水稻纤维素合酶多克隆抗体的制备和鉴定

纤维素合酶是参与纤维素β-1,4-葡聚糖链延伸的主要催化亚基,为进一步研究水稻中纤维素合酶的作用机理,采用DNA重组技术,将纤维素合酶基因CesA1、CesA2、CesA3克隆入表达载体pGEX-4T-3,构建重组质粒.在大肠杆菌JM109中,经异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导后在原核细胞中成功表达了3种纤维素合酶的...     

拟南芥纤维素合酶的抗体制备与检测

将拟南芥CesA家族基因的高变区克隆到融合表达载体pGEX-4T-3中,构建重组质粒pGEX-AtCe-sAs,在大肠杆菌JM109中经IPTG诱导表达谷胱甘肽巯基转移酶融合蛋白(GST-AtCESAs)。采用GST亲和层析法纯化GST-AtCESAs并制备了多克隆抗体。Western-blotting检测表明,抗体Anti-CESA4和Anti-CE-SA7存在明显的交叉反应,Anti-CESA1、Anti-CESA3、Anti-CESA6、Anti-CESA2、Anti-CESA5、Anti-CESA8均能在拟南芥原生质膜上检测到特异免疫条带,这为进一步深入研究拟南芥纤维素合成机制提供了有利条件。     

拟南芥和水稻CesA基因家族的生物信息学分析

以拟南芥和水稻21个纤维素合成酶基因(CesA)为研究对象,对其基因结构、保守结构域、蛋白质跨膜结构、亚细胞定位、基因表达等进行综合分析。结果显示,Ces A基因长度在3.5~6.5 kb,有7~13个内含子(OsCesA10除外)。Ces A基因编码的蛋白质保守性较强,含有该基因家族的保守结构域Ring finger(OsCesA10、OsCesA11除外)和Cellulose synthase。水稻和拟南芥的CesA蛋白跨膜螺旋数量为6个或8个(OsCesA10除外)。蛋白质亚细胞定位结果表明,21条Ces A蛋白全部定位在质膜上。大部分At Ces A基因在植株的幼根、幼叶和愈伤组织中均有表达,而大部分OsCesA基因仅在幼根或幼叶中表达。     

小黑麦天冬酰胺合成酶基因表达载体构建及功能验证

[目的]对所克隆的小黑麦天冬酰胺合成酶基因(TriAS)的功能进行验证.[方法]构建TriAS-PZP植物表达载体,并通过沾花法侵染拟南芥.在盐胁迫条件下对转基因拟南芥种子萌发情况进行调查,并测定其幼苗中丙二醛含量和SOD酶活性.[结果]构建了TriAS-PZP植物表达载体,将TriAS基因已整合入拟南芥基因组中,并能够在拟南芥中稳定遗传.转TriAS基因拟南芥在盐胁迫条件下萌发率、幼苗根长增长速度均较野生型高,且丙二醛含量和SOD酶活性却均低于野生型.[结论]构建了所克隆基因TriAS的过量植物表达载体,证明所克隆的小黑麦天冬酰胺合成酶基因促进了拟南芥耐盐性能的提高,表明该基因具有增强植物耐盐性的功能.     

棉花GH9家族的全基因组鉴定与分析

糖苷水解酶GH9基因家族在纤维素的生物合成、修饰以及器官脱落和果实成熟过程中发挥着重要的作用。利用生物信息学的方法对棉花GH9基因家族进行了分析,结果发现,棉花与同属于双子叶的拟南芥GH9基因家族亲缘关系最近;棉花、水稻、拟南芥及杨树等物种的GH9跨膜结构域均具有一段保守的跨膜基序;GH9C具有保守的CBM_49纤维素结合结构域。通过对棉花GH9基因共表达分析发现,A亚类基因在叶片以及开花20 d后的纤维中表达量较高,B亚类基因在各个组织中均有表达,C亚类基因在叶片、茎、开花10 d后的纤维以及柱头中表达量较高。研究可为深入解析棉花GH9家族成员的功能及作用机制奠定基础。     

玉米CesA家族的系统鉴定及功能研究

【目的】系统鉴定玉米纤维素合成酶(CesA)家族成员,明确其进化关系及基因功能。【方法】采用系统生物学方法,在全基因组水平上对玉米CesA家族成员进行鉴定,进一步结合基因结构变化对CesA家族成员的进化关系进行系统阐述;通过RNA测序和核糖体图谱,系统分析玉米CesA家族成员响应干旱胁迫的表达模式,并从基因复制角度分析该家族基因的扩增方式,同时基于构建的转录调控网络,对玉米CesA基因的功能进行初步探索。【结果】鉴定出16个玉米CesA家族成员,分为7个子家族,其中有3个是新发现的成员;CesA家族成员在玉米发育过程中对干旱胁迫的响应有明显的组织特异性和发育时期特异性,干旱胁迫对玉米种子发育过程的影响较对植株生长过程的影响大;CesA家族成员在合成纤维素过程中相互协同作用,成员间存在功能冗余。【结论】系统鉴定出了16个玉米CesA家族成员,进一步明确了其彼此之间的功能协作及其在种子发育和植株生长过程中对干旱胁迫的响应程度。     

