松材线虫杂交探针制备与检测技术

选用松材线虫特异引物对M03F2/R1(Fl:5'-CGGGT CATGG CTGGA GGTAT CGT-3',R1:5'-TCGCT CAATG GCAAA TTCTT CGTA-3'),以Dig-11-dUTP代替部分dTTP,采用PCR技术,直接扩增松材线虫特异片段作为松材线虫地高辛探针.结果表明,地高辛探针长...     

荧光假单孢细菌培养的无细胞滤液导致松萎蔫的病状观察

将松材线虫携带的致病细菌无细胞滤液、无菌松材线虫和致病细菌混合物、致病细菌鞭毛蛋白无细胞滤液、无菌松材线虫、无菌松材线虫和非致病细菌混合物接种黑松导致的松树萎蔫的病状与野生松材线虫导致松树萎蔫的病状进行观察和对比,结果为:(1)经培养的致病荧光假单孢菌GcM5-1A菌株的无细胞滤液、无菌松材线虫和致病细菌GcM5-1A混合物接种导致的黑松的病状变化趋势与松材线虫致死的黑松病状是一致的;无菌松材线虫、无菌松材线虫和非致病细菌AM2C混合物不能使黑松发病;(2)致病细菌GcM5-1A无细胞滤液和野生松材线虫导致的黑松病状和病程天数无显著差异;(3)接种无菌松材线虫和致病细菌GcM5-1A混合物的黑松病程显著长于接种野生松材线虫的黑松.结果可以用松萎蔫病是松材线虫和其携带的细菌的复合侵染病害的假说和松材线虫与其携带的细菌之间的互惠共生关系的论点来解释,说明松材线虫携带的致病细菌无细胞滤液是松萎蔫病致病的真正原因.     

松材线虫BxPrx基因抗H2O2胁迫的转录模式及功能

为探究松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)响应H_2O_2胁迫的分子机制,利用荧光定量PCR测定松材线虫过氧化物还原酶基因BxPrx在不同浓度(2.5、5.0、7.5、10.0mmol/L)H_2O_2胁迫下的转录水平;利用RNA干扰技术,沉默松材线虫BxPrx基因,比较H_2O_2胁迫下BxPrx基因沉默组与非基因沉默组松材线虫存活率的差异。结果显示:松材线虫的存活率与H_2O_2胁迫浓度呈负相关;松材线虫BxPrx在H_2O_2胁迫下的转录水平均提高;在5.0、7.5、10.0 mmol/L H_2O_2胁迫下,经过BxPrx基因沉默处理的松材线虫存活率显著低于对照组。     

松材线虫对其携带的一株致病细菌产毒的影响

该文报道了以黑松细胞为材料的一种改进的细胞荧光染色显微生测法.用该方法测定了接种松材线虫虫体上分离到的荧光假单胞GcM5-1A菌株或该菌株和无菌松材线虫混合物接种后的愈伤组织水提物的毒性.结果表明,单独接种无菌松材线虫或单独接种该菌株后的愈伤组织水提液未表现出毒性;而接种无菌松材线虫与该菌株的混合物后的愈伤组织水提液与接种野生松材线虫后的愈伤组织水提液的毒性以及该菌株的NB培养液的无细胞滤液的毒性均很强,并且它们三者之间没有显著差异.该结果说明松材线虫在寄主组织中能促进细菌的产毒.向该菌株的NB培养液的无细胞滤液中添加松材线虫后测定其毒性,结果表明无菌松材线虫对其毒性并无显著影响.实验结果表明松材线虫本身不产生毒素,在荧光假单胞菌培养液的无细胞滤液中加入无菌松材线虫未能显著改变其毒性.      

松材线虫及携带细菌对黑松复合的侵染

从不同松树上分离松材线虫、拟松材线虫、滑刃线虫和小杆线虫,并从松材线虫和小杆线虫体上分离细菌,将线虫无菌化处理后与从线虫体上分离到的荧光假单胞杆菌、产气肠杆菌混合接种无菌黑松苗和愈伤组织。结果表明,单独接种无菌线虫或细菌不能使黑松致病,无菌松材线虫、无菌拟松材线虫只有与有毒性的荧光假单胞杆菌混合接种时才能使黑松无菌苗和愈伤组织发病,细菌通过线虫携带在树体内传播扩散,使松树致病。研究进一步证明了线虫和细菌在松材线虫病致病过程中起协同作用。     

松木包装板材的伞滑刃线虫种类鉴定

记述了输入福建省的松木包装板材中分离到的松材线虫(Bursaphelenchusxylophilus)和拟松材线虫(B.mucronatus),讨论了松材线虫对福建省林业构成的威胁.     

