高产纤维素酶的绿色木霉菌种的诱变和筛选(英文)

[目的]诱变和筛选高产纤维素酶的绿色木霉菌种。[方法]利用紫外线对出发菌株进行诱变,经过初筛和发酵检测挑选出高产纤维素酶的菌株。[结果]筛选到高产纤维素酶的绿色木霉K6,酶活是出发菌株的1.39倍。[结论]诱变筛选得到的K6菌株高产纤维素酶,为秸秆纤维素的利用奠定了基础。     

里氏木霉纤维二糖水解酶基因cbh1的分子改造

[目的]用分子改造的方法改造里氏木霉(Trichoderma reesei的纤维二糖水解酶基因cbh1,提高其纤维素酶活力,为工业化生产纤维素酶提供参考.[方法]用DNaseI消化里氏木霉cbh1,回收100 bp左右的片段后用T4 DNA连接酶连接,以连接产物作为模板进行PCR扩增,将PCR改造的cbh1基因转化里氏木霉原生质体,使改造的cbh1基因与里氏木霉原有的cbh1基因发生同源重组.通过比较滤纸酶活力的方法筛选纤维素酶活力提高的突变菌株,在NCBI上比对分析突变菌株的cbh1序列.[结果]经克隆测序获得基因片段大小为637 bp,与里氏木霉同属菌株cbh1基因的相似性在88‰98％,确定为里氏木霉cbh1的基因片段.经DNaseI消化15 min、T4 DNA连接酶连接、经PCR扩增获得改造后的cbh1基因.将改造cbh1基因片段转化里氏木霉原生质体,得到cbh1基因突变体库.从cbh1基因突变体库中筛选获得1株纤维素酶滤纸酶活比出发菌株高1.7518倍的突变菌株E2-1.序列比对分析发现,与出发菌株相比,突变菌株E2-1的cbh1基因有14个碱基发生了突变,其中5个碱基为置换突变,8个碱基为缺失突变,1个碱基为插入突变,分布于cbh1基因的9个位置.[结论]改造后的cbhl因能与里氏木霉的染色体DNA发生同源重组,进而提高突变菌株的纤维素滤纸酶活力.     

高产纤维素酶里氏木霉菌株诱变选育及其发酵条件优化

试验旨在研究高产纤维素酶里氏木霉诱变选育与发酵条件优化。采用常压室温等离子体(ARTP)诱变法处理里氏木霉,获得产纤维素酶高的突变菌,并对其产酶发酵条件进行优化。通过单因素实验研究发酵时间、硫酸铵浓度、微晶纤维素浓度、接种量及搅拌速度等对里氏木霉产酶的影响。在单因素的基础上,通过正交实验对里氏木霉产酶的工艺参数进行优化。结果表明,在诱变时间240 s条件下筛选到1株突变里氏木霉ATR-4,其滤纸酶活(FPU)最高可达2.01 U·mL~(-1)。对突变里氏木霉菌株ATR-4的发酵条件优化,筛选得到最佳产酶培养条件为:发酵时间78 h,硫酸铵浓度1 g·L~(-1),接种量10%,搅拌速度400 r·min~(-1)。在此条件下进行验证实验,最高酶活可达4.57 U·mL~(-1)。本研究结果表明,常压室温等离子体(ARTP)诱变可有效对里氏木霉进行诱变育种,改善其产酶能力。     

里氏木霉纤维素酶水解稻草的研究

[目的]探讨碳氮源对里氏木霉发酵产纤维素酶的影响,以及纤维素酶水解稻草的条件。[方法]通过添加不同的碳源和不同浓度的酵母粉,探讨里氏木霉合适的发酵条件;使用不同添加量的纤维素酶对稻草进行酶解;分别利用纤维素酶、纤维素酶和木聚糖酶混合酶对稻草进行酶解反应。[结果]利用乳糖和稻草的复合碳源和12 g/L的酵母粉进行水解时,纤维素酶活性较高。酶解适宜的酶用量为每克稻草底物200 U的滤纸酶。用纤维素酶及木聚糖酶混合酶酶解稻草96 h的酶解得率为65.4%。[结论]该研究可为里氏木霉纤维素酶生产和酶解稻草的应用提供一定的依据。     

