含多酶切位点融合黄色荧光蛋白的植物通用载体的构建与应用

以植物表达载体pCAMBIA3301为基本骨架,以黄色荧光蛋白(yellow fluorescent protein,简称YFP)为标签蛋白构建可融合目标蛋白的表达载体,并包含可用于外源基因插入的单一识别位点的核酸酶酶切位点(SpeⅠ、XbaⅠ、SmaⅠ、BamHⅠ)。为了验证载体的实用性,将构建完成的载体转化到感受态GV3101农杆菌上,进行菌落PCR鉴定,再分别瞬时转化烟草下表皮和稳定转化拟南芥。激光共聚焦显微镜观察结果显示,在阳性转基因植株上均观察到荧光,在阴性对照上没有观察到荧光,表明YFP标签蛋白在转基因受体细胞中能够正常表达。pCAMBIA3301::YFP载体的成功构建为植物蛋白亚细胞定位及过表达转基因植株等相关领域的研究提供了稳定可靠的通用型载体资源。     

禽流感病毒 HA 基因在拟南芥中的表达

将H5N1亚型禽流感病毒血凝素(HA)基因构建到植物表达载体,经农杆菌法转入拟南芥基因组中,酶联免疫吸附(ELISA)测定分析T2代转基因株系,据OD值筛选获得HA基因高效表达株系;RT-PCR及Western blot分析进一步证实,这些转基因株系均可转录HA基因,翻译形成相应的蛋白质.拟南芥叶片中表达积累的HA蛋白经亲和层析纯化,Western blot分析检测到1条分子量为65 ku的蛋白质带,与预期的HA蛋白大小完全一致,没有发生蛋白质降解现象.表明禽流感病毒HA蛋白可在植物细胞中稳定表达,植物可用于生产禽流感疫苗.     

拟南芥两个MYB基因标签融合蛋白转基因植株的获得和鉴定

[目的]进行染色体免疫共沉淀（ChIP）试验,挖掘MYB类基因At3g11280和At5g05790所调控的下游基因。[方法]在构建了标签融合蛋白植物表达载体的基础上,利用农杆菌介导的转化将这些载体转入拟南芥植物中,获得转基因植株,并用Western blotting检测标签融合蛋白在转基因植株中的表达。[结果]拟南芥植株转基因的效率很高,4种标签蛋白融合载体的转化均获得了20株以上的转基因植株。随机对4种转基因植株的8株T1代植株进行Western blotting分析,结果表明4,种转基因植株中均鉴定出阳性植株。融合蛋白的条带大小在30 kD左右,将显色信号条带与Marker比对,显示条带大小与预测蛋白大小相符。[结论]这些有融合蛋白表达的转基因植株为ChIP试验的进行提供了重要材料。     

转基因拟南芥中雌激素诱导的转录激活系统诱导条件的优化

[目的]探索雌激素诱导的转录激活系统（XVE）在拟南芥中高效表达外源蛋白的条件.[方法]构建XVE-AtNF-YA10：3×flag植物表达载体,转化拟南芥并获得了阳性植株;采用3种不同的诱导表达条件对外源蛋白的表达量进行检测.[结果] 1/2MS培养基生长10 d后的拟南芥转基因苗外源融合蛋白表达量最高,进一步研究表明1/2MS培养基生长10 d后的拟南芥转基因苗在受诱导后8、16、24和32 h外源融合蛋白均有表达,在16 h时表达量达到最高,并持续到32 h.[结论]AtNF-YA10：3×flag融合外源基因最优表达条件为1/2MS培养基生长10 d后的拟南芥转基因苗雌激素诱导16 h.     

拟南芥GDP-甘露糖焦磷酸化酶基因转化生菜的研究

维生素C是植物体内重要的抗氧化物质,同时也是人体所必需的营养物质。为了提高生菜中维生素C的含量,根据GenBank中拟南芥GDP-甘露糖焦磷酸化酶基因（GMP）序列设计特异引物,从拟南芥cDNA中扩增出了GMP基因编码区片段,分别连上CaMV 35S启动子、MYC序列和NOS终止子后将含GMP基因的表达盒插入到植物表达载体pCAMBIA2301中,获得含有GMP基因的植物表达载体p2301-GMP-myc。通过农杆菌介导法转化生菜,获得了64株转基因植株,PCR检测以及荧光定量PCR分析证实外源基因已被成功导入生菜基因组中并表达。采用HPLC-ELSD测定转基因生菜中维生素C的含量。结果表明,大多数转基因生菜中维生素C的含量高于对照植株。转基因生菜中维生素C含量最高的约为对照的2.5倍。该研究证明过量表达GMP基因是提高生菜中维生素C含量的有效方法。     