玉米CesA家族的系统鉴定及功能研究

【目的】系统鉴定玉米纤维素合成酶（CesA）家族成员，明确其进化关系及基因功能。【方法】采用系统生物学方法，在全基因组水平上对玉米CesA家族成员进行鉴定,进一步结合基因结构变化对CesA家族成员的进化关系进行系统阐述；通过RNA测序和核糖体图谱，系统分析玉米CesA家族成员响应干旱胁迫的表达模式，并从基因复制角度分析该家族基因的扩增方式，同时基于构建的转录调控网络，对玉米CesA基因的功能进行初步探索。【结果】鉴定出16个玉米CesA家族成员，分为7个子家族，其中有3个是新发现的成员；CesA家族成员在玉米发育过程中对干旱胁迫的响应有明显的组织特异性和发育时期特异性，干旱胁迫对玉米种子发育过程的影响较对植株生长过程的影响大；CesA家族成员在合成纤维素过程中相互协同作用，成员间存在功能冗余。【结论】系统鉴定出了16个玉米CesA家族成员，进一步明确了其彼此之间的功能协作及其在种子发育和植株生长过程中对干旱胁迫的响应程度。     

杉木纤维素合成酶类似蛋白基因ClCslD1的克隆及其生物信息学分析

纤维素合成酶类似蛋白(CSL)作为一种重要的膜蛋白与纤维素合成酶具有相类似的蛋白结构,都含有D,D,D,QXXRW保守区.利用其他物种中的CesA基因的保守序列设计简并引物,采用反转录-聚合酶链式反应(RTPCR)结合cDNA末端快速扩增技术(RACE)成功地从杉木Cunninghamia lanceolata中扩增出一个含有完整阅读框架的cDNA序列,长度为4 150 bp,开放阅读框架为3 396 bp,编码1 132个氨基酸并含有保守的D,D,D,QXXRW天冬氨酸残基序列.应用美国国家生物技术信息中心(NCBI)数据库对获得的基因进行序列分析比对,发现它属于CslD基因家族,命名为ClCslD1基因.多重序列比对结果分析表明,该蛋白与来自颤杨Populus tremuloides,水稻Oryza sativa,拟南芥Arabidopsis thaliana等的同源基因相似性高达71％以上.利用生物软件对其进行生物学分析,为进一步研究其在植物纤化中的功能奠定基础.     

绿竹与毛竹纤维素合成酶(CesA)的生物信息学分析

纤维素是竹细胞壁的主要组成成份,其存在形式--小微纤丝是由纤维素合成酶(CesA)催化作用得到的36根β-1,4糖苷链结晶而成.以GeneBank数据库中已登陆的完整竹类蛋白序列为分析对象,对其进行系统进化、物理性质、跨膜结构和二级结构的生物信息学分析.结果表明:(1)绿竹和毛竹CesA与水稻CesA具有较高同源性;(...     

次生壁加厚过程中影响棉纤维素合成的主要生理机制

笔者结合国内外对于棉纤维发育过程中纤维细胞内部生理生化反应的最新研究成果,依据棉花纤维比强度形成机制,综述了棉纤维比强度形成的关键时期次生壁加厚期,纤维素生物合成的物质变化、参与调控其合成的酶系(纤维素合成酶,蔗糖合成酶,β-1,3-葡聚糖合酶,β-1,3-葡聚糖酶,吲哚乙酸氧化酶和过氧化物酶)及影响合成的主要因素(基因型,温度,激素)等方面的研究进展.为探索改善棉纤维比强度的生理调控途径和培育高纤维强度的棉花品种提供了理论依据.     