里氏木霉RutC-30产纤维素酶条件优化研究

[目的]优化里氏木霉RutC-30产纤维素酶的液体发酵条件。[方法]以里氏木霉RutC-30为出发菌株,通过单因素试验研究培养基不同氮源(硫酸铵、尿素、蛋白胨)及浓度、不同碳源(纤维素、乳糖、甘油、葡萄糖)及浓度和不同的初始pH(3.0、4.0、5.0、6.0、7.0)对产酶的影响,在此基础上选取氮源、碳源和pH为影响因子采用正交试验探讨里氏木霉RutC-30产纤维素酶的优化条件。[结果]正交试验分析表明,各因素对产酶影响顺序依次为碳源>氮源>pH,里氏木霉RutC-30产纤维素酶的最佳条件是:以1%纤维素为碳源、以0.5%蛋白胨为氮源,初始pH值为4.0,在30℃产酶发酵培养5 d,纤维素酶活力高达7.303 U。[结论]里氏木霉RutC-30经优化培养后,产酶能力可得到大幅度提高,具有潜在的工业应用价值。     

化学诱变选育高产纤维素酶菌株

[目的]研究化学诱变剂对高产纤维素酶生产菌的选育。[方法]以1株绿色木霉(Trichoderma virideF1)为出发菌株,经过亚硝基胍、硫酸二乙酯和氯化锂诱变处理,选育纤维素酶高产菌株生产菌。[结果]经LiCl诱变后,得到1株产酶活力较高的菌株L6,相对酶活较出发菌株提高了35.7%。[结论]化学诱变是诱变微生物、筛选优良菌株的有效手段。     

高产纤维素酶绿色木霉基因工程菌的构建

[目的]构建CBHⅡ基因过量表达的绿色木霉工程菌。[方法]根据绿色木霉cDNA序列设计合成引物,PCR扩增CBHⅡ基因序列,将完整的目的基因与表达载体pCAMBIA1302连接,转入大肠杆菌DH5α中,获得重组质粒pCAMBIA1302-CBHⅠ。再将pCAM-BIA1302-CBHⅠ重组质粒与瑞氏木霉外切葡聚糖纤维二糖水解酶Ⅱ（CBHⅡ）PcbhⅡ启动子片段连接,将潮霉素磷酸转移酶（hyg）基因片段插入PcbhⅡ启动子下游,转入大肠杆菌DH5α中,获得重组表达质粒pCAMBIA1302-CBHⅡ。[结果]构建的重组表达质粒电转化后经SDS-PAGE电泳检测,绿色木霉纤维素酶CBHII基因在原宿主菌中成功过量表达,证实CBHⅡ基因在PcbhⅡ启动子控制下进行高效表达。[结论]为高产纤维素酶系的工业化菌株构建奠定基础。     

里氏木霉外源表达载体的构建（摘要）

[目的]构建里氏木霉外源表达载体。[方法]以里氏木霉40359的CBHI启动子和终止子构建了里氏木霉40359外源表达载体,并用该表达载体成功表达了抗潮霉素B磷酸转移酶基因,得到6株可在含175mg/L潮霉素的基础培养基上生长的抗性菌株;提取6株抗性菌株的DNA整合到里氏木霉菌株中,并对其进行潮霉素耐受性检测。[结果]6株抗性菌株的抗潮霉素能力比原始菌株提高了75%;转基因菌株的潮霉素抗性可以稳定遗传,证明表达载体构建成功。[结论]为开展里氏木霉分子生物学研究与遗传改造奠定了基础。     

