒发芽试验、离体整穗保湿发芽试验和温室模拟降雨穗发芽试验,均证明转基因后代材料具有延缓籽粒发芽和抗穗发芽的特性.     

抗虫、抗除草剂转基因玉米的获得及遗传研究

利用PIG基因枪，将cryLA(b)基因和bar基因，采用共转化法导入玉米自交系的幼胚中，经PPT筛选，获得抗性愈伤组织并再生植株。除草剂抗性检测、点杂交和Southern杂交分析表明，在多数转基因植株中cryLA(b)基因和bar基因共整合，且呈孟德尔单位点显性基因连锁遗传。Northern杂交及ELISA检测表明，cryIA(b)基因在转录和翻译水平进行也有效的表达。部分转基因植株表现出明显的抗虫活性。     

小麦花粉电穿孔转化因素优化和转基因植株获得及鉴定

[目的]通过优化电穿孔转化技术主要参数,得到候选转基因植株,探索普通小麦(Triticum aestivum L.)电穿孔遗传转化体系.[方法]以冬小麦品种济麦19为受体,GUS为外源基因,将扬花期成熟花粉以最适电场强度和操作温度进行电穿孔处理后,人工授粉济麦19,最终收获种子;利用PCR技术、Southern技术、化学染色方法对T1、T2植株进行鉴定.[结果]电穿孔转化以电场强度6 kV·cm-1、冰上处理花粉,花粉密度为5×106个/mL,以及去雄后第5天授粉为最佳参数;Southern杂交检测结果表明,T2阳性植株的2个株系检测到杂交信号,同时其幼根、叶片等组织经GUS表达活性的组织化学染色检测,呈现蓝色反应.[结论]利用小麦花粉电穿孔转化法可以成功将外源基因整合到小麦基因组中并稳定遗传至T2,且外源基因GUS能够得到表达.     

Xa21基因导入水稻广亲和恢复系SWR20的研究

以成熟胚愈伤组织为转化受体 ,经农杆菌介导法将显性广谱白叶枯病抗性基因 Xa2 1导入高感白叶枯病的水稻广亲和恢复系 SWR2 0中 ,共获得 4 3个独立的转基因株系 ,1 0 0余株转基因水稻植株。经 GUS活性、潮霉素抗性检测及PCR分析表明 ,外源基因已整合到转基因水稻基因组中 ;白叶枯病原菌接种试验表明 ,大部分 T0 代转基因水稻植株的抗病性有明显提高 ,多数植株表现抗或高抗 ,个别为感病。经对农杆菌介导的水稻转化技术作进一步改进后 ,GUS瞬间表达率可高达 92 .5% ,稳定转化频率达到 2 7.6%     

Study on the Obtaining of Transgenic Wheat with GNA Alien Gene by Biolistic Particle

The immature embryos of wheat plants, cv. Jing 411, 12 - 14 days after pollination, were cultured on SD2 medium for callus induction. After 10 days culture, 800 wheat calli were bombarded by biolistic particle coated with theDNA of plasmid pBI121-2 harboring both Galanthus nivalis agglutinin gene and bar gene. 67 green plants were finally regenerated from the bombardment calli on selection medium containing 4mg/L Basta. The results of bioassay by both inoculating wheat aphids onto the plants and applying Basta solution of 50 mg/L and 75 mg/L onto the wheat leaves in the field, and the molecular analysis, such as PCR and Southern blotting, indicated that 8 T2 plants contaning the target genes were obtained.     

基因枪法获得GNA转基因小麦植株的研究

 以小麦品种京 411作为基因枪转化的靶材料 ,取其未成熟胚诱导愈伤组织 ,经过 10 d左右培养后 ,用含有雪花莲凝集素 (Galanthus nivalis agglutinin ,GNA)和 bar基因的质粒 p BI12 1- 2轰击 80 0个胚性愈伤组织 ,在含有4mg/ L Basta溶液的培养基上进行筛选 ,分化及生根培养 ,获得 6 7棵再生植株。田间涂抹 Basta溶液 (5 0、75 m g/ L)检测和接麦蚜实验 ,提取转基因植株基因组 DNA,用扩增 GNA基因的引物经 PCR扩增 Southern杂交 ,结果表明利用基因枪转化已从 T2 代获得了 8株含有编码 bar/ GNA基因的转基因植株。     