人成纤维细胞生长因子-21的拟南芥油体表达系统构建

【目的】利用拟南芥(Arabidopsis thaliana)油体系统表达人成纤维细胞生长因子-21(Fibroblastgrowth factor-21,FGF21),为利用植物油体表达系统规模化生产FGF21奠定基础。【方法】以磷酸甘露糖异构酶(PMI)基因作为转基因植物的安全筛选标记,将带有组氨酸标签的人源FGF21基因与大豆油体蛋白基因融合,克隆至大豆油体蛋白启动子驱动的表达载体pCAMBIA1390MDo(p1390MDo)上,构建植物双元表达载体p1390MDoFGF21。采用冻融法将植物双元表达载体p1390MDoFGF21转入农杆菌GV3101,花粉管导入法转化拟南芥,采用PCR检测、Southern blot筛选转基因拟南芥阳性植株(T0),并对FGF21蛋白在转基因拟南芥种子(T1)中的表达进行Western blot分析。【结果】成功构建了带PMI安全筛选标记的植物双元表达载体p1390MDoFGF21。PCR扩增和Southern blot分析结果表明,重组FGF21融合基因以单拷贝和多拷贝2种方式已整合到转基因拟南芥基因组中。BandScand 5.0软件和Western blot分析结果显示,FGF21融合蛋白约占转基因拟南芥种子可溶性蛋白的3.76%,并具有良好的免疫原性。【结论】FGF21融合基因已经转入拟南芥中,并在以PMI为选择标记的转基因拟南芥种子中成功高效表达。     

拟南芥两个MYB基因标签融合蛋白植物表达载体的构建

[目的]研究MYB类基因At3g11280和At5g05790的详尽功能。[方法]利用农杆菌将标签蛋白融合的At3g11280和At5g05790基因转化拟南芥,利用转基因植株中标签蛋白的抗体进行染色体免疫共沉淀（ChIP）试验,挖掘两基因所调控的下游基因。[结果]首先扩增了At3g11280和At5g05790基因的CDS片段,随后经过一系列的亚克隆过程将两个基因和标签蛋白的融合基因片段克隆到载体pWM101上,位于35S启动子的下游,转录受35S启动子的调控。[结论]成功地构建了标签融合蛋白植物表达载体,两个基因分别携带HA和Flag标签,载体的成功构建将为ChIP试验奠定基础。     

水稻Rubisco激酶基因叶绿体转运肽增强转基因表达

将水稻RCA基因N端预测的转运肽(TP)序列融合报告基因GFP,构建瞬时表达载体pGD-RCATP-GFP,转化农杆菌后,注射侵染烟草叶片,通过荧光显微镜观察瞬时表达情况,结果表明外源蛋白GFP定位在叶绿体上,依此预测水稻RCA基因N端48aa为叶绿体转运肽。将该序列与报告基因GUS融合,构建植物表达载体p1300-RCATP-AGS,转化水稻后,检测阳性株叶片的GUS酶活,其GUS蛋白表达效率是未连有叶绿体转运肽的转基因植物的4.2倍左右。     

基于Spyligase技术的禽流感血凝素H5HA10多聚体抗原的高效制备

利用Spyligase技术在H5HA10序列的C端和N端分别加上SpyTag和KTag序列,并分别与His6-ArsC、His6-PAS200、His6-XTEN、His6-PEAT、SiTag3-SUMO、SiTag3-MBP、SiTag3-PAS200、SiTag3-XTEN和SiTag3-ArsC促溶标签相连,成功构建了含9种不同促溶性标签的H5HA10重组表达载体,同时构建了1种含有Cherry标签的Spyligase重组表达载体。将这10种重组载体分别转化至大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达和SDS-PAGE分析,筛选出可以显著促进H5HA10重组蛋白表达的融合标签ArsC。通过优化诱导表达条件,在大量诱导表达、纯化后成功获得了高纯度的H5HA10和Spyligase重组蛋白,最终在PCT缓冲体系中, Spyligase促使H5HA10重组蛋白的蛋白聚合,形成了环化单体、三聚体、六聚体以及九聚体。     

基于Spyligase技术的禽流感血凝素H5HA10多聚体抗原的高效制备

利用Spyligase技术在H5HA10序列的C端和N端分别加上SpyTag和KTag序列,并分别与His6-ArsC、His6-PAS200、His6-XTEN、His6-PEAT、SiTag3-SUMO、SiTag3-MBP、SiTag3-PAS200、SiTag3-XTEN和SiTag3-ArsC促溶标签相连,成功构建了含9种不同促溶性标签的H5HA10重组表达载体,同时构建了1种含有Cherry标签的Spyligase重组表达载体。将这10种重组载体分别转化至大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达和SDS-PAGE分析,筛选出可以显著促进H5HA10重组蛋白表达的融合标签ArsC。通过优化诱导表达条件,在大量诱导表达、纯化后成功获得了高纯度的H5HA10和Spyligase重组蛋白,最终在PCT缓冲体系中, Spyligase促使H5HA10重组蛋白的蛋白聚合,形成了环化单体、三聚体、六聚体以及九聚体。     