里氏木霉外源表达载体的构建

[目的]构建里氏木霉外源表达载体。[方法]以里氏木霉40359的CBHI启动子和终止子构建了里氏木霉40359外源表达载体,并用该表达载体成功表达了抗潮霉素B磷酸转移酶基因,得到6株可在含175 mg/L潮霉素的基础培养基上生长的抗性菌株;提取6株抗性菌株的DNA整合到里氏木霉菌株中,并对其进行潮霉素耐受性检测。[结果]6株抗性菌株的抗潮霉素能力比原始菌株提高了75%;转基因菌株的潮霉素抗性可以稳定遗传,证明表达载体构建成功。[结论]为开展里氏木霉分子生物学研究与遗传改造奠定了基础。     

基于全基因组序列预测里氏木霉QM6a的分泌蛋白

里氏木霉(Trichoderma reesei)QM6a为重要的产纤维素酶工业生产菌株,为明确其内存在的分泌蛋白,对该菌分泌蛋白进行预测,并明确其特征。利用SignalP、ProtComp等5个软件对该菌中9 143条蛋白质序列进行分泌蛋白预测,并对上述分泌蛋白的氨基酸大小分布情况、信号肽长度及其切割位点等性质进行分析。里氏木霉中含有分泌蛋白356个,其氨基酸长度、信号肽长度与其他植物病原菌不同;信号肽切割位点属于A-X-A类型,与其他已经报道的植物病原真菌、细菌以及卵菌中分泌蛋白信号肽切割位点一致。通过上述生物信息学分析方法有效地实现了里氏木霉分泌蛋白的预测,也证明了分泌蛋白的信号肽切割位点具有物种保守性特点。     

红酵母系统发育及番茄红素的测定

[目的]介绍了红酵母分离纯化的方法,菌株系统发育分析及发酵产物番茄红素的测定。[方法]从土壤及落花样品中分离纯化出7株红酵母,对其进行18S rDNA序列分析,并用高效液相色谱法对7株野生菌株的胞内色素产物进行了初步分析鉴定。[结果]18SrDNA序列分析可初步鉴定这7株菌分别属于红冬孢酵母菌属和红酵母属。用高效液相色谱测定7株菌种胞内抽提物中的番茄红素含量,发现仅有菌株06944的胞内抽提物中含有番茄红素。将菌株06944发酵产番茄红素的HPLC图谱与番茄红素标准品的对比,可初步鉴定所筛出的菌株06944产番茄红素,产量为2.96μg/ml。[结论]菌株06944为红冬孢酵母属,无致病性,可直接作为工业生产菌种。     

压砂甜瓜白粉病病原菌18S rDNA序列分析

[目的]测定并分析压砂甜瓜白粉病病原菌的18S rDNA序列。[方法]从宁夏中部干旱带压砂甜瓜主栽品种＂玉金香＂发病植株上分离白粉病病原菌,采用Chelex-100法从其分生孢子中提取基因组DNA,PCR扩增18S rDNA序列,测序后进行Blast分析比对,并构建系统发育树。[结果]18S rDNA序列分析表明压砂甜瓜白粉病病原菌属单囊壳属（Podosphaera）。[结论]为生物防治压砂甜瓜白粉病和抗白粉病育种研究提供了参考。     

一株氮磷营养素降解菌的筛选和鉴定

[目的]筛选能够高效降解氮和磷营养素的菌株。[方法]以尿素为唯一氮源,以STTP为唯一的磷源,配制氮磷选择性培养基,对生活污水和一些工业废水中的微生物进行分离培养和筛选,采用显微镜观察技术和分子生物学技术相结合对筛选出的菌株进行了鉴定。[结果]通过分离和筛选,从生活污水和工业废水中得到了一株能够利用STTP和尿素作为能源的菌株lyh6A。该菌株在较高浓度尿素(4.00 mg/ml)和STTP(0.50 mg/ml)选择性培养基上生长良好。根据菌落的形态、菌株显微形态及18S rDNA序列同源比较结果,确定所筛选出的菌株lyh6A与曲霉属杂色曲霉等亲缘关系较近,18S rDNA序列相似性达到99%以上。[结论]该研究将为利用微生物进行氮、磷富营养化污染水体的治理提供基础。     