松树上几种线虫携带细菌的种类与毒性

从不同地区不同松树上采集分离不同种类的线虫,对线虫携带的细菌进行分离鉴定,并用黑松无菌苗及愈伤组织测定细菌的毒性.细菌分离结果表明:松材线虫携带的优势菌为荧光假单胞菌,与其他线虫携带的细菌种类不同.毒性测定结果显示:松材线虫携带的优势菌株毒性最强,拟松材线虫及滑刃属线虫携带的细菌具有一定程度的毒性,小杆线虫携带的细菌没有任何毒性.结果进一步证明了松材线虫携带的细菌在其致病过程中发挥着重要作用.     

松材线虫与拟松材线虫杂交及后代繁殖力

为了探明松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)与拟松材线虫(Bursaphelenchus mucronatus)能否进行种间杂交,收集了不同地理来源的松材线虫和拟松材线虫株系,在实验室内进行了种间杂交、继代培养以及回交。结果显示:中国浙江松材线虫和法国拟松材线虫、中国浙江松材线虫和中国拟松材线虫杂交组合,具有较高的交配率、繁殖量和低死亡率。在继代培养试验中,这2个组合都具有很强的繁殖优势,其杂交后代可以同亲本回交,且更趋于同拟松材线虫回交。总的来说,松材线虫和拟松材线虫有些虫株间是可以杂交并能够顺利繁殖,建立可延续的种群的。推测在自然条件下,松材线虫和拟松材线虫杂交后代是存在的。     

广东马尾松木中线虫种类的调查与鉴定

从广东乳源、封开、广州市郊采到276个马尾松松材线虫病死木样本,共分离鉴定出13种线虫:畸刺伞滑刃线虫(Bursaphelenchus teratospicularis),松材线虫(B.xylophilus)、拟松材线虫(B.mucronatus)、变异伞滑刃线虫(B.aberra-ns)、小角伞滑刃线虫(B.corneolus)、利昂伞滑刃线虫(B.leoni)、湖南伞滑刃线虫(B.hunanensis)、红松滑刃线虫(Aphelenchoides resinosi)、滑刃属线虫(Aphelenchoides sp.)、斯坦纳长尾线虫(Seinura steineri)、小茎线虫(Ditylenchus parvusZell)、剑尾齿杆双胃线虫(Odorhabdiplogaster xiphocaudatus)和寄生小杆属线虫(Parasitorhabditis sp.)。其中畸刺伞滑刃线虫为中国新记录种,畸刺伞滑刃线虫、斯坦纳长尾线虫和小茎线虫为马尾松上的新记录种。     

松材线虫USP基因家族鉴定及生物信息学分析

泛素特异性蛋白酶(USP)作为去泛素化酶的一种，在生物体内细胞发育、信号传递、肿瘤发生和转移及免疫反应等诸多方面发挥着重要功能。通过生物信息学的方法从松材线虫基因组中筛选并鉴定松材线虫USP家族基因19个，通过分析其理化特性、进化发育、蛋白及基因结构及表达模式，为研究USP家族在松材线虫发育中的作用奠定基础。结果表明，松材线虫USP不均匀的分布于6条染色体上；理化性质分析发现松材线虫USP基因家族编码的氨基酸为280～1 384个，分子质量介于31.53～158.94 ku,等电点介于4.77～9.43;基因和蛋白结构分析表明松材线虫USP家族是一个活跃的去泛素化酶家族。根据在不同发育阶段的松材线虫中USP家族表达模式分析发现，松材线虫USP家族对松材线虫胚胎发育和生长过程中具有一定的促进能力。因此，研究松材线虫USP家族的结构和表达模式对解析松材线虫发育趋势具有一定的指导意义，对探索松材线虫防治方法具有参考价值。     

松材线虫两种实用分子检测技术

为检验已开发的SCAR标记与实时PCR两种分子检测方法鉴定松材线虫的可靠性,本文选用线虫未知种样品7个以及已知种样品3个为实验材料,采用上述两种分子检测方法进行检测,并且对7个线虫未知种样品进行形态鉴定。结果表明：1）运用SCAR标记检测,第2、3、4、7号4个未知种样品与8号松材线虫样品出现了一条清晰、明亮的860b...     