利用基因枪技术转化小麦、玉米的研究

采用国产JQ－700型基因枪,以含Bt基因的质粒pHB101为供体,轰击小麦、玉米愈伤组织,轰击后的愈伤组织经潮霉素抗性筛选后,获得32株小麦再生苗,14株玉米抗性植株。以a－32P－dCTP标记的PHB101质粒为探针,对小麦抗性植株进行点杂交印渍检测,发现有15株小苗显示阳性信号,且其中有一株的后代对田间蚜虫及锈病的抗性较好。玉米再生植株种植田间后在其后代中选出一抗玉米螟的稳定株系,尚需进一步的分子验证和饲虫实验。     

水稻OsHOX6启动子的组织特异性表达

【目的】研究水稻HD-ZipⅠ转录因子家族的成员OsHOX6基因启动子的表达。【方法】通过构建水稻OsHOX6基因启动子与GUS基因融合表达载体,利用农杆菌(Agrobacterium)介导,以未成熟水稻胚作为试验材料,转化到水稻IR64,通过PCR检测和潮霉素抗性筛选出阳性的转基因植株,从不同组织取样品,进行X-Gluc染色并观察。【结果】转基因植株的叶、根、茎、花等器官经过X-Gluc染色后,主要在侧根、花粉以及组织损伤部分出现蓝色斑点,其它组织均未检测出蓝色斑点,观察根解剖结构,绿色斑点集中在根内皮层。【结论】 水稻OsHOX6基因启动子能够驱动GUS基因,在转基因水稻侧根和花粉上特异表达。     

茄红素-β-环化酶反义RNA基因对烟草的遗传转化

采用农杆菌介导的叶盘法 ,用胡萝卜茄红素 -β-环化酶反义 RNA基因对烟草 SRI野生类型种及Xanthi品种进行了遗传转化。 GU S检测结果表明 ,胡萝卜茄红素 -β-环化酶反义 RNA基因对两个不同烟草材料的遗传转化率均为 4 1 .7% ;Xanthi Southern杂交的阳性率为 6 7% ;转基因烟草当代叶片组织中茄红素和胡萝卜素含量与对照植株不同     

玉米基因枪转化受体材料的选择

以4种玉米转化受体为材料,进行了基因枪转化玉米受体材料的研究。通过GUS基因的短暂表达和转Bar基因抗性绿苗分化率研究表明,预培养3～4d的玉米幼胚更适合作基因枪转化的受体材料。对转基因再生植株的PCR分析及除草剂抗性检验,证明Bar基因已整合到玉米基因组中。试验结果还表明,在转基因筛选过程中加入AgNO3,可提高抗性绿苗分化。     

农杆菌介导多年生黑麦草转化体系的建立

以胚性愈伤组织系,作为转化受体,利用农杆菌介导的遗传转化方法,将报告基因gus和抗除草剂基因bar     

根癌农杆菌介导 hGLP1基因转化摩尔多瓦葡萄的研究

以摩尔多瓦葡萄早期体细胞胚为受体,通过农杆菌介导辅以超声波处理转化 hGLP1基因。结果表明,摩尔多瓦葡萄体细胞胚的卡那霉素临界致死质量浓度为10 mg/L,农杆菌浸染时辅以超声波处理可显著提高GUS瞬时表达效率（高达69.4%）。采用此体系对摩尔多瓦葡萄进行转化,获得高瞬时表达和稳定表达的转化子,进一步筛选培养获得7株抗性再生植株。利用PCR扩增的方法进行检测,其中2株PCR检测呈阳性,初步证实 hGLP1基因已整合到摩尔多瓦葡萄基因组。     

农杆菌介导的抗草甘膦基因(sxglr-11)的玉米遗传转化

利用根瘤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导法将抗草甘膦基因(sxglr-11)导入优良玉米再生系HiII,共转化幼胚1 673个,分化出再生苗67株,其中,28株移栽成活,经PCR检测13株为阳性植株,阳性率为46.4%。采用草甘膦浓度梯度筛选,确定了未转基因的对照植株的致死浓度范围为1%～2%。利用2%的草甘膦对T0转基因植株6～8叶龄苗的叶片进行涂抹,结果表明,阳性植株均具有草甘膦抗性。T1植株经2%草甘膦抗性筛选,转基因植株表现出3∶1的孟德尔分离方式。     