小菇一种Mycena sp.的DNA提取及测序

[目的]为新野生真菌小菇一种Mycenasp.的分类提供依据。[方法]采集到一种新的野生真菌,经形态学观察初步确定为小菇一种Mycenasp.。对该真菌进行了DNA提取、18SrDNA的PCR扩增与产物回收、琼脂糖凝胶电泳检测和测序等一系列分子生物学研究,对其基因序列进行了Blast比对和同源性数据检索。[结果]利用通用引物进行18SrDNA的PCR扩增,可获得约1.8 kb的扩增片段。通过序列分析,对回收后的产物进行鉴定,确定其为18SrDNA基因序列。通过对小菇一种Mycenasp.的18SrDNA基因序列进行Blast比对和同源性数据检索,发现其与白蘑属、毛伞属和脐伞属的亲缘关系最近。[结论]可推测该野生真菌为担子菌亚门、层菌纲、伞菌目、白蘑科一种,并结合其形态特征,暂时确定为小菇一种Mycenasp.。     

1株猪链球菌的分离·鉴定及其毒力因子研究

[目的]对1株疑似猪链球菌菌株进行鉴定,为进一步研究猪链球菌的毒力提供理论基础。[方法]采用革兰氏染色镜检、形态观察和16S rDNA测序后NCBI数据库Blast比对鉴定菌株;另外选取猪链球菌7种主要毒力因子设计引物,利用PCR方法检测其毒力基因分布情况。[结果]显微镜下该疑似菌株为革兰氏阳性菌,多数呈链状,少见单个排列。16S rDNA测序结果与猪链球菌2型同源性达到99%。毒力因子检测均含有7种毒力因子。[结论]该疑似菌株为猪链球菌2型,其毒力基因型为：gdh＋/ef＋/mrp＋/sly＋/fbps＋/orf2＋/cps2J＋/。     

春兰内生拮抗细菌gt19-1的鉴定及对辣椒胶孢炭疽菌的防效

[目的]鉴定春兰(Cymbidium goeringii)内生拮抗细菌gt19-1并研究其防效。[方法]从春兰内生细菌中筛选到一株可拮抗胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides Penz)的菌株gt19-1,对其进行了形态鉴定、生理生化鉴定及16S rDNA序列测定,并通过温室盆栽生防试验研究了其对辣椒炭疽菌的防治效果。[结果]菌株gt19-1为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis),16S rDNA序列相似度达100%。菌株gt19-1发酵液对胶孢炭疽菌导致的辣椒炭疽病有一定抑制作用,防效达到22%。[结论]为辣椒炭疽病的生物防治奠定了基础。     

玉米秸秆还田土壤中纤维素分解菌的分离筛选和鉴定（摘要）

[目的]从玉米秸杆还田土壤中分离筛选出酶活力较高的纤维素分解苗。[方法]通过CMC固体培养初筛和摇床培养复筛从玉米秸秆还田土壤中筛选出纤维素酶活力较高的菌株,并对其进行16rDNA序列分析。[结果]通过初筛和复筛获得了内切酶活力较高的1株细菌和1株真菌,滤纸酶活力较高的1株真菌和2种酶活均较高的1株细菌（5号菌株）。16SrDNA序列分析结果表明,5号菌株与Bacillus subtilis的相似性达到100%。[结论]5号菌株鉴定为枯草芽炮杆菌     

木霉菌Tr10的鉴定及其对几种病原菌的抑制作用

[目的]鉴定木霉菌Tr10,并研究其对几种病原菌的抑制作用。[方法]在形态分类的基础上,结合分子鉴定手段（rDNA-ITS序列分析）,对木霉菌Tr10进行分类鉴定,并研究其对作物病原菌的拮抗作用。[结果]依据Tr10的培养性状和显微特征描述,初步鉴定该菌株为棘孢木霉。结合ITS序列分析可知,Tr10应该归为棘孢木霉。木霉菌Tr10对供试病原菌均有强烈的抑制作用。[结论]为今后在生产上应用木霉菌Tr10奠定基础。