BIOLOG碳源筛选与分离技术结合研究新疆哈密南湖嗜盐菌多样性

[目的]获得新疆哈密南湖的嗜盐菌,并分析其生物多样性,以期为分离培养基碳源设计引入一种快速可行的方法.[方法]利用BIOLOG筛选碳源并结合可培养方法分离哈密南湖中的嗜盐菌,通过16S rRNA基因序列系统发育分析法初步确定所分离菌株的分类地位,获得嗜盐菌的多样性信息.[结果]BIOLOG方法筛选出5种碳源,分别为海藻糖、蔗糖、柠檬酸、甘油和甘露醇.通过将筛选碳源添加至分离培养基的方法,共分离得到细菌和放线菌27株,分属于细菌域中3个门7个科14个属.多数菌株归属于厚壁菌门(Firmicutes),最优势菌株属于薄壁芽孢杆菌属(Gracilibacillus).其中6株菌株的16S rRNA基因序列与最近缘种的同源性在94.24;～96.86;,可能为潜在的新种或新属.[结论]新疆哈密南湖嗜盐细菌和放线菌都具有较为丰富的生物多样性,其嗜盐菌主要以薄壁芽孢杆菌和盐单胞菌为主,并且该地区可能含有丰富的嗜盐菌新物种,具有进一步开发研究价值.     

嗜盐真菌Aspergillus montevidensis生物特性研究

【目的】从形态学角度对分离自陕北花马盐湖的嗜盐真菌Aspergillus montevidensis生物特性进行了初步探究,为下一步耐盐基因的筛选及新型耐盐农作物的获得提供理论依据。【方法】将嗜盐真菌A.montevidensis分别接种于不同碳源(淀粉、纤维素、麦芽糖、蔗糖、葡萄糖)、不同氮源(硝酸铵、氯化铵、酵母粉、蛋白胨、硝酸钾)以及不同碳氮比培养基中培养,研究高盐环境中不同碳源、不同氮源以及不同碳氮比对嗜盐真菌A.montevidensis生长速率、菌丝体干质量、菌落形态以及显微形态特征的影响。【结果】嗜盐真菌A.montevidensis在盐浓度为1.5 mol/L,以蔗糖为碳源、蛋白胨为氮源的培养基上生长较快且生长状况最好,在此条件下生长速率可达0.63 cm/d,菌丝体干质量达3.05 g/L。最佳碳氮比为10∶1。【结论】嗜盐真菌A.montevidensis的耐盐受不同碳氮源的影响。     

定边盐碱土壤嗜盐菌的分离及鉴定

[目的]从陕西定边盐湖高渗极端环境中筛选分离获得嗜盐微生物,并对筛选获得的微生物进行种属鉴定。[方法]通过高盐选择性培养基平板分离法,从陕西定边盐湖土壤样品中,分离筛选获得极端嗜盐菌株,该菌最适生长温度35℃,最适p H值8.0。通过传统的表型特征(包括形态学观察、生长因子试验、生理生化特征)和系统发育学16S r DNA序列分析鉴定嗜盐菌株的分类学地位。[结果]获得一株最适生长盐浓度在10%~20%的细菌菌株A426,初步鉴定其为盐单胞菌科(Halomonadaceae)盐单胞菌属(Halomonas)菌株。[结论]成功获得定边盐湖地区中度嗜盐菌株A426。     

新疆达坂城盐湖嗜盐细菌分离鉴定及活性分析

【目的】研究新疆盐湖嗜盐微生物资源及发掘菌株发酵液的农用和医药活性。【方法】采集达坂城区达坂城盐湖湖边的淤泥样品进行菌株分离鉴定,采用4种不同分离培养基,使用平板稀释涂布法结合16S rRNA进行分离鉴定;并用平板对峙法对分离到的放线菌进行植物病原菌拮抗活性研究,用HepG2细胞增殖测定其抑制肿瘤活性。【结果】获得细菌18株,鉴定为14个属,其中芽孢杆菌属(Bacillus)、链霉菌属(Streptomyces)、拟诺卡氏菌属(Nocardiopsis)为优势种群。有3株放线菌具有拮抗植物病原菌活性,其中菌株Tsukamurella sinensis DBC26和Nocardiopsis crassaminis DBC31有拮抗棉花枯萎菌活性,Streptomyces longispororuberDBC5有拮抗水稻恶苗菌活性。菌株DBC5、DBC9和DBC10对HepG2细胞增殖的抑制率分别为96.4%、91.8%和87.8%。【结论】达坂城盐湖细菌在数量和种类上存在丰富的多样性,且稀有放线菌种类较为丰富,并且其发酵液具有拮抗植物病原菌活性和抑制肿瘤细胞增殖活性。     