猪伪狂犬病毒gD蛋白抗原表位的克隆及表达

依据Gen Bank中猪伪狂犬病毒(PRV)BJ/YT株gD基因设计引物,扩增gD蛋白抗原表位,其设计扩增长度为702 bp,将扩增片段克隆到p MD19-T载体获得p MD19-T-gD。利用Bam HⅠ和HindⅢ限制性内切酶双酶切p MD19-T-gD质粒,进行琼脂糖凝胶电泳并回收酶切片段,将回收片段与原核表达载体p ET-28a连接,成功构建了p ET-28a-gD表达载体。将表达载体转化感受态细胞Rosetta,IPTG诱导表达后,进行SDS–PAGE电泳,结果显示,在25 ku处出现特异性蛋白质条带。Western blot分析结果表明,表达产物能够被PRV的阳性血清识别。综上,成功克隆并表达了gD蛋白抗原表位,且其表达产物具有较好的生物学活性。     

陆地棉转录因子GhNAC7的克隆及功能分析

【目的】从陆地棉中克隆GhNAC7,分析其结构和功能,研究其在棉花不同组织中以及叶片不同发育时期的表达量。并转入拟南芥进一步探究其在棉花叶片衰老过程中的作用。【方法】利用中国农业科学院棉花研究所棉花生物学国家重点实验室建立的棉花衰老叶片cDNA文库中的序列,获得1个含有NAM结构域的EST,使用Oligo6.71设计引物,重新在陆地棉叶片cDNA中进行克隆。使用Gene Structure Display Server软件分析GhNAC7结构,使用在线工具Plant CARE分析启动子序列,利用在线工具Gen Scan进行氨基酸序列翻译。同时,利用拟南芥基因组数据库(TAIR)进行序列比对,选取得分较高的NAC家族基因,使用MEGA 6.06软件和Gene Doc软件进行进化树分析和氨基酸比对。以XbaⅠ和SacⅠ为酶切位点构建35S::GhNAC7-GFP融合表达载体,分析其在洋葱表皮细胞中的瞬时表达,进行亚细胞定位。利用实时荧光定量PCR技术分析GhNAC7在棉花不同组织、不同叶片发育时期以及在200μmol·L~(-1) ABA调控下的表达量。通过构建p GhNAC7-GUS融合表达载体并转拟南芥,分析其启动子特异性。以Eco RⅠ和SalⅠ为酶切位点,利用p BI101和p BI121载体,分别构建融合表达载体并转拟南芥进行过表达分析。【结果】从陆地棉中成功克隆GhNAC7,其全长为1 064 bp,包含3个外显子,2个内含子。生物信息学分析结果表明,GhNAC7开放阅读框为834 bp,可编码277个氨基酸,其蛋白质分子量为31.35 k D,等电点为9.22。结构域分析表明其属于NAC转录因子的NAM亚家族,进化树分析显示GhNAC7与ANAC041、ANAC083同源性最高,其中,GhNAC7与ANAC083结构域位置均为17—58 aa。其启动子核心元件包含一系列与衰老、激素、胁迫相关的顺式作用元件。亚细胞定位表明其蛋白为核蛋白。组织特异性表明GhNAC7在真叶、子叶、花、花药和衰老真叶中均明显表达,其中在衰老的真叶中表达量最高。启动子特异性分析表明,其GUS活性在衰老的叶片中最强。在拟南芥中过表达该基因,转基因植株比野生型表现出明显的衰老症状。荧光定量PCR分析表明,ABA处理后6 h GhNAC7明显上调表达,并在48 h表达量达到最高,这表明ABA可调控GhNAC7表达从而调节棉花叶片衰老。【结论】GhNAC7可以促进棉花叶片衰老并受ABA的调控。     

马铃薯Y病毒外壳蛋白基因在大肠杆菌中的表达

用内切酶BglⅡ和EcoRⅠ将PVY-cp基因自pGEM-pvy切下,定向插入到经BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切的表达质粒pBV220的启动子Pr、Pl的下游,构建了该基因的原核表达载体pBV-pvy。SDS-PAGE凝胶电泳结果表明:PVY-cp基因在大肠杆菌HB101中经温度(42℃)诱导后,可特异地高效表达大小约30KD蛋白。Western印迹杂交进一步鉴定了该表达蛋白确为PVY外壳蛋白。     