几种松树挥发物对松材线虫行为的影响

通过室内生测的方法,研究了几种主要的松树挥发物对松材线虫行为的影响.结果表明,α-异松油烯、β-水芹烯、β-蒎烯抑制松材线虫繁殖,其中α-异松油烯、β-水芹烯抑制力较强,β-蒎烯抑制力较弱,而β-月桂烯、反式-石竹烯、莰烯、异长叶烯和α-蒎烯对线虫繁殖没有影响.β-水芹烯和莰烯具有杀松材线虫活性,β-蒎烯和β-月桂烯增强松材线虫活力,而异长叶烯、α-蒎烯、反式-石竹烯对线虫存活没有影响.β-蒎烯、反式-石竹烯、异长叶烯、莰烯对松材线虫具引诱作用,其中β-蒎烯引诱力最强,反式-石竹烯次之,异长叶烯、莰烯引诱力最弱,而α-蒎烯、β-水芹烯、α-异松油烯和β-月桂烯对线虫无引诱作用.并对几种挥发物在松树抗松材线虫病中的作用进行了讨论.     

万寿菊提取物对松材线虫的毒杀作用

用乙醇提取万寿菊Tagetes erecta的不同部位的粗提物,然后用浸泡生测的方法测定对松材线虫Bursaphelenchus xylophilus的生物活性。结果表明,万寿菊的根、茎、花的乙醇粗提物对松材线虫的活性较强,0.010 g·L^－1质量浓度以上处理72 h后发现,校正死亡率都能达到60%以上,其中万寿菊根的乙醇粗提物的活性最强,校正死亡率超过90%。万寿菊的各部分粗提物的得率都达到5%以上,这为利用植物提取物来毒杀松材线虫提供了初步的理论依据。图1表1参13     

松材线虫体壁物的厚度和糖含量比较

为进一步弄清松材线虫的致病机理,该文对松树上分离的松材线虫、拟松材线虫和小杆线虫的体壁物进行了初步研究。 通过电镜观察和可溶性糖含量分析,发现松材线虫体表有一层很厚的物质,而拟松材线虫和小杆线虫体表比较光滑;松材线虫比其他两种线虫体表有更多的糖类物质。研究同时提出,松材线虫和拟松材线虫体表物质的厚度和糖含量,可能与二者的致病性有密切关系。      

松材线虫和拟松材线虫的PCR快速检测

利用PCR技术对松材线虫Bursaphelenchus xylophilus与拟松材线虫B．mucronatus的rDNA的ITS1区和5．8S区核甘酸序列扩增．根据松材线虫与拟松材线虫的ITS1序列区别,分别设计出松材线虫和拟松材线虫的特异性引物,实现了单条活的或FG(φ为4％的甲醛)固定的松材线虫和拟松材线虫的快速检测．     

树舌荧光多糖的制备及在小鼠脾淋巴细胞中的定位

为确定树舌多糖在小鼠脾淋巴细胞上的定位,应用胺化还原法在树舌多糖(GAP)的还原性末端连接异硫氰酸荧光素(FITC),用荧光分光光度计测定其荧光取代度,xCELLigence RTCA DP全自动实时细胞分析仪检测GAP荧光标记前后生物学稳定性.流式细胞仪检测小鼠脾T淋巴细胞、B淋巴细胞和NK细胞中的GAP荧光强度,荧光显微镜观察GAP在小鼠脾淋巴细胞中的定位.结果显示:在荧光标记GAP (FITC-GAP)前后的细胞毒活性不变,并且其荧光取代率为0.90％;流式细胞仪检测发现小鼠脾T淋巴细胞、B淋巴细胞和NK细胞上的荧光信号强度与FITC-GAP加入量成正相关,荧光显微照片显示GAP定位于小鼠脾淋巴细胞表面并可转运至细胞核.     