小麦大龄幼胚再生性能改进与农杆菌转化

 【目的】小麦幼胚再生率与幼胚大小关系密切,改进小麦大龄幼胚再生性能促进小麦转基因研究。【方法】以18个普通小麦基因型和5个硬粒小麦基因型为材料,对其开花授粉后15—17 d的大龄幼胚进行破碎处理、组织培养和农杆菌转化,对转化后的幼胚组织和获得的抗性再生植株分别进行组织化学染色检测和PCR检测。【结果】大龄幼胚培养2 d后破碎处理的再生率为18.2%,显著高于完整胚对照(.7%),培养2 d后进行破碎处理的再生效果高于4和6 d后破碎处理;不同基因型小麦大龄幼胚破碎处理后再生率为16.9%—46.7%,其中,Bobwhite和中8423大龄幼胚再生率达到了40%以上;大龄幼胚破碎后在弱光条件下培养,再生率进一步提高,较对照(完整胚黑暗培养)提高5.4%—47.4%;农杆菌侵染后GUS瞬时表达率为0—76.7%,其中科农199高达76.7%,其次为Verry(64.4%)和Alondra(47.2%);经PCR检测,农杆菌转化小麦大龄破碎幼胚获得了候选转基因植株。【结论】破碎处理和弱光培养显著提高了小麦大龄幼胚再生率,比对照提高5—10倍;科农199、Verry和Alondra大龄幼胚对农杆菌侵染比较敏感,适宜作为农杆菌转化的受体材料;农杆菌转化小麦大龄幼胚可以获得转基因植株。     

Regular Production of Transgenic Wheat Mediated by Agrobacterium tumefaciens

Wheat is the number one crop both in acreage and total yield in the world. Therefore, it is very important to improve wheat by gene engineering techniques even though it belongs to the plants insensitive to gene transformation, especially to Agrobacterium-mediated transformation. Wheat immature embryos of 1.0-1.5mm in size, C58c1 of Agrobacterium strain harboring pPTN249, pPTN270, pPTN254, and pSIS-GFP respectively (all the vectors contain the aphA selectable gene driven by enhanced 35S promoter and a target gene controlled by ubi promoter or E35S promoter), AB medium for Agrobacterium activate culture, WCC medium for co-culture, were used in this study. The embryos with 4 days of pre-culture were transferred onto selection medium with 10mg/L geneticin, 50mg/L ticarcillin, 50mg/L vancomycin, and 50mg/L cefotaxine after 30 minutes of infection and 2 days of co-cultivation with Agrobacterium. Followed callus production,shoot regeneration on selection medium, 114 resistant plantlets were obtained from 10 transformation experiments of four genotypes. By nptⅡ ELISA (nptⅡ enzyme assay), PCR, Southern blot and leaf bleach,29 positive plants were identified from two genotypes of Bobwhite and Yanglmai 10, with an average transformation efficiency of 0.82 %. The result tested by Southern blot also showed that the transgenic plants with single- copy integration of target gene took 65.52% among total positive plants. The ELISA value of transgenic plant was also related to the copies of alien DNA integrating into wheat chromosomes, the transgenic plants with single copy integration giving higher ELISA value than the ones with 2 or 3 copies integration.     

低能氩离子束介导将绿色荧光蛋白基因导入小麦的研究

用低能氩离子束介导将改良的绿色荧光蛋白基因（ｍＧＦＰ４）导入小麦栽培品种皖９２１０和皖麦３２号的成熟胚细胞。在含有１００￣１４０ｍ／Ｌ巴龙霉素培养基上继代培养后,获得了一批抗性愈伤组织。经过分化培养,皖９２１０获得５株再生苗,皖麦３２号获得３２株绿苗,对照的２００枚成熟胚未获得再生苗。对再生苗进行ＰＣＲ检测,均扩增出６００ｂｐ的ｎｐｔⅡ基因片段。取４株长势好的绿苗进行Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交分析,结果     

基因枪介导转hpa99基因小麦的获得和检测

为了探究来源于水稻细条斑病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzicola)的hpa99基因改良小麦抗赤霉病的可行性,以小麦幼胚诱导的愈伤组织为转化受体,以磷酸甘露糖异构酶(phosphomannose isomerase,PMI)作为选择标记,通过基因枪法将带有hpa99基因的表达质粒AF234296导入普通小麦品种山农15。2～3次PMI筛选后,获得38株再生植株。通过氯酚红(chlorophenol red,CPR)染色以及PMI基因和目的基因hpa99的PCR检测,获得7株阳性植株,转化率为0.108%。结果表明,hpa99已整合到小麦基因组中,获得了无抗生素标记基因的转基因小麦。     

用基因枪法将抗除草剂bar基因导入小麦的研究

用基因枪法将含有抗除草剂bar基因的植物表达载体导入优良品种小麦幼胚愈伤组织，并通过GUS瞬时表达对沉淀剂、轰击距离、金粉用量等轰击参数进行了优化。用除草剂对轰击后的材料进行分化生根筛选，共获得33株再生苗。通过PCR检测和涂叶检测，初步证明其中4株已将bar。基因整合到小麦基因组中，平均转化率为0．33％。