杉木纤维素合成酶类似蛋白基因ClCslD1的克隆及其生物信息学分析

纤维素合成酶类似蛋白（CSL）作为一种重要的膜蛋白与纤维素合成酶具有相类似的蛋白结构,都含有D,D,D,QXXRW保守区。利用其他物种中的CesA基因的保守序列设计简并引物,采用反转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）结合cDNA末端快速扩增技术（RACE）成功地从杉木Cunninghamia lanceolata中扩增出一个含有完整阅读框架的cDNA序列,长度为4 150 bp,开放阅读框架为3 396 bp,编码1 132个氨基酸并含有保守的D,D,D,QXXRW天冬氨酸残基序列。应用美国国家生物技术信息中心（NCBI）数据库对获得的基因进行序列分析比对,发现它属于CslD基因家族,命名为ClCslD1基因。多重序列比对结果分析表明,该蛋白与来自颤杨Populus tremuloides,水稻Oryza sativa,拟南芥Arabidopsis thaliana等的同源基因相似性高达71%以上。利用生物软件对其进行生物学分析,为进一步研究其在植物纤化中的功能奠定基础。图5参10     

干旱和光联合胁迫对长春花CesA基因和Pme基因表达的影响

以长春花叶片为材料,通过同源序列扩增法,获得与细胞壁合成相关的纤维素合成酶(Cellulose synthase,CesA)基因和与细胞壁重要组成部分果胶的变化密切相关的果胶酯酶(Pectin methylesterase,Pme)基因,利用定量的RT-PCR,对干旱和光联合胁迫下CesA基因和Pme基因的表达情况进行了研究。结果表明:干旱胁迫条件下,CesA基因表达稍有减弱,Pme基因表达稍有增强。光胁迫条件下,CesA基因表达明显弱于正常光条件,呈逐渐减弱趋势,CesA基因表达与光胁迫的关系为负调控;而Pme基因表达则明显强于正常光条件,呈现增强趋势,Pme基因表达与光胁迫的关系为正调控。说明光胁迫是CesA基因和Pme基因表达变化的主要影响因素。在干旱和光联合胁迫下,CesA基因表达整体减弱,Pme基因表达整体较强。     

大青杨纤维素合成酶PuCesA6基因cDNA的克隆及序列分析

以大青杨总RNA为模板,通过反转录PCR获得纤维素合成酶PuCesA6基因的全长cDNA序列。序列分析结果表明：其cDNA序列全长3778bp,开放读码框序列3264bp,共编码1087个氨基酸。PuCesA6基因编码的氨基酸序列具备被子植物纤维素合酶基因的特征：锌指结构域、高变区I（HVR—I）、高变区II（HVR—II）与β-糖苷转移酶有关的保守结构域以及8个跨膜区。通过多氨基酸序列比对发现,与光皮桦B1CesA5相似度最高,为89％;其次是玉米ZmCesA8,相似度为80％,且8类CesA的锌指结构与c末端氨基酸序列高度保守。34种CesA蛋白序列的分子进化分析表明,大青杨PuCesA6蛋白与欧洲颤杨PtrCesA6蛋白亲缘关系最近,相似度达99％;和光皮桦BICe．sA5、大桉EgCesA6蛋白同聚为一类。     

亚麻纤维素合酶超基因家族的生物信息学及表达分析

【目的】全基因组水平鉴定亚麻纤维素合酶超家族基因Ces A/Csls,并对基因的进化、基因结构及组织表达特性等进行分析,为亚麻纤维发育的机理研究奠定基础。【方法】利用Phytozome基因组数据库,通过生物信息学手段,鉴定亚麻纤维素合酶超基因家族成员,并进行蛋白理化特性分析;利用MEGA 5.0、GSDS、MEME等软件构建系统进化树,并进行基因结构、蛋白保守基序分析;根据RNA-Seq数据对Ces A/Csls进行表达分析。【结果】系统分析鉴定了45个亚麻Ces A/Csls超家族基因,该家族基因在scaffolds上是分散分布的,没有明显的成簇现象。Ces A/Csls蛋白主要分布于质膜上,氨基酸数目为409—1 167,分子量为47 401.1—130 578.3,等电点分布在5.43—9.08。Ces A/Csl蛋白均含有跨膜结构域,数目为2—8。根据系统进化分析将其分成Ces A与Csl两类,细分为Ces A、Csl A、Csl B、Csl C、Csl D、Csl E、Csl G共7组。基因结构分析显示,亚麻Ces A/Csls基因的长度在2.1—6.8 kb,外显子数量在2—14。保守基序分析表明,不同组间Motif组成有一定的差异,Motif 1、Motif 2、Motif 3、Motif 4、Motif 12在Ces A、Csl B、Csl D、Csl E、Csl G组蛋白中均有分布,Motif 18、Motif 20在Csl A、Csl C组蛋白中均有分布,而Motif 13、Motif 14、Motif 15、Motif 19的分布则表现出一定的组间特异性。表达谱分析结果表明,Ces A/Csls家族成员在不同发育阶段表达模式不同,部分Ces A/Csls可被Na Cl、BR和Brz诱导上调或下调表达,预示Ces A/Csls功能的多样性以及在植物发育过程中扮演着不同角色。【结论】鉴定出45个亚麻Ces A/Csls家族基因成员,分属于两类,7组,分布于scaffolds上,基因结构和蛋白基序具有组间多样性和组内保守性。不同的基因在不同发育阶段具有一定的时空特异性。Ces A/Csls中部分基因响应激素BR、Brz及Na Cl胁迫。     