豆荚特异性启动子Pmsg的克隆及抗大豆食心虫植物表达载体的构建

植物基因工程载体构建时,一般采用组成型启动子,因涉及转基因食品安全性问题,在社会上引起争议。采用组织特异性启动子代替组成型启动子,既可调控下游基因的表达又能解决转基因食品安全性问题。采用同源克隆方法从栽培大豆绥农14中克隆了2 278 bp的豆荚特异性启动子Pmsg,与GenBank上的大豆msg基因启动子序列相似性为99%。构建了由启动子Pmsg调控经人工改造、具有抗大豆食心虫功能的基因(Cry1Iem)的表达载体pBMBt,以及由种子特异性启动子PGy2调控Cry1Iem基因的表达载体pBGBt,为抗大豆食心虫基因工程研究奠定了重要基础。     

笋瓜韧皮部特异性启动子的克隆分析及新型植物表达载体构建

根据已报道具韧皮部组织特异性的笋瓜韧皮部蛋白2（PP2）基因序列设计引物，以山西本地种笋瓜叶片基因组DNA为模板，用PCR法扩增得到了长度为966bp的PP2基因启动子片段，克隆入pUCm—T载体后，经鉴定获得了新的重组质粒pUCm—PSP，测序和序列分析表明与两个已报道的片段分别有95％和99％的同源性，推测具有相似的启动子功能。分别用限制性内切酶PstⅠ和BglfⅡ双酶切重组质粒pUCm—PSP和由CaMV35S组成型启动子驱动GFP报告基因的双元植物表达载体pCAMBIA1302，分别回收pUCm—PSP重组质粒中的PSP小片段和pCAMBIA1302植物表达载体中去掉GFP报告基因上游CaMV35S组成型启动子的大片段，经连接、转化和鉴定后，构建了由PSP驱动报告基因GFP的新型植物表达载体pHZ03。利用细胞感受态法将新植物表达载体分别导入根癌农杆菌EHA105、GV3101、LBA4404和发根农杆菌Ri15834中，为进一步研究其表达功能奠定了基础。     

2种启动子驱动下的VaCBF3基因植物表达载体构建

为了探索山葡萄CBF3基因(VaCBF3)对杨树的遗传转化的影响,及组成型启动子和诱导型启动子对转基因植株生长的影响,分别构建由2种类型启动子调控的植物表达载体.根据GenBank上公布的rd29A基因序列设计特异性引物,利用PCR方法从拟南芥基因组DNA中克隆rd29A基因启动子片段,利用限制性内切酶通过酶切、连接构建由组成型启动子35S和诱导型启动子rd29A基因启动子驱动的VaCBF3基因植物表达载体,利用冻融法完成重组质粒对根癌农杆菌LBA4404的转化.试验结果表明,所克隆的rd29A基因启动子片段序列分析表明该启动子片段长度为945bp,与GenBank中基因序列同源性达99％,具有DRE、ABRE、TATAbox和CAAT box4个完整的顺式作用元件,具有启动子功能.经过酶切、连接成功地将目的基因与载体质粒连接,并将重组质粒导入至根癌农杆菌LBA4404中,为下一步利用农杆菌介导法对杨树的遗传转化及研究2种启动子的启动效率奠定了一定的基础.     

IL15/PAP融合蛋白基因克隆及其原核与植物表达载体的构建

将IL15和PAP基因通过一甘氨酸接头(Gly4Ser)3连接在一起,构建原核和植物表达载体,以期表达具有导向杀伤活性的融合蛋白.在引物设计中,通过引物在IL15基因下游引入(Gly4Ser)3的编码序列和BamHI位点,然后采取分步克隆及PCR、酶切、连接等一系列分子克隆方法,将IL15和PAP基因融合在一起,构建融合蛋白的原核与植物表达载体.经PCR和NcoI/SalI双酶切鉴定及测序,证实原核表达载体pET32a-IL15/PAP及植物表达载体pB-I P中均插入了正确的融合基因序列.     

H5N1亚型禽流感病毒血凝素(HA)基因的表达及纯化

利用PCR方法从含禽流感病毒HA基因的质粒T-HA上扩增HA基因,再将其克隆到原核表达载体pET28a中,用E.coliBL21(DE3)原核表达,SDS-PAGE和Western-blot对表达蛋白进行鉴定。Western-blot结果表明,表达产物具有免疫学活性,蛋白的分子量约为60kD,位于包涵体中。包涵体经变性、复性处理,表达蛋白能与H5亚型AIV阳性血清特异性反应,具有良好的抗原性。ELISA检测结果表明,用此纯化蛋白作为包被抗原检测H5N1亚型AIV血凝素抗体具有良好的灵敏性。