鲨烯环氧酶基因的克隆及其在人参根组织中的表达

对人参根组织中的鲨烯环氧酶基因进行了克隆与序列分析,并利用相对荧光定量Real-time PCR法检测了鲨烯环氧酶基因不同年生人参根组织中的表达水平.结果表明:克隆人参根中鲨烯环氧酶基因全长编码区cDNA为1 611 bp,编码537aa长的多肽,其核苷酸和氨基酸序列与GenBank中人参鲨烯环氧酶基因序列(登录号:AB122078.1)对比,同源性分别为99.75％和99.81％.相对荧光定量PCR差异分析发现鲨烯环氧酶基因在一年、三年、四年、五年生人参根组织中均有表达,其中在五年生人参根中表达水平最高.     

葡萄鲨烯合成酶基因的克隆与序列分析

应用RT-PCR和RACE技术,克隆获得了葡萄鲨烯合成酶基因(SQS)的全长cDNA(1595 bp)。序列分析结果表明:该基因包含1个完整的1242 bp开放阅读框,编码413个氨基酸残基;葡萄SQS与三七(Panax notoginseng)、人参(Panaxginseng)、甘草(Glycyrrhiza uralensis)的SQS分别有84%、83%、84%的一致性。     

植物三萜皂苷生物合成及关键酶鲨烯合酶的研究进展

三萜皂苷(triterpenoid saponins)是一类重要的植物次生代谢产物,有抗菌和抗虫害的作用,可用作药物,具有重要的商业价值.三萜皂苷含量和组成的变化又取决于三萜皂苷合成途径中的一些关键酶及其在细胞中的表达水平.鲨烯合酶(Squalene syntase,SS)是三萜皂苷生物合成的第一个关键酶,其含量和活性决定了后续产物的产量.因而若能在分子水平上实现对SS的调控,将为人工大量生产三萜皂苷提供可能.全文综述了三萜皂苷的生物合成途径及该途径的关键SS的研究进展.     

植物甾醇与三萜类皂苷生物合成基因调控的研究进展

植物甾醇和三萜类皂苷是2种具有调节生物体系免疫力,抗血糖过多,抗癌症等生理功能的植物次生代谢产物。它们在生物合成过程中有许多关键酶,如鲨烯合成酶(SS)、鲨烯氧化酶(SE)、氧化鲨烯环化酶(OSCs)和糖基转移酶(GT)等。综述了这些关键酶在催化机理、基因克隆与表达调控方面的研究进展,并简要探讨了通过这些关键酶的代谢工程研究来增产植物甾醇和三萜类皂苷的广阔前景。     

人参SE基因RNAi载体的构建及转化

在克隆人参鲨烯环氧酶基因保守区约364 bp片段基础上,构建该基因的RNAi植物双元表达载体pMHZ111-SE,并利用农杆菌介导的遗传转化方法转化人参愈伤组织,通过HPLC方法测定转基因和非转基因人参愈伤组织中6种单体皂苷的含量。结果表明,经干扰载体转化的人参愈伤组织中Rg1、Re、Rc单体皂苷含量均有大幅度下降,其他3种皂苷含量变化不明显。     

龙牙楤木SE基因克隆与植物表达载体构建

采用RT-PCR的方法,从龙牙木忽木中克隆到鲨烯环氧酶(SE)基因,该基因的cDNA全长为1 682 bp,含有1 644 bp的开放阅读框(ORF),编码547个氨基酸,将所得的序列提交GenBank数据库,登录号为GU354314.序列分析结果表明:龙牙楤木SE基因的氨基酸序列与人参、三七、绞股蓝的同源性>90%,...     