松材线虫P糖蛋白在药物代谢过程中的功能研究

  目的  探究松材线虫对药物敏感能力产生的分子机制，为防治松材线虫提供理论基础。  方法  本研究从松材线虫基因组中获得秀丽线虫同源解毒基因Bx-pgp23，并对该基因蛋白编码区进行PCR扩增，随后通过生物信息学对蛋白质Bx-PGP23理化性质、亲疏水性、跨膜区分布、磷酸化位点、二级结构和三级结构进行了分析和预测。并通过RNAi技术对Bx-pgp23进行沉默处理，分析Bx-pgp23沉默与否对松材线虫药物敏感程度的影响。  结果  生物信息预测结果显示PGP蛋白稳定系数为38.31，亲水系数为?0.018，三级结构预测PGP蛋白具有多个氨基酸参与构成α螺旋和β折叠并且具有多个核苷酸结合域和跨膜结构域。应用RNAi技术对Bx-pgp23基因进行基因沉默，沉默后的Bx-pgp23基因表达量变为原来的42.65%。药剂敏感性检测实验结果显示，在1.5和2.5 g/L苦参碱溶液处理24 h后，RNAi组松材线虫死亡率与对照组相比升高了7.2%和6.4%，在1.5和2.5 g/L的苦参碱溶液处理48 h后，RNAi组松材线虫死亡率与对照组相比升高9.0%和7.2%。  结论  蛋白质Bx-PGP23是一种稳定的亲水蛋白，具有跨膜外排功能。成功克隆Bx-pgp23基因并合成了该基因dsRNA。Bx-pgp23基因沉默影响了松材线虫对苦参碱的敏感性，在相同质量浓度的苦参碱胁迫下，RNAi组线虫死亡率明显高于对照组，说明Bx-pgp23基因在松材线虫药物代谢调控中发挥着正向调控作用。      

高效松材线虫病预防注射药剂配制与林间药效研究

为有效防治松材线虫病,采用阿维菌素和甲维盐为主药,吐温等为表面活性剂,复配混合药剂;同时,模制长喙50 m L容积药瓶,组合成适合向松树注输药物的专用注射针剂,在松材线虫病发生林地开展树干注入药剂抗松材线虫病试验。林间抗松材线虫病试验,采用2种方法进行,即树干注入药剂后作人工接种病原松材线虫和自然感染病原松材线虫;同时,用日本专用松材线虫病预防注射剂作对比试验。结果表明,日本药物(A类药)对人工接种病原松材线虫具有75%的预防效果;自配的阿维菌素(C21类药)和甲维盐(C22类药)对人工接种获得50%和100%的预防效果,使自然感染松材线虫病的松树死亡率平降至2.70%;而对照试验的人工接种病线虫的松树死亡率为100%,自然感染松树死亡率为22.36%。结果表明:试验开发的松树注射剂阿维菌素C21和甲维盐C22,能有效预防松树个体的松材线虫病发生与危害。     

基于生态位因子模型的湖北省松材线虫病风险评估

  目的   当前湖北省松材线虫Bursaphelenchus xylophilus疫情形势严峻。通过研究湖北省松材线虫病的入侵风险，分析松材线虫病在湖北省的危害程度，为当前疫情的防治工作提供建议和参考。   方法   结合“3S”技术，应用生态位因子模型(ENFA)，选取影响松材线虫定殖和传播的4类影响因素(气候、植被、地形、人类活动)，对松材线虫病在湖北的入侵风险进行了预测和评价。   结果   湖北省松材线虫病高风险区面积38 884.62 km2，占湖北省总面积的20.92%，高风险区主要集中于海拔较低、人类活动频繁的中部和东部地区，中风险区面积66 501.84 km2，占总面积的35.77%，低风险区面积80 513.54 km2，占总面积的43.31%，中低风险地区主要分布在林地稀少的江汉平原和西部的高海拔山地。松材线虫偏好分布在温度较高，降水丰富，海拔较低，离人类居住点较近且人类活动频繁的针叶林地区。通过交叉验证(cross-validation)对模型的预测进行检验，得到P/E曲线，曲线呈单调递增且Boyce指数很高，说明模型精度很高。   结论   ENFA模型能很好模拟松材线虫病的风险区域，模型结果可为湖北省各县市的松材线虫病防治决策提供参考。图2表3参25