华北大黑鳃金龟幼虫肠道菌的分离及对农药的降解

采用4种培养基对金龟幼虫肠道内微生物进行分离培养,并通过16S rRNA测序进行初步鉴定,将分离获得的菌株接种于含辛硫磷和毒死蜱的基础盐培养基上,初步测定对肠道内微生物降解农药的能力。结果表明,选用的4种培养基中,淀粉-酪素培养基获得的微生物数量最多,羧甲基纤维素钠培养基次之,甘油天门冬氨酸培养基最差。对13株有代表性的菌株进行测序分析,初步鉴定这些微生物分属9个属,在分离筛选的菌株中随机挑选供试的28株菌株中,在以毒死蜱(浓度100 mg/L)为唯一碳源的基础盐培养基中,能形成菌落的菌株为8株,在以辛硫磷为唯一碳源的基础盐培养基中,能形成菌落的菌株为19株,表明肠道中有一些微生物对农药有降解作用,其中对辛硫磷降解作用优于毒死蜱,说明在防治华北大黑鳃金龟时,毒死蜱防治效果可能优于辛硫磷。     

一株产碱性磷酸酶菌株的鉴定及酶的纯化

[目标]筛选分离自硝尔库勒盐湖产碱性磷酸酶菌株,对菌株进行多项分类鉴定,分离纯化碱性磷酸酶。[方法]利用微孔板法,筛选碱性磷酸酶产生菌。通过形态特征观察、生理生化测定、利用硫酸铵沉淀、阴离子交换层析和分子筛层析得到电泳纯的酶16S rRNA序列分析等实验,确定菌株的分类地位。[结果]从我国硝尔库勒盐湖样品中分离得到一株产碱性磷酸酶酶的菌株tarim4,经过多项分类鉴定显示它是与Natrinema pellirubrum不同的新菌株。[结论]多项分类结果鉴定,菌株为Natrinema pellirubrum tarim 4。该菌株产生的碱性磷酸酶有进一步的研究价值。     

嗜盐枝芽孢菌A355的分离及种属鉴定

通过高盐选择性培养基平板分离法,从陕西定边盐湖土壤样品中分离筛选极端嗜盐菌株,并通过传统的表型特征(包括形态学观察、生长因子实验、生理生化特征)和系统发育学16S rDNA序列分析鉴定嗜盐菌株的分类学地位。结果表明,分离筛选出1株最适生长盐浓度在10%-15%的细菌菌株A355,初步鉴定其为中度嗜盐菌,属于厚壁菌门(Firmicutes)芽孢杆菌科(Bacillaceae)枝芽孢菌属(Virgibacillus salarius sp.)。     

中国科学院微生物资源前期开发国家重点实验室开放课题：新疆罗布泊洼地和艾丁湖沉积物放线菌多样性研究——项目简介

本课题瞄准极端环境放线菌的分离技术这一关键难题，充分利用新疆极端高盐环境的区域性优势和地带性特点，以罗布泊和艾丁湖2个古老盐湖为研究对象，采用PCR-RFLP技术结合系统发育分析来探索盐湖沉积物放线菌的组成，指导人们按照与之系统发育关系相近的可培养放线菌的新陈代谢特性及营养需求设计培养条件，     

稀有放线菌的选择性分离、鉴定及生物活性研究

聚乳酸(PLA)和丝蛋白粉分别作为选择性碳、氮源可以有效提高稀有放线菌的分离效率,同时海洋环境中蕴藏着丰富的活性稀有放线菌,是发现新药的有效途径。为了筛选并鉴定海洋环境中产生活性物质的稀有放线菌,以聚乳酸和丝蛋白粉分别作为选择性碳、氮源,配制6种分离培养基,用平板稀释法分离放线菌;并用滤纸片法和MTT法对供测菌株发酵产物进行活性筛选。结果表明:共分离出96株稀有放线菌,分属于11个属;其中,80株菌对7种靶标菌显示出一定的抗菌活性;78株菌对肿瘤细胞具有不同程度的细胞毒活性。另外,比较了6种培养基对稀有放线菌的分离效果。从分离结果来看,最理想的是聚乳酸培养基。     