人参鲨烯环氧酶基因的克隆与原核表达

【目的】克隆人参皂苷生物合成途径中的鲨烯环氧酶（SQE）基因,并进行原核表达与纯化,初步探讨SQE活性与人参皂苷生成量之间的关系。【方法】以4年生人参根组织须根为材料,提取其总RNA,反转录为cDNA。以合成的cDNA为模板,对SQE基因进行克隆,再将其插入原核表达载体pET-30a中,构建pET-30a-SQE重组质粒,经酶切和测序鉴定后,转入Rosetta大肠杆菌,经0.8 mmol/L IPTG 37 ℃诱导表达4 h后,进行SDS-PAGE电泳检测,采用NiAgarose亲和层析柱纯化目的蛋白,利用液相色谱串联质谱联用技术（LC-MS）检测SQE的活性。【结果】获得了人参SQE基因1 611 bp的全长编码区cDNA。酶切和测序结果表明,原核表达载体pET-30a-SQE构建成功;SDS-PAGE分析显示,在Rosetta大肠杆菌中成功诱导表达了SQE融合蛋白,且纯化后的目的蛋白纯度较高;LC-MS联用检测结果发现,随着SQE用量的增加,达玛烯二醇的生成量递增。【结论】克隆了人参SQE基因,获得了在体外具有生物学活性的SQE蛋白,并证实了其活性与人参皂苷生成量有很大的相关性。     

鲨烯合酶RNAi载体构建及对水稻的遗传转化研究

鲨烯合酶(Squalene synthase,SQS)是ABA生物合成途径上游支路的一个关键酶。本研究克隆了406 bp的SQS基因片段,将其分别正向和反向插入干扰载体p YLRNAi.5中,经过酶切鉴定证实成功构建了干扰载体p YLRNAi-SQS,通过农杆菌介导法转入水稻品种Kasalath中,PCR初步鉴定获得了20株转基因阳性植株,进一步通过半定量RT-PCR分析,阳性转基因材料与野生型Kasalath相比,Os SQS3都有不同程度的下调,而Os SQS7变化不明显。证明转入的SQS基因只对Os SQS3起干涉效果,而对Os SQS7无作用,推测水稻中两个SQS基因可能存在不同的作用机制。本研究为进一步研究水稻中Os SQS3和Os SQS7各自的生物学功能奠定了基础,同时也为研究SQS调控ABA的生物合成提供了研究材料。     

人参鲨烯环氧酶基因的克隆与序列分析

以五年生人参根组织为试验材料,提取总RNA,反转录合成cDNA,利用RT-PCR法对人参鲨烯环氧酶(SQE)基因的cDNA进行克隆及序列分析,初步探讨人参皂苷生物合成途径中的影响因子。结果表明:获得人参SQE基因全长片段大小为1 636 bp,开放阅读框长1 611 bp,编码536个氨基酸残基,与其他植物核苷酸序列具有较高同源性,其中与三七、龙牙惚木、刺五加同源性分别为98%、96%、90%。     

佛手瓜鲨烯合酶基因克隆及酶分子结构分析

[目的]克隆佛手瓜鲨烯合酶(SQS)基因,并基于克隆的SQS序列分析该酶的分子结构,为佛手瓜生物活性成分的利用提供理论依据。[方法]根据SQS基因5'末端保守序列和3'race方法扩增的佛手瓜SQS基因3'末端序列设计佛手瓜SQS基因克隆引物。扩增的佛手瓜SQS基因片段插入p GEM-T Easy Vector后经DNA测序。应用生物信息学方法分析克隆序列的开放阅读框架(ORF)、酶蛋白的疏水性/亲水性和蛋白质磷酸化位点,预测酶蛋白的二级结构、结构域、三级结构和跨膜区。以布朗葡萄藻为outgroup,应用MEGA 5.0进行UPGMA算法构建系统树,并进行1 000次的Bootstrap测试。[结果]佛手瓜SQS由417氨基酸残基构成,等电点为6.983。构象预测提示该酶二级结构以α螺旋为主,是一种只有三级结构的单体酶,其活性中心是主要由几个α螺旋围绕形成的穴状结构,酶蛋白肽链中具有1个跨膜区。结构域分析表明SQS属于异戊二烯合酶家族。磷酸化位点分析显示该酶共有17个磷酸化位点,其中,S48位于与酶活性中心相关模体中,而S196为陆生植物SQS基因的正选择位点。以佛手瓜SQS基因ORF序列构建系统发生树得到的系统发生分类结果与形态学分类结果一致。[结论]佛手瓜SQS是由417氨基酸残基构成的单体酶,具有1个跨膜区和17个磷酸化位点,其中,S48和S196可能是佛手瓜SQS酶活性调节的关键性磷酸化位点。     