陆地棉细胞色素P450超家族基因GhCYP85A2-1的克隆与功能分析

【目的】研究细胞色素P450超家族CYP85A亚家族基因在棉花株高发育中的生物学功能,为陆地棉株高分子育种提供理论依据和基因资源。【方法】 采用同源克隆方法,从陆地棉中克隆CYP85A家族基因GhCYP85A2-1,利用烟草脆裂病毒(Tobacco rattle virus, TRV)诱导的基因沉默技术(Virus-induced gene silencing, VIGS)构建GhCYP85A2-1基因沉默载体,利用qRT-PCR技术检测侵染棉花幼苗的基因表达量。【结果】 GhCYP85A2-1基因沉默植株的株高显著降低,基因的表达量也显著下降。【结论】 GhCYP85A2-1基因在棉花株高发育过程中起到重要调控作用。     

棉花蔗糖合成酶3基因第1个内含子在基因表达中的作用

为了研究棉花SUS3基因编码区的第1个内含子在基因表达调控中的作用,分离该内含子并将其插入到GUS基因编码区中构建载体Susfig::121,将载体Susfig::121通过农杆菌介导转入拟南芥.对转基因拟南芥进行GUS活性分析,发现该内含子对GUS基因在拟南芥中的表达具有负调控作用,并且特异抑制报告基因在花粉中表达....     

棉花纤维品质改良相关基因研究进展

棉纤维是优良的、使用最为广泛的天然纤维。随着人们生活水平的提高,对天然纯棉织物的需求不断增加,同时对品质的要求也愈来愈高。因此,提高棉纤维产量和品质成为当前棉花遗传育种的重要目标,对棉纤维发育相关基因的克隆与功能研究是实现这一目标的重要基础。棉纤维发育由4个明显但又重叠的时期组成,包括纤维细胞的起始、伸长(初生壁合成)、次生壁合成和脱水成熟。起始是影响纤维细胞数量的重要时期,而纤维长度和强度的决定发生在次生壁合成期和脱水成熟期。棉纤维发育是一个复杂而有序的过程,由大量的基因参与调控。目前,已经有一些在棉纤维发育过程中发挥重要作用的基因被报道,包括各种转录因子、参与激素代谢基因、编码细胞壁蛋白和细胞骨架蛋白基因、活性氧代谢相关基因、以及参与糖和脂类代谢的基因等。文中对已报道的这些与棉花纤维发育相关基因的克隆和功能分析进行了系统总结,以期为棉花纤维发育及品质改良研究提供参考。     

不同棉花品种纤维比强度形成的温度敏感性差异机理研究

 【目的】研究纤维比强度形成存在温度敏感性差异的2个棉花品种纤维发育生理特性对低温的响应差异。【方法】选用纤维比强度形成存在温度敏感性差异的2个品种（科棉1号：温度弱敏感型品种,苏棉15：温度敏感型品种）,通过分期播种,使相同果枝部位棉铃发育处于不同的温度条件,研究低温对棉花纤维发育相关物质含量和酶活性的影响。【结果】正常播期条件下,棉纤维发育期日均最低温为24.0和25.4℃,棉纤维中蔗糖合成酶活性高,β-1,3-葡聚糖酶活性低,蔗糖转化率和纤维素含量均较高,最终纤维比强度最高;晚播所致的低温（棉纤维发育期日均最低温低于21.1℃）则显著影响棉纤维发育,蔗糖转化率、纤维素含量、β-1,3-葡聚糖含量均下降,纤维发育相关酶活性中蔗糖合成酶活性下降、β-1,3-葡聚糖酶活性上升,导致纤维比强度降低。2个纤维比强度形成存在温度敏感性差异的棉花品种纤维发育生理特性对低温的响应存在差异,温度敏感型品种（苏棉15）的蔗糖转化率、纤维素含量及酶活性（蔗糖合成酶、β-1,3-葡聚糖酶）在因播期形成的不同温度间的变化幅度明显大于温度弱敏感型品种（科棉1号）。【结论】低于21.1℃的日均最低温影响棉纤维发育及纤维比强度形成,不同棉花品种纤维发育相关的物质含量、酶活性对低温的响应存在差异,这可能是导致纤维比强度存在温度敏感性差异的主要原因之一。