新疆南部巴楚地区干旱生境土壤放线菌的研究

采用常规方法研究了新疆南部巴楚地区特殊生境土壤放线菌区系、放线菌的拮抗性及耐盐性。结果表明:1供试土壤放线菌的数量与土壤有机质含量呈极显著相关,与土壤pH和全盐量无显著相关性;供试土壤放线菌区系较单一,以链霉菌属为主(占总数的91.8%),小单孢菌属极少;链霉菌可分11个类群,以灰褐类群为优势类群;土壤含盐量愈高,链霉菌属组成愈简单。2148株供试放线菌中,有69株菌对供试靶标菌有拮抗性,其中广谱性拮抗菌很少;有机质含量高的土壤中拮抗性菌株数量多;GA培养基上的拮抗菌多于SDSA培养基上的拮抗菌。3供试放线菌耐盐性较强,这与土壤的全盐量呈显著相关,盐质量浓度在50g/L时,有50%以上的放线菌长势强,盐质量浓度在100g/L时,放线菌长势都较弱;不同培养基上分离的放线菌的耐盐性不同,盐质量浓度为50g/L时,长势强的放线菌大多分离自SDSA培养基上。     

外源营养因子对巴尔喀什蘑菇菌丝的影响

【目的】 研究不同外源营养因子,包括碳源、氮源、培养料、无机盐、维生素和植物生长调节剂,对巴尔喀什蘑菇菌丝生长的影响。【方法】 以新疆野生巴尔喀什蘑菇分离菌株为试材,采用单因素平板实验法进行试验。【结果】 巴尔喀什蘑菇菌丝生长的最佳碳氮源为可溶性淀粉和牛肉膏,培养巴尔喀什蘑菇较为合适的培养料有木屑、棉籽壳发酵料和芦苇基质,无机盐(MnSO₄、FeSO₄、CaCl₂、CaSO₄、CaCO₃),维生素(B1、B2、B6、H、B9、B-h、C),及植物生长调节剂(IAA、NAA、6-BA、6-KT、赤霉素和腐殖酸钠),均可在一定程度上促进巴尔喀什蘑菇菌丝的生长。【结论】 不同外源营养因子对巴尔喀什蘑菇菌丝的生长有不同程度的影响。     

马铃薯疮痂病病原菌的分离鉴定及其生长特性分析

【目的】研究新疆喀什泽普县阿依库勒乡马铃薯疮痂病病原菌的种类及其生长特性。【方法】采用组织分离法结合柯赫氏法则、显微形态和16S rDNA等方法,分离鉴定马铃薯疮痂病病原菌;分析菌株对不同碳源、氮源的利用能力,以及不同pH的生长能力。【结果】新疆泽普马铃薯疮痂病的病原菌为疮痂链霉菌（Streptomyces acidiscabies）,产白色光滑呈自由弯曲状的孢子,能产生黑色素和可溶性色素,可利用葡萄糖等8种碳源和甲硫氨酸（Met）和组氨酸（His）2种氮源,接种健康马铃薯块茎上能产生网纹状甚至凹陷裂口状病斑。【结论】该地区马铃薯疮痂病病原菌最适生长温度为30℃,pH为7,最适碳氮源为葡萄糖和甲硫氨酸,全黑暗利于菌株的生长。     

死海嗜盐耐盐放线菌分离方法研究

【目的】探讨死海高盐地区分离嗜盐耐盐放线菌的最佳方法,为高盐地区放线菌的分离提供理论依据。【方法】采用物理方法（微波）、化学方法（加入孢子活化剂）、富集培养法及3种方法的组合共计9种方法,对死海地区土样进行预处理,然后在3种复合盐含量（150,225,300 g/L）及不同培养基（ISP5、CMKA、HV）条件下,研究复合盐含量及培养基对分离放线菌种类和数量的影响,并筛选嗜盐耐盐放线菌的最佳分离方法。【结果】①在3种培养基上,对土样采用9种方法进行预处理,其中物理+化学方法处理后分离的放线菌种类明显高于其他预处理方法;富集培养法预处理土样分离的放线菌种类明显较少。②不同复合盐条件下,3种培养基分离的放线菌种类和数量表现为CMKA>HV>ISP5。③不同培养基上,3种复合盐条件下分离的放线菌种类总体上表现为300 g/L>225 g/L>150 g/L,分离的放线菌数量总体表现为150 g/L>225 g/L>300 g/L。【结论】比较筛选得到了分离死海高盐地区嗜盐耐盐放线菌的最佳方法,即土样经微波与化学孢子活化剂共同处理后,在含225 g/L复合盐的CMKA培养基上培养。     

金针菇液体培养基优化研究

为了优化金针菇液体培养基。选取影响金针菇生长的4个主要营养因子碳源、氮源、无机盐和维生素进行正交试验,研究了不同碳源、氮源、无机盐和维生素及其不同配比对金针菇菌丝生长的影响,确定了金针菇菌丝生长的最佳培养基。金针菇液体培养的最佳碳源为可溶性淀粉,最佳氮源为黄豆粉,最佳无机盐为KCl,最佳维生素为VB2;最佳培养基配方为3%的可溶性淀粉、4%的黄豆粉、0.15%KCl7、.5 mg/100ml的VB2。该研究为金针菇的工业化生产提供理论依据。     