高坡猪GH基因不同基因型对其部分生产性能的影响

采用PCR-RFLP-ApaⅠ方法检测高坡猪GH基因-119~ 486 bp片段的多态性,探讨了不同基因型对其部分生产性能的影响。结果表明:产生2个等位基因A(449 bp)和B(316 133 bp),其频率分别为0.54和0.46;3种基因型:AA、AB和BB,其频率分别为0.26、0.56和0.18;除6月龄腹围和背膘厚外,其余指标值均以BB基因型最高,AA基因型的6月龄腹围和瘦肉率与BB基因型相比差异显著(P<0.05),其他指标在各基因型间差异均不显著(P>0.05)。表明,A可能是小型猪的有利等位基因,B则可能是大型猪的有利等位基因。     

云南4个地方鸡种PRL外显子5基因多态性研究

[目的]研究云南4个地方鸡种PRL外显子5基因的多态性。[方法]对云南地方鸡种剥隘小种鸡（BA）、大围山微型鸡（DW）、武定鸡（WD）、盐津乌骨鸡（YJ）4个鸡种P地基因第5外显子PCR-SSCP进行检测分析,并采用Progene,Editplus等软件进行数据分析。[结果]PcR-SSCP检测分析发现,PRL外显子5有4个SNP位点,均有多种基因型。在PRL-exon5681、742和816bp处呈现基因多态性,剥隘小种鸡、武定鸡、盐津乌骨鸡有AA、BB和AB3种基因型,大围山微型鸡有AA和AB2种基因型。PRLR-exon5950bp处有1个SNP,4种鸡均有AA、BB和AB3种基因型。[结论]A基因可能是影响繁殖性状的优势基因。     

牦牛CAST基因部分序列的SNPs研究

采用PCR-SSCP技术,设计2对特异性引物分别对牦牛钙蛋白酶抑制蛋白基因部分内含子2、外显子3、部分内含子3和外显子8、内含子8部分序列进行单核苷酸多态性分析.结果表明:在第2内含子存在一段CTTTTTT的缺失,表现出3种基因型,其中AA、AB、BB基因型频率分别为0.7514、0.2265和0.0221,A、B等位基因频率分别为0.8646和0.1354;在第3外显子处发生2个碱基突变,分别是40455bp处G→A和40463bp处A→G的转换,40455bp和40463bp处均表现AA和AB2种基因型,2个位点AA、AB基因型频率均为0.7293、0.2707,A、B等位基因频率均为0.8646、0.1354;在第8内含子85170bp发生了A→G的转换,表现出AA和AB2种基因型,其中,AA、AB基因型频率分别为0.6354、0.3646,A、B基因频率分别为0.8177、0.1823.CAST40400、CAST40455、CAST40463和CAST85170处的遗传杂合度分别为0.2265、0.2707、0.2707和0.2990,多态信息含量分别为0.2067、0.2067、0.2067和0.2537.牦牛在CAST40400处处于Hardy-Weinberg平衡状态,在CAST40455、CAST40463和CAST85170处均处于Hardy-Weinberg不平衡状态.     

芝麻高度不育材料基因组DNA提取及RAPD反应体系的建立

以临时保持系WB51220、两用系0176A不育株、可育株0176B和皖芝1号等4份材料的叶片为研究材料,对其基因组DNA的提取及对RAPD反应体系进行优化。结果表明,改良的CTAB法获得的芝麻基因组DNA片段大小经电泳检测满足RAPD等遗传多样性分析要求;筛选出RAPD最佳反应体系：20滋L反应体系含有1.5 U Taq DNA聚合酶,0.25 mmoL/L dNTP,2.0 mmoL/L Mg2＋,0.75滋moL/L引物;4个不同品种的叶片基因组DNA的电泳条带之间有着明显差异,他们共有的条带为1 900、1 800、1 000、900 bp;不同的是,临时保持系WB51220比两用系0176A不育株少了1个2 000 bp的条带,可育株0176B比两用系0176A不育株少了1个450 bp条带,皖芝1号比可育株0176B少了1个750 bp和1个1 200 bp的条带。     