植物根际放线菌分离方法初探及根皮苷降解活性分析

【目的】研究不同培养基及不同土样处理方法对植物根际放线菌分离效果的影响,并从中挖掘具有开发潜力的高活性根皮苷降解放线菌株,为苹果连作障碍机制研究及微生物修复提供理论和实践指导。【方法】从吉林、河北、山东、陕西、甘肃、河南、湖北、四川、重庆、上海、江西、安徽、浙江等13个省（市）采集植物根际土样40份,自然风干处理后分别经10 mmol/L的MOPS溶液及CaCO3预处理,用涂布平板法在7种不同的培养基中进行放线菌的分离培养。将分离获得的菌株点种于根皮苷筛选培养基进行活性检测。【结果】在7种培养基B、MSC、MG、MT、Chi、HSG、HV中分别分离获得100、78、108、64、79、113和88株放线菌。土样用MOPS溶液处理后所分离得到的放线菌总数明显高于用CaCO3预处理所得。分离所得630株菌株中有29株对根皮苷有降解活性。对其中41株高活性菌株及形态特殊菌株进行16S rRNA基因测序分析,发现分属于14个不同的放线菌属。【结论】7种分离培养基中HSG培养基的分离效果最好,MG培养基次之,MT培养基最差。土样处理中用MOPS溶液处理的方法优于用CaCO3预处理。根际放线菌株中有一定数量具有降解根皮苷能力的菌株。根际放线菌资源具有丰富的生物多样性。     

塔里木盆地北缘土壤放线菌分布多样性分析

选用4种培养基进行涂布平板分离塔里木盆地北缘土壤放线菌样,所分离菌株初步鉴定为6个属,链霉菌是优势菌(占51.2;～100;).在几种不同利用类型的土壤中,耕作土壤中放线菌分布最丰富.典型相关分析得出,放线菌分布多样性主要受土壤总盐含量的影响,随总盐含量的升高而降低,总盐含量与放线菌数量和种类之间呈负相关,结合回归分析得出,在土壤总盐中,Mg2+和Cl-1含量是影响放线菌分布的主要因素;其次,对塔里木盆地北缘土壤放线菌而言,土壤有机质、速效磷及速效氮含量对其分布多样性影响不显著.     

云芝固体培养营养因子的筛选

采用固体培养的方法,研究不同碳源、氮源和无机盐营养因子对云芝菌丝生长的影响,通过观察菌丝密度和计算菌丝生长速度,筛选出最适合云芝菌丝生长的营养因子组合.结果表明:云芝菌丝生长发育的最适碳源、氮源和无机盐分别是:果糖、牛肉粉和MgSO4.     

朽木来源纤维素分解细菌·真菌混合秸秆纤维发酵研究

[目的]为研究朽木生态小环境中各种微生物之间的相互作用和农业废弃秸秆的再利用奠定基础。[方法]利用分离的几株来源于云贵高原地区次生林朽木中具有较高纤维素分解活性的细菌（B2、Q1）、真菌（W9）与放线菌（H1）分别和混合发酵纤维素羧甲基纤维素钠和滤纸等底物,研究碳源种类、培养时间对纤维素分解酶活的影响。[结果]分离的4株菌及混合菌在4种碳源上均能良好生长,其中B2和H1在羧甲基纤维素钠为碳源培养72h的纤维素酶活性最高,分别为61．9U和57．7U;混合菌在各种碳源中发酵活力均较低;混合发酵较不同菌株单独发酵产生还原糖总量略有降低;在以玉米秸秆为唯一碳源的培养基上各种菌的纤维素分解酶活性随培养时间的延长逐渐增加。[结论]混合菌的纤维素分解活性均低于各种菌单独发酵。     

不同生长条件对番茄早疫病菌抗腈菌唑菌株生长的影响

通过改变生长条件,如碳氮源、pH和渗透压等研究其对番茄早疫病菌抗腈菌唑菌株生长的影响。结果表明,与对敏感菌株生长的影响相比,碳氮源、pH和NaC1渗透压的变化对抗性菌株的生长无明显影响,而葡萄糖渗透压的变化对抗性菌株的影响要比对敏感菌株的明显。由此可推断抗性菌株在自然环境中可能会与敏感菌株形成竞争关系,甚至会成为优势种群而影响腈菌唑的药效。