猪NCOA1基因PCR-RFLP多态性分析（摘要）（英文）

[目的]研究猪NCOA1基因的PCR-RFLP多态性,为猪的分子育种和标记辅助选择提供理论依据。[方法]以81头山东寿光六和原种猪场的长白猪为研究对象,采取常规酚-氯仿抽提法从猪耳组织提取基因组DNA,以基因组DNA为模板进行PCR扩增获得440 bp的NCOA1基因目的片段,利用限制性内切酶RsaⅠ对PCR产物进行酶切和琼脂凝胶电泳检测,并计算各等位基因频率和基因型频率。[结果]琼脂糖电泳检测酶切产物出现3种基因型：AA型（1条带：440 bp）、AB型（3条带：440、282、158 bp）、BB型（2条带：282、158 bp）;基因型频率分别为0.54、0.43和0.03;A和B 2个等位基因的基因频率分别为0.76和0.24。[结论]该研究猪群中,A为优势等位基因,AA基因型频率较高。     

绵羊GH基因的Pvu Ⅱ 位点的多态性与其生长性状的关联分析

为探讨GH基因与绵羊的生长发育性能的关系,采用PCR-RFLP的方法分析了GH基因内含子Ⅱ的PvuⅡ位点在5个绵羊群体中的多态性,并与绵羊体质量和体尺等性状进行了关联分析。结果表明:GH基因内含子Ⅱ的PvuⅡ位点在5个绵羊中检测到两种基因型即AB基因型(264 bp/429 bp/693 bp)和BB基因型(264 bp/429 bp)。大尾寒羊、小尾寒羊、豫西脂尾羊、湖羊、杜泊羊的AB基因型频率分别为0.786、0.750、0.424、0.471、0.459,BB基因型频率分别为0.214、0.250、0.576、0.529、0.541。湖羊的GH基因内含子Ⅱ的PvuⅡ位点显著偏离Hardy-Weinbery平衡状态(P<0.05),小尾寒羊、豫西脂尾羊、杜泊羊的GH基因内含子Ⅱ的的PvuⅡ位点极显著偏离Hardy-Weinbery平衡状态(P<0.01)。关联分析表明,AB基因型绵羊的体质量、体长、胸宽、臀端高、管围、尻高、颈长等指标显著大于BB基因型绵羊(P<0.05)。研究表明,GH基因内含子Ⅱ的PvuⅡ位点对绵羊的生长发育性能有一定影响。     

3种猪孕酮受体基因(pgr)多态性分析

采用混合基因组DNA池PCR扩增和测序技术,对小梅山猪、枫泾猪、大白猪pgr基因的外显子区域进行扫描,共发现1个单核甘酸多态性位点(SNP)。外显子1序列中1 319 bp处发生C→T的碱基突变,即C1319T,未引起氨基酸的变化,属于同义突变;针对突变位点,建立错配PCR–限制性长度多态性(RFLP)方法进行检测,发现3种猪的pgr基因可以分为AA、BB、AB 3个基因型,小梅山和枫泾猪有AA、AB 2种基因型,大白猪中有BB、AB 2种基因型。     

猪NCOA1基因PCR-RFLP多态性分析

[目的]研究猪NCOA1基因的PCR-RFLP多态性,为猪的分子育种和标记辅助选择提供理论依据。[方法]以81头山东寿光六和原种猪场的长白猪为研究对象,采取常规酚-氯仿抽提法从猪耳组织提取基因组DNA,以基因组DNA为模板进行PCR扩增获得440bp的NCOA1基因目的片段,利用限制性内切酶RsaⅠ对PCR产物进行酶切和琼脂凝胶电泳检测,并计算各等位基因频率和基因型频率。[结果]琼脂糖电泳检测酶切产物出现3种基因型：AA型（1条带：440bp）、AB型（3条带：440、282、158bp）、BB型（2条带：282、158bp）;基因型频率分别为0.54、0.43和0.03;A和B2个等位基因的基因频率分别为0.76和0.24。[结论]该研究猪群中,A为优势等位基因,AA基因型频率较高。